Name: 生于正常化荧光整个心脏成像的光学投影层析成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: 学习使用Born归一化光学投影断层扫描技术对小动物器官进行荧光分子探针分布成像。该方法通过计算归一化Born比值，有效校正样品吸收特性，显著提高荧光重建精度，为生物医学成像研究提供可靠工具。

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C. Vinegoni 感谢美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 1-RO1-EB006432 的支持。

成像步骤
实验装置的详细情况如图1所示。光源LS既用作吸收测量的照明光源，也用作荧光测量的激发光源，并通过窄带通干涉滤光片BPF进行滤光。一组固定的和可变的中性密度滤光片ND，结合自动快门S的使用，可控制照射到样品上的光量，并使其保持足够低的水平，以防止任何光漂白现象的发生。通过使用由两个透镜组成的伽利略望远镜结构的扩束器BE以及一个漫射器，实现样品的均匀照明。样品S浸没在透明溶液中，并固定在样品 holder 上，通过高速旋转台（Newport, PR50）绕其垂直轴旋转，旋转台的绝对精度为0.05度。三个独立的手动控制器可用于调节样品垂直轴在其正交平面内的倾斜角度并进行调整。透射照明信号由CCD相机直接检测；荧光信号则先经过窄带通干涉滤光片与长通滤光片（Omega Optical, Brattleboro, VT）组合过滤，然后通过远心镜头TL收集。远心镜头具有独特的优势，使其成为光学投影断层成像的理想选择。实际上，由于镜头组件内部在焦平面位置设有孔径光阑，确保形成光阑像的光线与光轴平行传播，从而几乎完全消除了透视畸变，并在远心深度范围内的多个成像平面提供一致的放大倍率。
样品制备
为固定组织/器官，需遵循以下步骤
<ol>
<li>样品在4°C条件下用PFA固定8小时。</li>
<li>然后用PBS洗涤样品15分钟。</li>
<li>将样品包埋于0.8%琼脂糖块中。</li>
<li>通过20%至100%的乙醇溶液梯度对琼脂糖块进行脱水。该梯度乙醇脱水程序有助于避免样品发生不对称收缩。</li>
<li>最后，将样品在100%乙醇中孵育10小时，以彻底去除样品中的水分。</li>
<li>将样品置于苯甲醇与苯甲酸苄酯按1:2比例配制的溶液中，直至样品透明所需时间为准。注意，不同样品所需时间差异较大，可能从数小时到数天不等。</li>
<li>透明过程结束后，样品中若残留微量乙醇，可能因透明液中酒精的热运动而导致重建图像出现严重伪影。为避免此问题，建议进行第二次透明循环。</li>
<li>步骤4和5应在避光条件下进行，以防止荧光对比剂或荧光蛋白发生光漂白。</li>
</ol>
心脏样本制备
在对任何组织进行成像之前，必须去除其中的血液成分，以避免重建结果中出现高吸收伪影。可按照以下步骤操作。
<ol>
<li>通过腹腔注射（IP）给予小鼠氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物进行麻醉。 注意：“从此步骤开始，始终避免样品暴露于光线下。”</li>
<li>注射肝素50 U（IP），5分钟后进行纵向剖腹手术。</li>
<li>切开左肾静脉（LRV），并向下腔静脉（IVC）灌注20 ml生理盐水溶液。</li>
<li>琼脂糖块应依次在20%、40%、60%和80%乙醇中各孵育1小时进行脱水，最后在100%乙醇中孵育10小时（过夜）。</li>
<li>随后按照常规样品制备流程固定心脏 注意：“从此步骤开始，始终避免样品暴露于光线下。”</li>
</ol>
吸收重建
在无散射情况下，光学吸收的重建通常类似于X射线计算机断层扫描（X-CT），可采用常见的滤波拉东反投影算法实现。吸收图像通过CCD相机在透射照明模式下获取，沿垂直轴以1度为间隔采集360个投影。将样品的垂直轴与CCD像素列对齐较为方便。
<ol>
<li>将琼脂糖块放入盛有透明溶液的腔室中</li>
<li>使用准直光束照射样本，进行激发和透射测量</li>
<li>以1度为间隔，将样本旋转360次投影</li>
<li>在吸收（本征）和荧光波长下，通过透射照明采集图像</li>
<li>放置快门以避免持续照射，减少光漂白</li>
<li>采用滤波拉东反投影算法对样本进行断层重建</li>
</ol>
荧光重建
用于吸收重建的算法不适用于荧光分布的重建，若不考虑吸收贡献，将导致严重的伪影。
<ol>
<li>按照“吸收重建”部分的说明进行操作。</li>
<li>同时采集吸收和荧光测量数据</li>
<li>将数据合并为归一化Born场图像</li>
<li>写出内源性和荧光波长下光传播前向模型的方程。</li>
<li>在离散化网格上计算前向模型格林函数的权重矩阵</li>
<li>对权重矩阵求逆，并将其乘以检测到的归一化Born场图像，以获得物体内荧光分布的重建结果</li>
</ol>

<ol><li>Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-544 (2002).</li>
<li>Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+plant+development+and+gene++in+three+dimensions+using+optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography.</a> Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).</li>
<li>Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+whole+rodent+organs+using+optical+computed+and+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography.</a> J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).</li>
<li>Ntziachristos, V., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+three-dimensional+fluorescence+reconstruction+of+diffuse+media+by+use+of+a+normalized+Born+approximation%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation.</a> Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).</li>
</ol>

用于全心成像的荧光光学投影断层成像中的邦恩归一化

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

光学投影断层成像是近年来引入的一种三维成像技术，主要用作发育生物学和基因表达研究中的成像工具。该技术首先将生物样本经梯度乙醇溶液脱水，然后置于苯甲醇与苯甲酸苄酯按2:1比例配制的混合液（BABB或Murray's Clear溶液）中透明处理，从而使样本在光学上变得透明。经过透明处理后，样本中的散射贡献可大幅降低并几乎可忽略不计，而吸收贡献则无法完全消除。在尝试重建待测样本内部荧光分布时，这种吸收效应会影响重建结果，不可避免地导致图像伪影和定量误差。尽管通过在透明介质中持续数周甚至数月可进一步降低吸收，但这将导致荧光信号逐渐丢失，并使样本处理时间变得不切实际地延长。此问题在重建外源性对比剂（分子对比剂）以及内源性对比信号（例如基因表达的荧光蛋白的重建）时均存在。

我们提出一种用于光学投影断层成像的玻恩归一化方法（BnOPT），该方法考虑了成像样本的吸收特性，以获得准确且定量的荧光断层重建结果。我们使用所提出的算法重建小动物器官内荧光分子探针的分布。

光学投影断层成像是近年来引入的一种三维成像技术，主要用作发育生物学研究中的成像工具……

为了进行归一化断层光学投影成像，首先将样品固定并包埋在琼脂糖圆柱中。然后使样品绕垂直轴旋转，并用特定激发波长的光源进行均匀照射，同时使用配备合适光学元件的CCD相机测量透射光。在透射照明模式下检测波长处的荧光信号。通过获取的荧光和吸收图像，可确定归一化的Born比值，并重建样品中荧光四聚体的分布。大家好，我叫Claudia Naone，我在哈佛医学院麻省总医院系统生物学中心工作。我是Danielle Raki，来自慕尼黑工业大学和慕尼黑阿尔中心的生物与医学成像研究所。我是 Giselle Fido。我是哈佛医学院麻省总医院 C-M-I-C-S-B 的实验外科主任。今天我们将向您展示一种利用基于玻恩归一化方法的光学投影断层成像技术，进行离体器官实时全器官成像的操作流程。我们在实验室中采用此方法研究荧光分子探针在中空器官中的分布。现在开始吧。本视频将介绍使用光学投影断层成像技术对制备好的组织或器官进行成像的操作流程，以及一段配套视频。我们将介绍如何利用该系统对发育中的果蝇进行延时成像。光学投影断层成像技术是一种三维成像方法，需要光学元件与旋转平台的独特组合。在本视频片段中，将详细阐述成像操作流程。首先，主光源用于提供照明和吸收测量所需的光线；为了进行荧光测量时提供荧光激发，主光源首先通过一个窄带通干涉滤光片进行过滤。接着，光线穿过一组固定的和可变的中性密度滤光片。这些滤光片与一个自动快门配合使用，以控制照射到样品上的光量，并将其保持在足够低的水平，防止发生光漂白。通过使用扩束镜和结合了格兰望远镜透镜与扩散透镜的光学系统，实现样品的均匀照明。最后，采用光学窄带通干涉滤光片对激发光源进行光学净化。样品浸没在透明溶液中，并固定于玻璃管内以进行成像。样品通过一个绝对精度为0.05度的高速旋转平台绕其垂直轴旋转。三个独立的手动控制器可用于倾斜并调节样品垂直轴在其正交平面内的位置。吸收信号在透射照明下采集，并由CCD相机直接检测。荧光信号通过窄带通干涉滤光片，并结合长通滤光片进行过滤，然后由远心镜头收集。远心镜头具有独特的优势，可提供一系列理想特性，非常适合光学投影断层成像。镜头组件内部位于镜头焦点处的孔径光阑的存在至关重要。它可确保成像光线平行于光轴传播，从而消除透视畸变，并在远心深度范围内的多个焦平面上提供相等的放大倍率。下一个视频片段介绍了一种样本制备技术。随后将介绍成像所用的方法。用于断层成像的样本组织或器官制备依赖于以乙醇为基础的脱水步骤，以避免样本发生不对称收缩。该过程需要数天时间才能完成。在本视频中，我们将以小鼠心脏为例进行准备，但该方案可应用于任何组织或器官。我们将利用发生可控梗死的动物心脏，演示我们的荧光成像方法。换句话说，血液供应的丧失会提前导致明显的组织坏死。该小鼠已被注射了ProSense 800，一种可激活的荧光传感器，用于报告愈合过程中组织蛋白酶的活性。为进行灌注及心脏挤出，需通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪对小鼠实施麻醉。随后，腹腔注射50单位肝素，以防止血液凝固。五分钟后，对完全麻醉的动物进行纵向剖腹手术以清除血液。首先，打开左肾静脉。然后缓慢向下腔静脉注入20毫升生理盐水溶液。在体视显微镜下冲洗出全部血液后，生理盐水将置换血液。随后按照标准操作方法打开胸腔并取出心脏。现在，将心脏在4%多聚甲醛（PFA）中、4摄氏度条件下固定8小时。从此时起，组织制备步骤必须在避光条件下进行，以避免组织上施加的任何荧光对比剂或荧光蛋白发生漂白。固定完成后，用 PBS 冲洗 15 分钟以去除 PFA，随后将清洗后的心脏组织浸入 0.8% 琼脂糖液滴中。待琼脂糖凝固后，将组织周围的琼脂糖切除，形成块状结构。接下来，通过五步脱水程序对透明化处理后的心脏组织进行脱水：首先将其浸泡于20%乙醇中，随后逐步使用浓度递增的乙醇处理，最后使用纯乙醇。该脱水步骤有助于避免样本发生不对称收缩。前四个低浓度乙醇浸泡步骤各需进行1小时，最后一个100%乙醇浸泡步骤必须持续至少10小时。乙醇处理完成后，将样品置于 Murray 透明液中，直至样品变得透明，所需时间从数小时到数天不等。该透明液可模拟细胞内的水分，并与细胞膜的折射率相匹配，从而使组织透明。在透明过程结束时，样品中可能仍残留微量乙醇，这些残留物会导致透明液中的酒精因热运动而在重建过程中产生多种伪影。为避免此问题，建议进行第二次透明化处理，该过程不应超过四小时。完成后，样品即可用于光学投影。计算机辅助断层扫描。在无光散射的情况下，可通过常用的滤波拉东反投影算法获得光学吸收的重建图像。该过程类似于二维X射线计算机断层扫描。将气溶胶块放入装有透明化溶液的透明成像室中。然后将成像室固定在载物台上，使用准直光束照射样本，以进行激发和透射测量。激发光源的选择取决于所选用的荧光蛋白或分子成像对比剂。将样品的垂直轴与CCD的像素列对齐较为方便。以1度为角度增量，使样品旋转360次投影，在透射照明条件下，分别在吸收波长和荧光波长下采集每个角度的图像。控制采集过程的软件会自动控制主光源上的快门，以避免持续照明，减少样品的光漂白。当需要较长的积分时间以从吸收数据生成三维重建时，快门尤为重要。请直接使用滤波拉东逆投影算法，从荧光图像进行三维重建。其他吸收贡献也必须予以考虑，相关内容将在下一个视频片段中介绍。完成吸收重建所需的步骤后，还需进行若干步骤才能完成荧光重建。在无光散射的情况下，可通过常用的滤波拉东反投影算法获得光学图谱的重建。该过程类似于二维X射线计算机断层扫描。在重建荧光分布时，空间依赖性变化的吸收特性会导致使用逆拉东变换进行荧光图像反向投影产生错误，严重影响所获得的荧光蛋白或荧光分子探针分布及其定量能力。从任意光源位置 Xs 发出的、波长为 Lambda X 的每一条光线，在穿过被成像物体时均会经历指数衰减。激发后，位于X位置的荧光染料所发射的辐射光经滤光后，由CCD像素在XD位置通过远心成像透镜系统收集。尽管发射的荧光并不沿与激发光相同的路径传播，但每个像素记录的强度近似代表了沿对应激发光束整个焦区范围内所有被激发荧光染料的投影。由于系统具有高度的远心特性，成像物体被旋转360度，并利用CCD相机在激发波长处采集多个光源-探测器测量值UX，以及在发射波长处采集UFL。然后在归一化出生场 UB 下进行合并，UB 定义为两者的比值。通过编写激发光和发射光传播的正向模型，可以促进荧光染料分布的重建，该模型利用格林函数描述激发光的传播。光线传播遵循简单的比尔-朗伯定律，其中 moo A 是先前确定的光学吸收分布。光源位于位置 Xs 处所发射、并在 C.C.D 上位于位置 XD 处的探测器所测得的光强 UX，可表示为格林函数与一个依赖于系统的常数 B 的乘积。随后可计算出激发光强 GX 沿每条射线路径的精确分布。探测器 XD 处检测到的荧光强度 UFL 由光源 Xs 发出的光所激发产生，其值需考虑从 Xs 到 XD 的射线路径上所有被激发点所贡献的总和。因此，我们成像问题的前向模型可表示为 ub ub，其中 alpha 包含与系统相关的未知常数。随后，该前向模型在假定的网格上进行离散化，并通过反演来提取荧光染料的分布，同时获取透射信号和荧光信号，并利用传统的反投影算法对样品进行重建。此处展示了透射成像和传统的荧光光学投影断层成像的重建结果。心脏单个平面的重建图像以吸收和荧光两种模式显示。展示了归一化玻恩重建结果，该结果揭示了染料在心脏内分布的差异。完成归一化后，我们已向您演示了如何搭建光学投影断层成像系统，以及如何消除荧光断层成像重建中由光吸收引起的人工伪影。事实上，必须牢记对样品进行澄清以去除散射光的干扰，但同时也要注意平衡澄清过程，以尽可能保留荧光信号的贡献。使用该方法时另一个需要牢记的重要事项是计算骨组织归一化比值，即用荧光图像除以吸收图像所得的比值。以上就是全部内容。感谢观看我们的可视化实验，祝您自己的实验顺利成功。

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