生于正常化荧光整个心脏成像的光学投影层析成像
June 2nd, 2009
我们建议一个光学投影层析成像出生的规范化方法（BnOPT），占成像样品的吸收性能，以获得准确，定量荧光断层重建。我们利用该算法重建的荧光分子探针分布在小动物内脏。
为了进行归一化 born 光学投影断层扫描，首先将样品固定并嵌入螺旋钻圆柱体中。然后沿垂直轴旋转样品，然后用激发波长均匀照射，并使用适合 C、CD 的光学元件测量透射率。在透射模式下测量波长处的荧光信号。
获取的荧光和吸收图像用于确定归一化的 born 比率并重建样品中荧光 4 的分布。大家好，我叫 Claudia Naone，在哈佛医学院麻省总医院系统生物学中心工作。我是来自慕尼黑工业大学生物与医学成像研究所和慕尼黑 Al 中心的 Danielle Raki。
我是 Giselle Fido。我是哈佛医学院麻省总医院 C-M-I-C-S-B 实验 su Co 的主任。今天，我们将向您展示一种使用 Born 归一化方法进行光学投影断层扫描的实时离体全器官成像程序。
我们在实验室中使用该程序来研究中空器官中的荧光分子探针分布。那么让我们开始吧。该视频将解释使用光学投影断层扫描对准备好的组织或器官进行成像的程序以及随附的视频。
我们解释了如何使用该系统对发育中的果蝇进行延时成像。光学投影断层扫描的三维成像技术需要光学元件和旋转载物台的独特组合。在视频的这一部分，将阐明成像过程。
首先，主光源用作照明和吸收测量的光源，为了为荧光测量提供荧光激发，首先用窄带通干涉滤光片过滤主光源。接下来，光线通过一组固定和可变的中性密度滤光片。这些与自动快门相结合，以控制样品上的光量并保持足够低以防止任何照片漂白。
通过使用扩束镜和带有扩散透镜的组合式格兰望远镜透镜，可以实现均匀的样品照明。最后，使用光学窄带通干涉滤光片对激发源光进行光学清洁。将样品浸入透明溶液中，并保持在玻璃管内进行成像。
样品通过高速旋转台沿其垂直轴旋转，绝对精度为 0.05 度。三个不同的手动控制器允许在其正交平面上倾斜和调整样品垂直轴。吸收信号是在透射照明中采集的，并由 CCD 相机直接检测。
荧光信号通过窄带通干涉滤光片与长通滤光片耦合滤波，然后用远心镜头收集。长焦镜头的优势在于提供独特的功能，使其成为理想的选择。用于光学投影断层扫描。
位于镜头组件内镜头焦点处的孔径光阑是关键。它确保图像将平行于光轴传播。这消除了透视失真，并在远心深度内的多个焦平面上提供相等的放大倍率。
下一个视频片段介绍了一种制备样品的技术。接下来是用于成像的方法。用于断层成像的样品组织或器官制备依赖于基于乙醇的样品脱水，以避免不对称收缩。
此过程需要很多天才能完成。在本视频中，准备了小鼠心脏，但该方案可以应用于任何组织或器官。我们将使用患有受控梗塞的动物的心脏来演示我们的荧光成像方法。
换句话说，血液供应的丧失提前导致明显的组织坏死。小鼠自六 80 年以来一直注射 pro 荧光传感器报告组织蛋白酶在愈合中的活性。心肌使用腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉小鼠进行灌注和心脏挤压，然后在腹膜内注射 50 单位的肝素以防止凝血。
五分钟后，对完全麻醉的动物进行纵向剖腹手术以去除血液。首先，打开左肾静脉。现在将 20 毫升盐水溶液缓慢注入下腔静脉。
生理盐水在解剖显微镜下冲洗掉所有血液后置换血液。继续使用标准手术方法打开胸腔并取出心脏。现在，在 4 摄氏度的 4% PFA 中固定心脏 8 小时。
从这时起，组织制备步骤必须在黑暗中进行，以避免涂在组织上的任何荧光造影剂或蛋白质漂白。固定完成后，用 PBS 冲洗 15 分钟洗去 PFA，然后将清理后的心脏嵌入 0.8%aros 的池中。一旦 aros 干燥，琼脂糖就会在组织周围被切掉，形成块状。
接下来，通过五个步骤使 aros 加密的心脏脱水，首先浸泡在 20% 乙醇中，然后逐渐提高乙醇浓度，最后是纯乙醇。这种脱水程序有助于避免样品的任何不对称收缩。在稀释乙醇中进行前四次浸泡必须进行一小时，最后一次在 100% 乙醇中浸泡必须进行至少 10 小时。
乙醇处理完成后，将样品放入 Murray 透明溶液中，直到样品澄清，时间从几小时到几天不等。这种透明溶液模拟细胞水和指数匹配细胞膜，从而使组织透明。在透明化过程结束时可能存在微量乙醇，由于透明化溶液本身内酒精的热运动，在重建过程中会产生一些伪影。
为了避免此问题，建议使用第二个清除周期。这不应超过 4 小时。完成后，样品即可进行光学投影。
在计算机的帮助下进行断层扫描。在没有光散射的情况下，可以使用常见的滤波氡背投影算法获得光吸收的重建。这个过程类似于二维 X 射线计算机断层扫描。
将 aeros 块放入装有透明溶液的透明成像室中。现在将腔室安装在载物台上，用整理光束照亮样品，以进行激发和透射测量。激发源的选择基于所选的荧光蛋白或分子成像造影剂。
将样品的垂直轴平行于 CCD 的像素列对齐非常方便。使用一度的角度增量将样品旋转 360 次投影，在透射照明中以吸收和荧光波长的每个角度获取图像。运行采集的软件会自动控制主光源上的快门，以避免连续照明并减少样品照片漂白。
当需要较长的积分时间才能从吸收数据创建 3D 重建时，快门尤为重要。只需使用过滤后的氡背投影算法即可从荧光图像进行 3D 重建。必须考虑其他吸收贡献，这些贡献将在下一个视频片段中描述。
完成吸收重建所需的步骤后，还有几个步骤可以完成荧光重建。在没有光散射的情况下，可以使用常见的滤波氡背投影算法获得光学图的重建。该过程类似于二维 X 射线计算机断层扫描。
当重建荧光分布时。不同的空间依赖性吸收使得反向氡的使用不正确，投射荧光图像严重影响获得的荧光蛋白或荧光分子探针分布及其定量能力。从任意源位置 Xs 发射的激发波长 Lambda X 的每条光线在穿过成像物体时都会呈指数衰减。
激发后，位于位置 X 的荧光染料、发射波长处的辐射被位于 XD 位置的 CCD 像素过滤并收集，使用 Teleric 成像镜头系统。尽管发射的荧光与激发射线的路径不同，但在每个像素处记录的强度近似于沿对应于该特定激发射线的整个聚焦区激发的所有荧光染料的投影。由于系统的高远心度，成像物体随后旋转 360 度，并使用 CCD 相机获取多源探测器测量、激发波长的 UX 和发射波长的 UFL。
然后在定义为两者之比的归一化出生场 UB 下将它们组合在一起。通过编写用于激发光和发射光传播的正演模型，可以促进荧光铬分布的重建，即描述激发的 greens 函数。射线传播遵循一个简单的比尔兰伯定律，其中 moo A 是先前确定的光吸收分布。
从光源发射的光强度 UX 在位置过剩处由探测器在 C.C、D 上的位置 XD 处测量，可以写为绿色函数与常数 B 的乘积，该常数与系统相关。然后可以计算出激发光强度 GX 沿每条光线路径的精确分布。在探测器 XD 上检测到的荧光强度 UFL 受到光源 Xs 发出的光的刺激，考虑了沿从 X 到 xd 的光线路径激发的所有 theros 的贡献。
然后，我们的成像问题的正向模型可以写成 ub ub，其中 alpha 包含与系统相关的未知常数。然后在假设的网格上离散化正演模型，并进行反转以提取荧光染料分布，获取透射和荧光信号，并使用传统的反向投影算法重建样品。这里显示了透射和常规荧光光学投影断层扫描重建。
心脏单平面的重建表现为吸收和荧光。提出了归一化的 born 重建，它显示了心脏内染料分布的差异。归一化后，我们刚刚向您展示了如何进行光学投影断层扫描，以及如何在荧光断层扫描的重建中去除由于光吸收引起的伪影。
事实上，请记住清除样品以消除散射光的贡献非常重要，但与此同时，平衡清除过程以尽可能多地保留荧光贡献也很重要。使用这种方法时要记住的另一件非常重要的事情是计算骨标准化比率，该比率是通过将荧光图像除以吸收图像获得的。就是这样。
感谢您加入我们的可视化实验，祝您自己的实验好运。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本研究引入了一种用于光学投影断层扫描（BnOPT）的Born归一化方法，通过考虑样品的吸收特性来提高荧光断层扫描重建的准确性。该方法应用于重建小动物器官中荧光分子探针的分布。
关键研究组成部分
科学领域
- 光学成像
- 荧光断层扫描
- 生物医学成像
背景
- 光学投影断层扫描是一种用于生物样品成像的技术。
- 传统方法可能不考虑吸收特性，导致不准确性。
- 荧光分子探针对于可视化生物过程至关重要。
- 改进重建方法可以提高对器官功能的理解。
研究目的
- 开发一种能够准确重建荧光分布的方法。
- 考虑生物样品的吸收特性。
- 提高小动物器官成像的可靠性。
使用的方法
- 样品被固定并嵌入一根auger柱中。
- 样品被旋转并用激发波长照射。
- 在透光模式下测量荧光信号。
- 计算归一化Born比值以辅助重建。
主要结果
- 所提出的BnOPT方法提供了准确的荧光重建。
- 它有效地考虑了样品的吸收特性。
- 该方法成功可视化了小动物器官中探针的分布。
- 结果显示与传统方法相比，成像质量得到改善。
结论
- BnOPT方法提高了荧光断层扫描的准确性。
- 它为体内生物样品研究提供了一种可靠的方法。
- 该技术可以推进生物医学成像和器官功能分析的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate fluorescence quantification in whole-organ imaging is critical for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The Born normalized Optical Projection Tomography (BnOPT) method addresses absorption-induced artifacts that compromise fluorescence signal interpretation, thereby improving predictive confidence in probe distribution analysis. This capability supports reliable assessment of therapeutic target engagement and pathway modulation in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing artifact-free fluorescence distributions of molecular probes in intact organs.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative imaging of probe activity in pathophysiological contexts such as infarction models.
- Predictive Value: Enhances confidence in target modulation readouts by correcting for spatially varying absorption that otherwise distorts quantification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares cleared, stable biological samples suitable for longitudinal imaging studies requiring reproducible fluorescence readouts.
- Operational Value: Standardizes sample preparation via ethanol dehydration and Murray’s clearing, minimizing asymmetric shrinkage and signal variability.
- Assay Readiness: Generates quantitative absorption and fluorescence datasets enabling normalized ratio calculations essential for reliable signal interpretation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates progression from discovery to preclinical validation by maintaining fluorescence signal integrity during extended clearing and imaging sessions.
- Mechanistic De-risking: Reduces false conclusions about probe distribution by accounting for absorption effects that mimic or mask true biological signals.
- Disease Model Fidelity: Applied to infarcted mouse hearts to visualize protease activity probes, supporting target-specific mechanism evaluation in relevant pathophysiology.
Pipeline & Workflow Integration
The BnOPT method integrates into early discovery workflows following target engagement screening, providing quantitative 3D fluorescence maps that inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling longitudinal tracking of fluorescent probe distribution in intact organs without signal degradation from absorption artifacts.
- Screening: Delivers assay-ready, cleared tissue samples with standardized preparation protocols ensuring reproducibility across experimental batches.
- Analytics: Outputs normalized born ratios (fluorescence/absorption) that isolate true fluorescence signals from absorption confounders, enabling accurate inter-group comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical studies by preserving fluorescence signal in cleared samples over time, allowing correlation of probe activity with functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for whole-organ fluorescence quantification applicable across multiple therapeutic areas and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by eliminating absorption-mediated quantification errors in fluorescence tomography.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized clearing (Murray’s solution) and dehydration protocols that minimize sample variability.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision reliability by providing accurate spatial readouts of molecular probe activity in disease-relevant organs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by reducing false-positive or false-negative conclusions from uncorrected imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical imaging, sample clearing, and fluorescence quantification to avoid artifacts from residual ethanol or incomplete clearing.
- Dependent on telecentric optical systems, rotation stages with 0.05° accuracy, and synchronized excitation/emission filtering for signal fidelity.
- Necessitates cross-team standardization of clearing duration and ethanol gradients to ensure consistent refractive index matching and fluorescence preservation.
- Adaptation to diverse organ sizes and densities may require adjustments in clearing time and illumination intensity to prevent signal loss or bleaching.
- Practical limitation: prolonged clearing beyond optimal duration risks fluorescence degradation, necessitating timed clearing cycles as described in the protocol.
