Name: 从酵母细胞线粒体的纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学习从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中纯化线粒体的快速有效方法。该方案采用差速离心和蔗糖密度梯度离心技术，可获得高产量、高纯度且结构功能完整的线粒体，适用于细胞生物学和生物化学研究。

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本工作获得了加拿大卫生研究院（CIHR）和加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）的资助。V.I.T. 是 CIHR 新研究者奖获得者，以及康考迪亚大学基因组学、细胞生物学与衰老研究讲席。

材料与方法
酵母菌株及培养条件
野生型菌株 BY4742（MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）在富含培养基 YEPD（1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖）中培养。细胞在 30°C 条件下，以 200 rpm 的转速在锥形瓶中振荡培养，锥形瓶体积与培养基体积之比为 5:1。
粗线粒体组分的分离
<ol>
<li>培养野生型菌株BY4742 1 L，培养48小时。</li>
<li>将培养物倒入500 ml Nalgene离心管中。平衡后，在室温下以3000 × g离心5分钟收集细胞。</li>
<li>弃去上清液，将沉淀的细胞重悬于250 ml去离子水中。室温下以3000 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。</li>
<li>弃去上清液，将沉淀的细胞重悬于250 ml去离子水中。在室温下以3000 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。</li>
<li>测定细胞沉淀的湿重。</li>
<li>将沉淀的细胞重悬于DTT缓冲液中 [每克（湿重）细胞加入2 ml缓冲液]。</li>
<li>将细胞悬液转移至50 ml Falcon塑料管中。</li>
<li>在30°C下，以70 rpm的速度在摇床中旋转试管20分钟。 </li>
<li>室温下以3000 × g离心5分钟收集细胞。</li>
<li>在Zymolyase缓冲液中重悬沉淀的细胞 无 Zymolyase [每克（湿重）细胞加7 ml缓冲液]。</li>
<li>离心收集细胞，室温下3000 × g离心5分钟。 </li>
<li>在Zymolyase缓冲液中重悬沉淀的细胞 无 Zymolyase [每克（湿重）细胞加7 ml缓冲液]。</li>
<li>将细胞悬液转移至玻璃烧瓶中。 </li>
<li>将Zymolyase-100T粉末加入细胞悬液中［每克（湿重）细胞加入1 mg Zymolyase-100T］。</li>
<li>在30°C下，以70 rpm的转速在摇床中旋转含有细胞悬液的烧瓶30分钟。 </li>
<li>将经Zymolyase-100T消化细胞壁后形成的原生质球转移至50 ml塑料离心管中。</li>
<li>4°C 条件下，2200 × g 离心 8 分钟，沉淀球状体。</li>
</ol>
**所有后续步骤均应在 4°C 或冰上进行。应使用剪去尖端的移液管轻柔操作原生质球悬浮液，以避免破坏细胞器。**
<ol start="18">
<li>将沉淀的球状体重悬于冰上预冷的匀浆缓冲液中 [每克（湿重）细胞加入6.5 ml缓冲液]。</li>
<li>在4°C下以2200 × g离心8分钟，收集球状体沉淀。</li>
<li>将沉淀的球状体重悬于冰上预冷的匀浆缓冲液中 [每克（湿重）细胞加入6.5 ml缓冲液]。</li>
<li>将细胞转移至预先在冰上冷却的玻璃匀浆器中。</li>
<li>使用紧密适配的研杵，上下研磨15次以充分匀浆细胞。</li>
<li>加入等体积的冰上预冷的匀浆缓冲液。</li>
<li>将匀浆后的球状体转移至50 ml塑料离心管中。</li>
<li>在4°C下以1500 × g离心5分钟，去除未破裂的细胞、细胞核及大块碎片。</li>
<li>将所得上清液在4°C下以3000 × g离心5分钟。</li>
<li>将所得上清液在4°C下以12000 × g离心15分钟。</li>
<li>倾去上清液，将沉淀重悬于冰上预冷的匀浆缓冲液中 [每克（湿重）细胞加入6.5 ml缓冲液]。</li>
<li>在4°C下以3000 × g离心5分钟。</li>
<li>将所得上清液在4°C下以12000 × g离心15分钟。</li>
<li>倾去上清液，将沉淀重悬于3 ml冰上预冷的SEM缓冲液中。</li>
</ol>
**尽管该悬液富含线粒体，但也含有其他细胞器，如内质网（微粒体）、高尔基体和液泡。为了获得纯净的线粒体，可对该粗线粒体组分进行进一步分级分离，如下所述。**
分离不含其他细胞器污染的线粒体
<ol>
<li>将1.5 ml预冷至冰上的60% (w/v) 蔗糖溶液（溶于EM缓冲液）加入Beckman Ultra-Clear离心管中。</li>
<li>在60% (w/v) 蔗糖溶液上依次铺加4 ml 32%、1.5 ml 23%、1.5 ml 15%的蔗糖溶液（均为w/v，溶于EM缓冲液）。</li>
<li>将3 ml粗线粒体组分（溶于SEM缓冲液）小心铺加在15% (w/v) 蔗糖溶液上方。</li>
<li>在4°C条件下，使用Beckman SW41 Ti水平转子离心1小时，离心力为134000 × g（33000 rpm）。&nbsp; </li>
<li>完整的线粒体将在60%/32%蔗糖界面处形成一条棕色条带。</li>
<li>小心移除上方蔗糖溶液，直至暴露线粒体条带。</li>
<li>使用剪去尖端的移液枪头吸取线粒体条带，并将其转移至适用于MLS-5转子的Beckman离心管中。</li>
<li>用SEM缓冲液充满离心管。</li>
<li>在4°C条件下，使用MLS-5转子以10000 × g（31000 rpm）离心30分钟，沉淀纯化的线粒体。</li>
<li>使用移液枪小心吸弃上清液。</li>
<li>将纯化的线粒体用于线粒体功能、线粒体蛋白质组与脂质组以及线粒体DNA的分析。</li>
</ol>
试剂
<ol>
<li>DTT 缓冲液 [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9.4), 10 mM 二硫苏糖醇]（配制 15 ml）
<ul style="list-style-type:none;">
<li>1.5 ml 1 M Tris/H2SO4 缓冲液 (pH 9.4)</li>
<li>150 μl 1 M DTT</li>
<li>加水定容至 15 ml</li>
</ul>
</li>
<li>蜗牛酶缓冲液 [20 mM 磷酸钾 (pH 7.4), 1.2 M 山梨醇]（配制 100 ml）
<ul style="list-style-type:none;">
<li>2 ml 1 M 磷酸钾缓冲液 (pH 7.4)</li>
<li>60 ml 2 M 山梨醇</li>
<li>加水定容至 100 ml</li>
</ul>
</li>
<li>匀浆缓冲液 [10 mM Tris/HCl (pH 7.4), 0.6 M 山梨醇, 1 mM EDTA, 0.2% (w/v) BSA]（配制 250 ml）
<ul style="list-style-type:none;">
<li>2.5 ml 1 M Tris/HCl 缓冲液 (pH 7.4)</li>
<li>75 ml 2 M 山梨醇</li>
<li>500 μl 500 mM EDTA</li>
<li>0.5 g BSA</li>
<li>加水定容至 250 ml</li>
</ul>
</li>
<li>SEM 缓冲液 [10 mM MOPS/KOH (pH 7.2), 250 mM 蔗糖, 1 mM EDTA]（配制 250 ml）
<ul style="list-style-type:none;">
<li>2.5 ml 1 M MOPS/KOH 缓冲液 (pH 7.2)</li>
<li>31.25 ml 2 M 蔗糖</li>
<li>500 μl 500 mM EDTA</li>
<li>加水定容至 250 ml</li>
</ul>
</li>
<li>EM 缓冲液 [10 mM MOPS/KOH (pH 7.2), 1 mM EDTA]（配制 250 ml）
<ul style="list-style-type:none;">
<li>2.5 ml 1 M MOPS/KOH 缓冲液 (pH 7.2)</li>
<li>500 μl 500 mM EDTA</li>
<li>加水定容至 250 ml</li>
</ul>
</li>
</ol>

<ol><li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Biochemistry.</a> , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).</li>
<li>Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li>
<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &amp, Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li>
<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+more+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方法能够从酵母细胞中高效分离出高纯度的线粒体。通过该方法纯化的线粒体基本不含其他细胞器的污染，并在纯化后保持其结构和功能的完整性。所述方法获得的线粒体适用于无细胞体系中关键线粒体过程的重建。这些高纯度的线粒体还可用于线粒体结构与功能、线粒体蛋白质组和脂质组以及线粒体DNA的分析。

从酵母细胞中纯化线粒体

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

线粒体是真核非光合作用细胞在有氧代谢过程中产生ATP的主要场所1这些复杂的细胞器在细胞凋亡过程中也发挥着至关重要的作用2, 细胞存活率3, 哺乳动物发育4，神经元发育与功能4, 细胞内信号传导5，以及寿命调控6. 我们对这些由线粒体调控的复杂生物过程的理解，依赖于评估其形态、蛋白质和脂质组成、DNA 完整性以及其众多重要功能的可靠方法。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，一种基因组已注释、蛋白质组明确且可进行遗传和生化操作的单细胞真核生物，是研究线粒体基本生物学功能所涉及的分子与细胞机制的宝贵模型。对于此类研究而言，获得高纯度的线粒体至关重要。本文详细介绍了一种快速且高效的酵母线粒体纯化方法。该方法能够分离出高度纯净的线粒体，基本无其他细胞器污染，并在纯化后保持其结构和功能的完整性。通过该方法纯化的线粒体适用于无细胞体系中重建关键线粒体过程，可用于线粒体结构与功能、线粒体蛋白质组和脂质组以及线粒体DNA的分析。

我们介绍一种从酵母Saccharomyces cerevisiae中快速高效纯化线粒体的方法。该方法能够高产量地分离出几乎不含其他细胞器污染的纯净线粒体，且纯化后的线粒体保持其结构和功能的完整性。

线粒体是真核非光合作用细胞在有氧代谢过程中ATP生成的主要场所1。这些复杂的细胞器还参与……

本方案首先通过使用溶壁酶消化细胞壁将酵母细胞转化为原生质体，然后使用玻璃-聚四氟乙烯匀浆器对原生质体进行匀浆。将所得匀浆液进行两次离心，以沉淀未破碎的细胞、细胞核和大块碎片。接着，将所得上清液在12,000 ×g条件下离心15分钟，以沉淀线粒体。最后，将仍含有其他细胞器的粗线粒体组分在蔗糖密度梯度中以134,000 ×g离心60分钟，不含其他细胞器污染的纯净线粒体可于60%（重量/体积）与32%（重量/体积）蔗糖界面处回收。大家好，我是康考迪亚大学生物学系Vladimir Tko实验室的Christopher Greg博士。今天我将向大家演示如何从酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中分离线粒体。我们这样做是为了研究线粒体中发生的动态变化及与年龄相关的变化。随着细胞老化，我们将观察线粒体蛋白质组、脂质组以及DNA的变化。现在就开始吧。首先将酵母菌株在十个250毫升的锥形瓶中培养，每个锥形瓶中含有50毫升YP培养基，在30摄氏度下以旋转振荡培养48小时。随后，将培养物倒入500毫升Nalgene离心管中。将细胞在室温下以3000 ×g离心5分钟收集，倾去上清液，将沉淀的细胞重悬于250毫升蒸馏水中，于室温下以3000 ×g再次离心5分钟。重复此步骤：将沉淀的细胞重悬于250毫升蒸馏水中，离心5分钟。在室温下以3000 G离心，称量所得的湿细胞沉淀，然后将沉淀细胞重悬于DTT缓冲液中，并将细胞悬液转移至250毫升锥形瓶中。在30摄氏度下以70 RPM转速旋转摇动20分钟。20分钟后，在室温下以3000 G离心5分钟收集细胞，再将沉淀细胞重悬于不含Xs的Xs缓冲液中，再次离心5分钟。在室温下，以3000 G离心，用不含Xs的Zy缓冲液重悬沉淀的细胞，并将细胞悬液转移至玻璃烧瓶中。向细胞悬液中加入Zy liase 100 T粉末，于30摄氏度摇床中以70 RPM转速旋转30分钟，Zy liase 100 T将消化细胞壁以形成Sphero plats。在之前所示的X消化步骤之后的所有操作均应在4摄氏度或冰上进行。使用剪去尖端的移液枪头轻柔操作溅射物悬液，以避免细胞器破裂。完成30分钟XMO消化后，将Sphero溅射物转移至50毫升塑料离心管中，在4°C下以2200 ×g离心8分钟，然后将沉淀的S溅射物重新悬浮于预冷的匀浆缓冲液中，再次在4°C下以2200 ×g离心8分钟。将球形塑料颗粒重悬于冰上，使用冰冷的匀浆缓冲液，并将细胞转移至预冷的玻璃匀浆器中。用紧密的研杵以15次上下研磨动作匀浆细胞。向匀浆后的 S splats 中加入等体积的预冷匀浆缓冲液，并将其转移至 50 毫升塑料离心管中。在 4°C 条件下以 1500 × g 离心 5 分钟，使未破裂的细胞、细胞核和大块碎片沉淀。将所得上清液倒入新管中，再次离心 5 分钟。在4 °C、3000 ×g条件下离心。随后在4 °C、12,000 ×g条件下离心15分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于冰上。冷匀浆缓冲液离心。在4°C条件下，将重悬的沉淀以3000 × g离心五分钟。最后，将所得上清液在4°C条件下以12,000 × g离心15分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于三毫升预冷的冰浴缓冲液中。SEM 缓冲液。此悬浮液为粗线粒体组分。尽管其中富含线粒体，但也含有其他细胞器，如内质网、微粒体、高尔基体以及液泡酸性区室，需进一步纯化以获得纯净的线粒体。悬浮液将按照下一节所述进行进一步分级分离。为了开始对粗线粒体悬浮液进行分级分离以获得纯线粒体，取1.5毫升冰上预冷的、60%（重量/体积）蔗糖溶液加入EM缓冲液中，放入Beckman UltraClear离心管。接下来，将 60% 蔗糖溶液依次轻轻覆盖 4 毫升 32% 蔗糖溶液、1.5 毫升 23% 蔗糖溶液和 1.5 毫升 15% 蔗糖溶液（均为质量体积比，溶剂为 EM 缓冲液）。将 3 毫升粗线粒体组分（溶于 SEM 缓冲液）小心加在 15%（质量体积比）蔗糖溶液上方，使用 Beckman SW 41 Ti 摆桶转子在 4°C 条件下以 134,000 ×g 或 33,000 RPM 离心 1 小时。离心后，完整的线粒体会在60%至32%蔗糖界面处形成一条棕色条带。使用剪去尖端的移液管小心吸除蔗糖溶液，直至液面降至线粒体条带处，取出线粒体条带并转移至Beckman离心管中。对于MLS-5转子，用SEM缓冲液将离心管补满，通过在MLS-5转子中以10,000 ×g或31,000 rpm、4°C条件下离心30分钟沉淀纯化的线粒体，然后倾去上清液。现在可将这些纯化的线粒体用于线粒体功能、线粒体蛋白质组、脂质组以及线粒体DNA的分析。将左侧泳道中的粗线粒体组分和右侧泳道中通过蔗糖密度梯度离心法纯化的线粒体进行SDS-PAGE电泳，并使用针对多种细胞器蛋白标志物的抗体进行免疫印迹分析。通过PO1P和COX1P的免疫反应性证实两种样品中均存在线粒体；免疫印迹结果显示，粗线粒体组分中存在DP M1P、FO 13P和VPS 10P，分别代表内质网、溶酶体和高尔基体蛋白。相比之下，在纯化的线粒体中未检测到这些标志蛋白，证实该实验方案所获得的线粒体不含其他细胞器的污染。我们刚刚向您展示了如何从酵母酿酒酵母（sace visier）中分离线粒体。请记住，在进行该实验时，不要让细胞在zy lies 100 T中孵育超过半小时，否则可能会降解细胞中可能存在的膜蛋白或细胞器蛋白。这可能是由于试剂中存在蛋白酶所致。此外，在准备分离线粒体和蔗糖梯度时，可以在进行该步骤前将这些线粒体于-20摄氏度冷冻，待准备进行离心步骤时再将其解冻。以上就是全部内容。祝您的实验顺利。

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