一个多室中枢神经系统的神经胶质细胞共培养的微流体平台
September 10th, 2009
我们开发了一种新型的多舱的神经元共培养的微平台，在体外培养的中枢神经系统的轴突神经胶质细胞相互作用的研究。该平台能够进行多达6个独立并行实验，并采用新开发的宏观/微观混合制备方法。
多室微流体神经元共培养装置的制造始于用铣床定义 PMMA 块上的储液器，然后对连接隔室的微通道阵列进行热压花。准备好 A-P-M-M-A 模具后，从 PMMA 模具中复制 A-P-D-M-S 模具母版并涂上三氯乙烯。最终设备从 PDMS 模具母版复制并组装在 PDL 涂层培养板上。
然后将原代 E 16 至 18 大鼠神经元加载到胞室中并培养两周，然后在轴突 GGL 隔室内的轴突层顶部添加 P 1 至 2 大鼠少突胶质细胞进行共培养。大家好，我是来自德克萨斯农工大学电气与计算机工程系纳米生物系统实验室的 J Par。今天，我们将向您展示制造多室微流控神经元共培养平台的程序。
我们在实验室中使用该程序来研究体外中枢神经系统神经元神经胶质细胞的相互作用。那么让我们开始吧。要开始此过程，请使用微型铣床制作 3.5 毫米深的隔间。
在 A-P-M-M-A 块中定义一个胞体隔室和六个轴突 ggl 隔室。准备好隔间后，超声处理和异丙醇 10 分钟以去除碎屑，使用常规光刻和湿法蚀刻工艺在载玻片上制作微脊结构，热压印玻璃上的微脊图案。首先滑到 PMMA 母版上，手动对齐 PMMA 模具母版和玻璃基板。
然后在热压机上将温度升高到 115 摄氏度。一旦达到温度，使用 0.5 吨重物 5 分钟。5 分钟后，冷却至 40 摄氏度并释放压力。
现在开始准备 PDMS 主站。将 PDMS 预聚物与其固化剂以 10 比 1 的重量比例混合，将 PMMA 母料切割成 50 毫米 x 50 毫米大小的块状。使用弯锯将其放入木桶中，将 PDMS 混合物倒在 PMMA 母版顶部，将木桶放入连接到真空泵和 DGA 的干燥液中 15 分钟。
去除 PDMS 混合过程中产生的气泡。去除所有气泡后，将木桶放入 85 摄氏度的平烤箱中 1 小时进行聚合。现在 PDMS 已完全固化，将 PDMS 母版从 PMMA 母版上剥离，将其放入装有两到三滴三氯乙烯的干燥液中，对 PDMS 母版进行蒸汽涂层，然后真空 15 分钟。
PDMS 母模的涂层有助于从 PDMS 母模中释放最终的 PDMS 神经元共培养装置 涂布后，用异丙醇短暂冲洗 PDMS 母模以去除过量的三氯乙烯，并用氮气神经元共培养装置干燥 PDMS 聚合物的制造类似于准备上一节中描述的 PDMS 母模。首先将 PDMS 预聚物与遮光剂以 10 比 1 的重量比例混合，然后将 PDMS 混合物倒在 PDMS 母版的顶部。重要的是不要倾倒过多的 PDMS，以免主站上 3.5 毫米高的 PDMS 结构完全浸没。
干燥物内的 DGA 连接到真空泵 15 分钟。去除所有气泡后，将 PDMS 放入 85 摄氏度的水平烘箱中 1 小时进行聚合，1 小时结束时，将 PDMS 从烘箱中取出并在室温下冷却。然后从 PDMS 主控器上轻轻剥离 PDMS 神经元培养装置。
用 paraform 包裹 PDMS 设备，以保护它们免受灰尘或碎屑的影响。最后，使用配备刀片的钻床将多聚体包裹的 PDMS 切割成单独的碎片，神经元共培养 PDMS 设备几乎可以在细胞培养板中使用。在将神经元共培养 PDMS 装置放入细胞培养板中之前，将装置放入等离子体清洁器中，并暴露在空气等离子体中 90 秒，以使表面亲水。
这种处理将有助于在组装到 poly de lycine 包被板上后用培养基填充微通道。为了对等离子体处理的设备进行灭菌，请将其浸入 70% 乙醇中 30 分钟，然后将容器移至无菌生物罩中。30 分钟后，取出装置，用 0.2 微米毫孔过滤器过滤的氮气干燥。
接下来，将干燥的装置放在聚 D 赖氨酸包被的聚苯乙烯六孔培养板的顶部，并轻轻按压以确保培养板表面与装置冰之间的紧密密封。现在用培养基填充 soma 隔间。等待一两分钟，以确保没有气泡滞留在微通道内。
然后填充六个轴突神经胶质细胞隔室。最后，将装满培养基的设备在 37 摄氏度的培养箱中孵育过夜，以去除任何可能的碎屑或有毒残留物。过夜孵育后，可以开始培养，为将细胞上样到装置中做准备。
使用移液器从 Soma 和 Axon 隔室中吸出培养基。然后将胚胎第 16 至 18 天大鼠的 40 微升原代前脑神经元细胞以每平方毫米 500 个细胞的空中密度加载到微通道入口周围的胞室中。加载细胞时，请勿触摸 PDMS 设备，因为它会破坏设备与细胞培养板之间的密封。
这些显微镜图像显示钙 am 染色的神经元细胞。在胞体隔室内，细胞均匀地加载到隔室内，并靠近微流体通道。将装有细胞的装置在 37 摄氏度的培养箱中孵育 30 分钟，以增强细胞对基质的粘附。
孵育后，用培养基填充所有隔间。将细胞保持在 37 摄氏度，在加湿的 5%CO2 培养箱中，每三到四天只更换一半的培养基。应在轴突神经胶质细胞隔室内形成致密的轴突网络。
培养 14 天后培养两周后，在加载细胞之前加入体外原代神经元 CLIA 细胞 从出生后从 Sprague Dolly 大鼠的大脑半球解剖少突胶质细胞的隔室中吸出约 60% 的培养基。第 1 天至第 2 天，以每平方 1000 个细胞的空中密度向每个轴突神经胶质细胞室添加 5 微升少突胶质细胞。必须小心在加载过程中不要使用移液管接触底部基质，因为它会破坏添加少突胶质细胞后在基质上形成的轴突网络，将细胞在 37 摄氏度下孵育一小时，然后填满隔室。
随着培养基继续培养神经元，就像以前一样，添加 CLIA 时，仅每 3 或 4 天更换一半的培养基，持续两周，同时研究哺乳动物中枢神经系统。当实验正确进行时，轴突胶质细胞相互作用。加载到胞体隔室的神经元细胞位于靠近微通道入口的位置，轴突层开始在轴突 Ggl 隔室内形成。
培养一周后，胞室内神经元细胞聚集的迹象可能表明细胞在加载少突胶质细胞时不健康。神经元培养两周后，轴突 ggl 室应覆盖一层致密的轴突，少突胶质细胞应加载到轴突层的顶部。我们刚刚向您展示了如何构建多室神经胶质细胞培养平台，以及如何使用它来研究体外 CNS 神经胶质细胞的相互作用。
执行此程序时，请务必记住让设备远离灰尘，并且不要在乙醇中消毒太久，因为它们不会破坏粘合。就是这样。感谢您的观看和祝您实验好运。
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概述
本文介绍了一个专为体外研究中枢神经系统轴突-神经胶质相互作用而设计的新型多室神经元共培养微系统平台。该平台允许同时执行多达六个独立实验，并采用了一种新的宏/微混合制造方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 微流控
- 细胞培养
背景
- 理解轴突-神经胶质相互作用对中枢神经系统研究至关重要。
- 现有平台可能不允许多个同时进行的实验。
- 新制造方法的开发可以增强实验能力。
- 微流控装置可以促进细胞环境的精确控制。
研究目的
- 开发一个用于研究中枢神经系统轴突-神经胶质相互作用的平台。
- 实现并行实验以提高通量。
- 利用创新的制造技术以提高设备性能。
使用的方法
- 使用铣床制作带有定义储存库的PMMA模块。
- 通过热压成型将微通道阵列连接到各个隔室。
- 从PMMA模具复制PDMS模具母模。
- 在PDL涂层的培养板上组装最终设备。
主要结果
- 成功制造了一个多室微流控设备。
- 能够培养原代大鼠神经元和少突胶质细胞。
- 展示了在体外研究轴突-神经胶质相互作用的潜力。
- 能够同时进行多个独立实验。
结论
- 开发的平台是中枢神经系统研究的重大进步。
- 它允许在受控环境中对细胞相互作用进行详细研究。
- 该方法可以应用于各种神经生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This multi-compartment microfluidic platform enables high-throughput, parallel investigation of CNS axon-glia interactions, addressing a key bottleneck in neuropharmacology target validation. By isolating axonal compartments from somatodendritic regions, it supports mechanistic de-risking of oligodendrocyte-targeted therapies through controlled, reproducible co-culture conditions. The scalable fabrication method enhances assay standardization and cross-functional reproducibility in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of axon-glia signaling pathways critical for myelin-related disease hypotheses.
- Operational Value: Supports parallel testing of up to six conditions per device, increasing target validation throughput.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides fluidic isolation between compartments for independent compound screening in each axon-glia chamber.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via consistent microchannel geometry and reservoir design across replicates.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human-relevant CNS axon-glia interactions using primary rodent cells, improving predictive confidence in preclinical efficacy.
- Operational Value: Enables longitudinal co-culture studies over four weeks, supporting chronic dosing and biomarker timing studies.
Pipeline & Workflow Integration
The platform integrates into the discovery workflow from target hypothesis testing through lead optimization, particularly for demyelinating diseases and neurodegeneration programs requiring glial mechanism de-risking.
- Discovery Biology: Supports functional validation of glial targets by enabling axon-specific readouts isolated from somatic confounds.
- Screening: Enables multiparametric assessment of compound effects on axonal growth and glial interaction across six conditions.
- Analytics: Generates quantitative axonal network density and glial coverage metrics for dose-response modeling.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies focused on axonal integrity and myelination status in disease models.
- Enterprise Reuse: PDMS molding process allows batch fabrication, supporting multi-project reuse across neuroscience discovery teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in glial target validation by isolating axon-glia interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized microchannel fabrication and compartmentalized fluid handling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in oligodendrocyte-modulating programs via de-risked target engagement data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets using parallel human-relevant axon-glia interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device assembly and sterile cell culture techniques.
- Dependent on access to hot embossing equipment and vacuum-assisted PDMS degassing systems.
- Necessitates cross-team standardization of plating, media change, and incubation protocols for reproducible results.
- Adaptation to human iPSC-derived neurons or glia may require optimization of coating and timing parameters.
- Practical limitations include device sealing integrity over long-term culture and potential shear stress in microchannels during media exchange.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Introduction
1:40
Preparing a Master Mold of the Neuron Culture Device
7:11
Neuron Culture Device Assembly
5:16
Neuron Culture Device Replication
9:02
Cell Loading and Neuron-gila Co-culture
12:07
Neuron-gila Co-culture in a Microfluidic Device Representative Results
12:48
Conclusion
