一种多区室中枢神经系统神经元-胶质细胞共培养微流控平台

多区室微流控神经元共培养装置的制备始于使用铣床在PMMA块上加工储液池，随后通过热压成型将连接各区室的微通道阵列压印成型。当A-P-M-M-A模具制备完成后，以PMMA模具为模板复制出A-P-D-M-S模具母版，并涂覆三氯乙烯。最终装置由PDMS模具母版复制而成，并组装于经PDL包被的培养板上。

将原代 E16 至 E18 大鼠神经元接种至胞体区，并培养两周，随后在轴突区内的轴突层上方加入 P1 至 P2 大鼠少突胶质细胞，进行共培养。大家好，我是来自德克萨斯农工大学电子与计算机工程系纳米生物系统实验室的 J Par。今天我们将向您展示一种多区室微流控神经元共培养平台的制备方法。

我们在实验室中采用此方法体外研究中枢神经系统中神经元与胶质细胞的相互作用。现在开始操作。首先，使用微型铣床制作深度为3.5毫米的隔室。

在 A-P-M-M-A 区段中，定义一个胞体区室和六个轴突生长锥区室。制备好区室后，进行超声处理，并用异丙醇处理 10 分钟以去除碎片；使用传统的光刻和湿法刻蚀工艺在玻璃片上制作微脊结构；将玻璃片上的微脊图案热压印到 PMMA 母模上；首先手动对准 PMMA 模具母模与玻璃基板。

然后在热压机上将温度升至115摄氏度。当达到该温度后，施加0.5吨压力，持续5分钟。5分钟后，冷却至40摄氏度，然后释放压力。

现在开始制备PDMS母模。按10:1的重量比将PDMS预聚物与其固化剂混合，将PMMA母模切割成50毫米×50毫米大小的块状。使用弯锯切割后，将其放入模具中，并将PDMS混合物倒在PMMA母模上，然后将模具置于连接真空泵和干燥器的真空干燥器中抽真空15分钟。

为了去除PDMS混合过程中产生的气泡。待所有气泡完全去除后，将容器放入调平的85°C烘箱中加热一小时，进行聚合反应。PDMS完全固化后，将其从PMMA母模上剥离，将PDMS母模放入干燥器中，并加入两到三滴三氯乙烯，抽真空15分钟，对PDMS母模进行蒸镀处理。

对PDMS母版进行涂层处理，有助于将最终的PDMS神经元共培养装置从PDMS母版模具中顺利脱模。涂层后，用异丙醇短暂冲洗PDMS母版，以去除过量的三氯乙烯，并用氮气吹干。PDMS聚合物制备神经元共培养装置的过程与前一节所述制备PDMS母版模具类似。首先按10:1的质量比将PDMS预聚物与遮光剂混合，然后将PDMS混合物倒在PDMS母版上方。注意不要倒入过多PDMS，以免完全浸没母版上3.5毫米高的PDMS结构。

将DGA置于与真空泵相连的干燥器中抽真空15分钟。待所有气泡完全排出后，将PDMS放入已调至水平的85摄氏度烘箱中，加热聚合一小时。一小时后，从烘箱中取出PDMS，置于室温下冷却。随后小心地将PDMS神经元培养装置从PDMS母模上剥离下来。

用对苯二甲醛包裹PDMS装置，以防止灰尘或碎屑污染。使用配备刀片的台钻将包裹好对苯二甲醛的PDMS切割成单个部件，神经元共培养PDMS装置即基本制备完成，可准备用于细胞培养板。在将神经元共培养PDMS装置放入细胞培养板之前，先将其置于等离子清洗仪中，用空气等离子体处理90秒，以使表面具有亲水性。

此处理步骤将有助于在装置组装到多聚赖氨酸包被的培养板后，使培养基充分填充微通道。为对经等离子处理的装置进行灭菌，需将其浸入70%乙醇中30分钟，然后将容器转移至无菌生物安全柜中。30分钟后，取出装置，并用经0.2微米Millipore滤器过滤的氮气吹干。

接下来，将干燥后的装置置于经多聚D-赖氨酸包被的聚苯乙烯六孔培养板上，并轻轻按压，以确保装置与培养板表面之间形成紧密密封。随后向胞体室中加入培养基。静置一至两分钟，确保微通道内无气泡残留。

然后填充六个轴突胶质细胞区域。最后将装有培养基的装置放入37摄氏度培养箱中过夜培养，以去除任何可能的碎片或有毒残留物。过夜培养后，即可开始培养，准备将细胞接种到装置中。

使用移液器吸取Soma和Axon隔室中的培养基。然后将40微升来自胚胎第16至18天大鼠的原代前脑神经元细胞以每平方毫米500个细胞的表面密度加入Soma隔室中，围绕微通道入口处接种。在加样过程中务必避免触碰PDMS装置，因为这可能导致装置与细胞培养板之间的密封破裂。

这些显微图像显示了钙黄绿素染色的神经元细胞。在胞体区室内，细胞均匀加载并紧密地位于微流控通道附近。将载有细胞的装置置于37摄氏度培养箱中孵育30分钟，以增强细胞对基底的黏附。

孵育结束后，用培养基充满所有腔室。将装置中的细胞置于37摄氏度、含5% CO2的湿润培养箱中培养，每三至四天仅更换一半培养基。在轴突-胶质细胞腔室内应形成致密的轴突网络。

培养14天后，即体外培养两周时，在加载细胞前，向原代神经元CLIA细胞中加入适量试剂，从各室中吸出约60%的培养基；少突胶质细胞于出生后第一天至第二天从Sprague Dolly大鼠的大脑半球中分离获得。在每个轴突-胶质共培养室中加入5微升少突胶质细胞，使其密度达到每平方毫米1000个细胞。加载过程中需格外注意，移液时避免触碰底部基质，以免损伤已在基质上形成的轴突网络。加入少突胶质细胞后，将细胞在37摄氏度下孵育1小时，随后补满各室培养基。

使用培养基继续培养神经元，方法与添加CLIA前相同，在接下来的两周内每三到四天更换一半的培养基，同时研究哺乳动物中枢神经系统。在实验操作得当的情况下，神经元细胞与胶质细胞的相互作用得以维持。神经元细胞被加载至胞体区室后，会靠近微通道入口处定位，而轴突层则开始在轴突-胶质区室内部形成。

培养一周后，当接种少突胶质细胞时，若胞体区室内出现神经元细胞聚集现象，可能提示细胞状态不佳。神经元培养两周后，轴突区室应被致密的轴突层覆盖，此时可将少突胶质细胞接种于轴突层上方。我们刚刚向您展示了如何制备多区室神经胶质共培养平台，以及如何利用该平台在体外研究中枢神经系统中神经元与神经胶质细胞的相互作用。

进行此操作时，重要的是要记住避免设备沾染灰尘，并且不要在乙醇中灭菌过长时间，以免影响其结合性能。就这些。感谢观看，并祝您的实验顺利成功。