Name: 一个多室中枢神经系统的神经胶质细胞共培养的微流体平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-10T16:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: 了解多室微流控神经元共培养平台的制备方法，用于研究中枢神经系统轴突-胶质细胞相互作用。该平台采用宏观/微观混合制造技术，可同时开展六个独立实验，适用于大鼠原代神经元与少突胶质细胞的体外共培养研究。

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本工作由美国国立卫生研究院/国家精神卫生研究所（NIH/NIMH）资助，项目编号 #1R21MH085267。

第1部分：多区室神经元共培养装置制备的主模具准备
<ol>
<li>制作PMMA母模的第一步是加工出3.5 mm深的腔室。使用微铣床（MDX-40，Roland，或任何其他CNC铣床）在PMMA块上定义一个胞体腔室和六个轴突/胶质细胞腔室。然后将PMMA母模在异丙醇中进行超声清洗10分钟，以去除碎屑。</li>
<li>通过标准光刻工艺在50.8 mm × 50.8 mm的玻璃载片上制备高2.5 μm的脊状结构阵列，随后进行玻璃湿法刻蚀。 首先，在经清洁的玻璃基底上使用正性光刻胶S1818通过光刻工艺定义脊状结构阵列。将S1818以4000 rpm转速旋涂于基底上，在110°C下前烘5分钟，随后使用掩膜对准仪进行紫外光曝光（84 mJ/cm2），再用MF319显影40秒。接着，将完成光刻胶图形化的玻璃基底在室温下浸入缓冲氧化物刻蚀液（BOE）中6–7分钟，以获得高2.5 μm的脊状结构。最后，使用丙酮和异丙醇去除光刻胶层，并用去离子水（DI水）彻底冲洗。</li>
<li>将带有微脊结构的玻璃基底与PMMA母模进行热压印，以实现图案转移。 首先，将PMMA模具母模与玻璃基底手动对准后置于热压机上。然后将温度升至115 °C。达到设定温度后，施加0.5吨压力并保持5分钟。5分钟后，降温至40 °C并释放压力。随后将PMMA母模切割成50.8 mm × 50.8 mm大小的块状。</li>
<li>将PDMS预聚物（Sylgard 184）与固化剂按10:1的质量比混合。</li>
<li>将PMMA母模放入模具盒中，并将PDMS混合液浇注于其上以制备PDMS母模。然后将其置于连接真空泵的干燥器中。浇注在PMMA母模上的PDMS需抽真空15分钟，以去除PDMS混合过程中产生的气泡。</li>
<li>待所有气泡完全去除后，将PDMS放入水平放置的85 °C烘箱中加热1小时，使其完成聚合。</li>
<li>PDMS完全固化后，将其从PMMA母模上剥离，并放入干燥器中，加入2–3滴三氯硅烷后抽真空15分钟，使PDMS母模表面形成蒸汽涂层。三氯硅烷涂层有助于后续从PDMS母模上顺利脱模最终的PDMS神经元共培养器件。涂层完成后，用异丙醇短暂冲洗PDMS母模以去除过量的三氯硅烷，并用N2气体吹干。</li>
</ol>
第2部分：神经元培养装置的复制
<ol>
<li>将PDMS预聚物（Sylgard 184）与固化剂按10:1的重量比混合。</li>
<li>将PDMS混合物倒入PDMS模具表面，并置于连接真空泵的干燥器中脱气15分钟。注意不要倒入过多PDMS，以免完全浸没模具上3.5 mm高的PDMS结构。</li>
<li>待所有气泡完全去除后，将PDMS放入调平的85 °C烘箱中，加热一小时以完成聚合。</li>
<li>一小时后将PDMS从烘箱中取出，在室温下冷却。随后，将PDMS神经元培养装置从PDMS模具上小心剥离。剥离后的PDMS装置用Parafilm包裹，以防灰尘或碎屑污染。</li>
<li>用钻床配备刀片将包裹有Parafilm的PDMS装置切割成独立的单元。</li>
</ol>
第3部分：设备组装
<ol>
<li>将PDMS神经元培养装置放入等离子清洗仪中，暴露于空气等离子体中90秒，以使PDMS装置表面具有亲水性。此等离子体处理有助于在组装后使微通道易于被培养基填充，当装置与聚-D-赖氨酸包被的基底结合时尤其重要。</li>
<li>经等离子体处理后的装置随后浸入70%乙醇中30分钟以进行灭菌，并转移至无菌生物安全柜内。</li>
<li>将灭菌后的装置从70%乙醇中取出，用经Millipore过滤的N2气体吹干。干燥后的装置置于聚-D-赖氨酸包被的聚苯乙烯6孔培养板上，并施加轻柔压力，以确保基底与装置之间形成密封。</li>
<li>随后向胞体区室中加入培养基，再依次填充六个轴突/胶质细胞区室。建议在向胞体区室加入培养基后，等待1–2分钟再填充轴突/胶质细胞区室，以确保微通道内无气泡残留。</li>
<li>加入培养基的装置在37 °C培养箱中孵育过夜，以冲洗可能存在的碎屑或有毒残留物。</li>
</ol>
第4部分：细胞接种及神经元-少突胶质细胞共培养
<ol>
<li>在细胞培养的第一天，将来自胚胎第16-18天大鼠的原代前脑神经元细胞以500个细胞/mm²的密度接种至胞体区室2首先，使用移液器吸除胞体区室和轴突/胶质细胞区室内的培养基，然后在细胞接种前将38500个细胞重悬于稀释液中 40 μl 培养基被加载到微通道入口周围的胞体室中。在加样细胞时，切勿触碰PDMS装置，因为这可能会破坏装置与基底之间的密封。</li>
<li>将已接种细胞的装置置于 37 °C 孵育以促进细胞与基质的黏附。孵育后，所有腔室均加入培养基。</li>
<li>细胞在以下条件下培养： 37 °C 在加湿的5% CO₂环境中2 培养箱中培养，每3-4天仅更换一半培养基。</li>
<li>神经元培养14天后 体外，将少突胶质细胞加入轴突/胶质细胞区室进行共培养。少突胶质细胞取自出生后第1-2天的Sprague-Dawley大鼠大脑半球，以1000个细胞/mm²的面积密度加入每个轴突/胶质细胞区室2在接种细胞之前，用移液器吸出各隔室中约60%的培养基。操作时需注意不要触碰底部基质，以免损伤在基质上已形成的轴突网络。随后，将6700个少突胶质细胞悬浮于稀释液中 5 μl 将培养基加入轴突/胶质细胞区室中。细胞孵育1小时后，各区室补充培养基至满。</li>
<li>细胞在培养条件下于 37 °C 在加湿的5% CO₂环境中2 培养箱中继续培养，每3-4天更换一半培养基，持续两周。</li>
</ol>
第5部分：代表性结果：
当实验操作正确时，加载至胞体区室的神经元细胞会靠近微通道入口，培养1周后，轴突/胶质区室内部开始形成轴突层。若在胞体区室内出现神经元细胞聚集现象，可能表明细胞状态不健康。在神经元培养两周后加载少突胶质细胞时，轴突/胶质区室应已被致密的轴突层覆盖，少突胶质细胞应接种于轴突层之上。
<img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig1tmb.jpg" border="0" alt="神经元培养示意图；PDL包被的培养板，轴突/胞体区室，轴突-胶质细胞相互作用研究。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1. 高通量微流控多区室中枢神经系统神经元共培养平台的示意图。横截面图显示了轴突与神经元胞体及树突的分离，以及通过微小液体液面差实现区室间的流体隔离。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig1.jpg">点击此处</a>查看图1的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig2tmb.jpg" border="0" alt="微通道制备；示意图；PDMS器件工艺；铣削、涂覆；微流控研究。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 2"> 图2. 多腔室PDMS微流控共培养装置的制备与组装步骤。每个装置可适配于标准6孔聚苯乙烯细胞培养板中的一个孔。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig2.jpg">点击此处</a>查看图2的放大版本。

<ol><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).</li>
<li>Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
<li>Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxynitrite+generated+by+inducible+nitric+oxide+synthase+and+NADPH+oxidase+mediates+microglial+toxicity+to+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们开发了一种用于研究哺乳动物中枢神经系统轴突-胶质细胞相互作用的多区室共培养平台。该装置成功实现了中枢神经系统轴突与神经元胞体/树突的分离，并实现了少突胶质细胞在装置内的共培养。神经元密度可根据具体应用进行调整，但密度过低或过高均可能导致细胞死亡。此外，更换培养基时仅需更换一半体积，以避免对基质上的细胞或轴突层造成损伤。我们预期该系统将成为研究中枢神经系统轴突-胶质细胞信号网络的有力工具。 体外 并为筛选促进髓鞘形成和髓鞘修复的生长因子或潜在药物候选物提供一条通向高通量平台的路径。

一种多区室中枢神经系统神经元-胶质细胞共培养微流控平台

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

我们介绍一种新型的多区室神经元共培养微系统平台 体外 中枢神经系统轴突-胶质细胞相互作用研究，可同时进行多达六项独立实验，实现高通量。我们开发了一种新的制备方法，通过单次软光刻工艺即可在同一装置内构建出兼具微米和宏观结构的微流控器件，从而实现具有良好重复性的大规模制备。
多区室微流控共培养平台包含一个用于神经元的胞体区室和六个用于少突胶质细胞（OLs）的轴突/胶质区室。胞体区室与轴突/胶质区室通过阵列式轴突导向微通道相连，这些微通道作为物理屏障，可将神经元胞体限制在胞体区室内，同时允许轴突生长进入轴突/胶质区室。将少突胶质细胞接种至轴突/胶质区室后，其仅能与轴突发生相互作用，而无法接触神经元胞体或树突，从而实现局部化的轴突-胶质相互作用研究。这些微通道还可实现各区室间的流体隔离，使单个装置上可同时进行六项独立实验，提高通量。
使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）的软光刻技术是生物医学微装置中常用的一种方法。这些装置上的储液池通常通过手工打孔来定义。尽管该方法简单，但由于对位不准且耗时，当需要重复大量制作储液池时，此方法并不适用。新开发的方法无需手工打孔，克服了上述局限性。首先，使用微铣削机在聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）块上加工出七个储液池（深度：3.5 mm）。然后，将玻璃基底上制备的脊状微结构阵列通过热压法压印到PMMA块上，以形成连接胞体与轴突/胶质细胞区室的微通道。该过程使得宏观尺度的储液池（3.5 mm）和微观尺度的通道（2.5 μm）集成于同一块PMMA母模中。通过软光刻技术复制得到作为模具母模的PDMS复制品，并以此母模复制出最终的PDMS装置。
从E16-18大鼠分离的原代神经元被接种至胞体区，并培养两周。细胞培养一周后，轴突穿过微通道，在轴突/胶质区形成仅含轴突的网络层。轴突均匀生长至全部六个轴突/胶质区，并于培养第14天将P1-2大鼠的少突胶质前体细胞接种至轴突/胶质区 体外 用于共培养。

我们开发了一种新型的多区室神经元共培养微系统平台，用于体外研究中枢神经系统中轴突与胶质细胞的相互作用。该平台能够并行开展多达六项独立实验，并采用新开发的宏/微混合制造方法加工而成。

我们介绍一种用于体外中枢神经系统轴突-胶质细胞相互作用研究的新型多区室神经元共培养微系统平台，可同时进行多达……

多区室微流控神经元共培养装置的制备始于使用铣床在PMMA块上加工储液池，随后通过热压成型将连接各区室的微通道阵列压印成型。当A-P-M-M-A模具制备完成后，以PMMA模具为模板复制出A-P-D-M-S模具母版，并涂覆三氯乙烯。最终装置由PDMS模具母版复制而成，并组装于经PDL包被的培养板上。将原代 E16 至 E18 大鼠神经元接种至胞体区，并培养两周，随后在轴突区内的轴突层上方加入 P1 至 P2 大鼠少突胶质细胞，进行共培养。大家好，我是来自德克萨斯农工大学电子与计算机工程系纳米生物系统实验室的 J Par。今天我们将向您展示一种多区室微流控神经元共培养平台的制备方法。我们在实验室中采用此方法体外研究中枢神经系统中神经元与胶质细胞的相互作用。现在开始操作。首先，使用微型铣床制作深度为3.5毫米的隔室。在 A-P-M-M-A 区段中，定义一个胞体区室和六个轴突生长锥区室。制备好区室后，进行超声处理，并用异丙醇处理 10 分钟以去除碎片；使用传统的光刻和湿法刻蚀工艺在玻璃片上制作微脊结构；将玻璃片上的微脊图案热压印到 PMMA 母模上；首先手动对准 PMMA 模具母模与玻璃基板。然后在热压机上将温度升至115摄氏度。当达到该温度后，施加0.5吨压力，持续5分钟。5分钟后，冷却至40摄氏度，然后释放压力。现在开始制备PDMS母模。按10:1的重量比将PDMS预聚物与其固化剂混合，将PMMA母模切割成50毫米×50毫米大小的块状。使用弯锯切割后，将其放入模具中，并将PDMS混合物倒在PMMA母模上，然后将模具置于连接真空泵和干燥器的真空干燥器中抽真空15分钟。为了去除PDMS混合过程中产生的气泡。待所有气泡完全去除后，将容器放入调平的85°C烘箱中加热一小时，进行聚合反应。PDMS完全固化后，将其从PMMA母模上剥离，将PDMS母模放入干燥器中，并加入两到三滴三氯乙烯，抽真空15分钟，对PDMS母模进行蒸镀处理。对PDMS母版进行涂层处理，有助于将最终的PDMS神经元共培养装置从PDMS母版模具中顺利脱模。涂层后，用异丙醇短暂冲洗PDMS母版，以去除过量的三氯乙烯，并用氮气吹干。PDMS聚合物制备神经元共培养装置的过程与前一节所述制备PDMS母版模具类似。首先按10:1的质量比将PDMS预聚物与遮光剂混合，然后将PDMS混合物倒在PDMS母版上方。注意不要倒入过多PDMS，以免完全浸没母版上3.5毫米高的PDMS结构。将DGA置于与真空泵相连的干燥器中抽真空15分钟。待所有气泡完全排出后，将PDMS放入已调至水平的85摄氏度烘箱中，加热聚合一小时。一小时后，从烘箱中取出PDMS，置于室温下冷却。随后小心地将PDMS神经元培养装置从PDMS母模上剥离下来。用对苯二甲醛包裹PDMS装置，以防止灰尘或碎屑污染。使用配备刀片的台钻将包裹好对苯二甲醛的PDMS切割成单个部件，神经元共培养PDMS装置即基本制备完成，可准备用于细胞培养板。在将神经元共培养PDMS装置放入细胞培养板之前，先将其置于等离子清洗仪中，用空气等离子体处理90秒，以使表面具有亲水性。此处理步骤将有助于在装置组装到多聚赖氨酸包被的培养板后，使培养基充分填充微通道。为对经等离子处理的装置进行灭菌，需将其浸入70%乙醇中30分钟，然后将容器转移至无菌生物安全柜中。30分钟后，取出装置，并用经0.2微米Millipore滤器过滤的氮气吹干。接下来，将干燥后的装置置于经多聚D-赖氨酸包被的聚苯乙烯六孔培养板上，并轻轻按压，以确保装置与培养板表面之间形成紧密密封。随后向胞体室中加入培养基。静置一至两分钟，确保微通道内无气泡残留。然后填充六个轴突胶质细胞区域。最后将装有培养基的装置放入37摄氏度培养箱中过夜培养，以去除任何可能的碎片或有毒残留物。过夜培养后，即可开始培养，准备将细胞接种到装置中。使用移液器吸取Soma和Axon隔室中的培养基。然后将40微升来自胚胎第16至18天大鼠的原代前脑神经元细胞以每平方毫米500个细胞的表面密度加入Soma隔室中，围绕微通道入口处接种。在加样过程中务必避免触碰PDMS装置，因为这可能导致装置与细胞培养板之间的密封破裂。这些显微图像显示了钙黄绿素染色的神经元细胞。在胞体区室内，细胞均匀加载并紧密地位于微流控通道附近。将载有细胞的装置置于37摄氏度培养箱中孵育30分钟，以增强细胞对基底的黏附。孵育结束后，用培养基充满所有腔室。将装置中的细胞置于37摄氏度、含5% CO2的湿润培养箱中培养，每三至四天仅更换一半培养基。在轴突-胶质细胞腔室内应形成致密的轴突网络。培养14天后，即体外培养两周时，在加载细胞前，向原代神经元CLIA细胞中加入适量试剂，从各室中吸出约60%的培养基；少突胶质细胞于出生后第一天至第二天从Sprague Dolly大鼠的大脑半球中分离获得。在每个轴突-胶质共培养室中加入5微升少突胶质细胞，使其密度达到每平方毫米1000个细胞。加载过程中需格外注意，移液时避免触碰底部基质，以免损伤已在基质上形成的轴突网络。加入少突胶质细胞后，将细胞在37摄氏度下孵育1小时，随后补满各室培养基。使用培养基继续培养神经元，方法与添加CLIA前相同，在接下来的两周内每三到四天更换一半的培养基，同时研究哺乳动物中枢神经系统。在实验操作得当的情况下，神经元细胞与胶质细胞的相互作用得以维持。神经元细胞被加载至胞体区室后，会靠近微通道入口处定位，而轴突层则开始在轴突-胶质区室内部形成。培养一周后，当接种少突胶质细胞时，若胞体区室内出现神经元细胞聚集现象，可能提示细胞状态不佳。神经元培养两周后，轴突区室应被致密的轴突层覆盖，此时可将少突胶质细胞接种于轴突层上方。我们刚刚向您展示了如何制备多区室神经胶质共培养平台，以及如何利用该平台在体外研究中枢神经系统中神经元与神经胶质细胞的相互作用。进行此操作时，重要的是要记住避免设备沾染灰尘，并且不要在乙醇中灭菌过长时间，以免影响其结合性能。就这些。感谢观看，并祝您的实验顺利成功。

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