Name: 微探针:操作和使用的局部表面处理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学习微流控探针的组装与校准方法，用于生物材料表面的局部处理与图案化。本视频演示MFP与倒置显微镜的对准流程，以及缓冲液中基底处理的关键步骤。

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本工作由魁北克自然与技术研究基金会、加拿大创新基金会和加拿大卫生研究院（CIHR）资助。

1. 探针头的微加工（该过程未在视频中展示）
<ol>
<li>A Si2直径四英寸的晶圆，525 &mu;微米厚，带有1 &mu;在厚度为 m 的热生长 SiO₂ 层上，以 4000 rpm 的转速旋涂光刻胶（PR）45 秒。 </li>
<li>晶圆在110°C下预烘50秒，然后通过包含所有元件（端口和微通道）的掩模曝光5秒，接着用去离子水显影并冲洗。 </li>
<li>未被覆盖的SiO2在1:7的缓冲氢氟酸（BHF）溶液中被蚀刻去除 &asymp;15 分钟（当基底出现去润湿现象，表明 SiO2 刻蚀已完成）。使用 O2 等离子体或丙酮去除残留的光刻胶。 </li>
<li>第二层光刻胶以1500 rpm转速旋涂45秒，形成较厚的覆盖层 &asymp;10 &mu;m [31]。该光刻胶层下方的SiO2图案仍可见，用于将晶圆与仅包含通孔的第二块掩模进行对准。 </li>
<li>PR曝光并显影后，将晶圆冲洗、干燥，并在95°C下后烘20分钟。 </li>
<li>将硅晶圆用熔化的白蜡固定在支撑晶圆上，以保护卡盘。 </li>
<li>采用电感耦合等离子体（ICP）深反应离子刻蚀（DRIE）将光刻胶和嵌入的SiO2图形转移到晶圆表面形貌，该过程分为三个步骤：<ol>
<li>DRIE 刻蚀以制备&asymp;500&mu;mdeep 刻蚀进入 Si（图形由厚的光刻胶定义）。</li>
<li>在不将晶圆从DRIE设备卸下的情况下，使用等离子体灰化去除光刻胶。</li>
<li>暴露的SiO2图形作为第二次干法刻蚀工艺的掩模，形成50 &mu;m 深的通道，并通过晶圆打开填充和排气口。卸载后，在温水流下将支撑晶圆剥离。随后用丙酮、乙醇和去离子水清洗微加工晶圆。</li>
</ol></li>
<li>单个MFP芯片被切割分离。</li>
<li>通过将聚二甲基硅氧烷（PDMS）浇铸至微模具中制备PDMS接口块，该微模具由两个结构化的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）元件、一个作为底部的抛光钢板以及两根毛细管组成；毛细管分别插入钢板上的两个通孔（即接入孔）中，用于预留流体连接孔的位置。PDMS在60°C烘箱中固化，时间不少于1小时。 </li>
<li>将PDMS块与切割好的MFP硅芯片通过空气等离子体处理进行键合：在1 mbar气压下，230 W功率处理24秒，随后使用自制的机械对准装置将两部分贴合。</li>
<li>将组装件置于60°C烘箱中孵育至少1小时以完成结合</li>
</ol>
2. MFP 的组装
<ol>
<li>使用塑料注射器和针头将适当的试剂注入气密性玻璃注射器中，确保无气泡存在。通常，我们使用 1–10 微升的注射器进行进样，使用体积大 5–10 倍的注射器进行吸液。</li>
<li>使用死体积低的 Nanotight 接头将注射器连接至毛细管。</li>
<li>在显微镜下填充毛细管并检查是否存在气泡。</li>
<li>在连接毛细管前，先用缓冲液预填充 MFP 芯片，以防止气泡滞留。</li>
<li>将毛细管插入探头头部的 PDMS 连接件中。</li>
</ol>
3. 微流体探针（MFP）的设置
<ol>
<li>将探针头夹紧在探针支架中，并安装在倒置显微镜上方的探针台上。</li>
<li>将注射器放入高精度注射泵中。</li>
<li>将基底（如玻璃载片）插入固定于显微镜载物台上的自制夹持器中。</li>
<li>通过观察当微流体探针（MFP）与基底接触时出现的牛顿环（干涉条纹），利用一对测角仪调节MFP台面与基底之间的平行度。接触点及条纹频率可指示倾斜程度。当MFP与表面对准时，单个干涉环将扩展至整个表面。该方法也可用于校准MFP与基底之间的间距。</li>
<li>MFP与基底之间的间隙对于表面图案化过程至关重要。由于基底需在MFP下方扫描进行处理，因此必须以微米级精度调整水平对准，该对准通过由三个微米螺钉构成的三点支撑来实现。</li>
</ol>
4. 微流体探针（MFP）的操作
<ol>
<li>通过 LabView 软件控制分配过程。设备操作可通过肉眼和 CCD 相机进行观察。注入与吸取的比例根据试剂在周围缓冲液中的扩散性以及所需的几何流型，可在 1:3 至 1:10 之间调整。</li>
<li>&nbsp;为检查吸取注射器是否正常工作以及是否存在气泡，应在开始正式吸取前，先使用吸取注射器注入液体。</li>
<li>开始注入液体，并监测液流情况以及微珠或荧光示踪染料的局限性。</li>
<li>根据具体应用使用探针，例如在表面扫描以进行沉积、刻蚀或对表面或细胞进行染色处理。</li>
</ol>

<ol><li>Juncker, D., Schmid, H., Delamarche, E. Nature Materials. 4 (8), 622-622 (2005).</li>
</ol>

微流控探针（MFP）具有多功能性，因为它（i）可移动，（ii）可适应不同类型的试剂和基底，并且（iii）可在大范围内操作。
不需要的气泡可能导致流动中断。为避免气泡产生，所有组件在组装前必须预先充满液体。&nbsp;探针与表面之间的间隙仅有几微米，而台面宽度则达数百微米，扫描距离可达厘米量级。因此，必须仔细调节被扫描表面的水平度，以及MFP台面与基底之间的平行度。最后，抽吸与注入的比率必须足够大，以确保捕获注入MFP与基底间隙中的全部试剂。
MFP 可用于在温和条件下对蛋白质进行表面图案化，处理浸没在生理缓冲液中的组织或&nbsp;单个细胞，或在表面上蚀刻出图案。

<table><tbody><tr><td>微流控连接器</td><td>Upchurch Scientific</td><td>微流和纳流接头及套管</td><td></td></tr><tr><td>双组分手动分配器</td><td>Conprotec Inc.</td><td>DM400</td><td>用于分配和混合PDMS混合物</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td>版本 8.0</td><td></td></tr><tr><td>机械对流烘箱</td><td>VWR international</td><td>1330FM</td><td></td></tr><tr><td>玻璃注射器</td><td>Hamilton Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>毛细管</td><td>Polymicro Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>等离子体腔室</td><td>Tegal Corporation</td><td>Plasmaline 415</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000-E</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Cetoni</td><td>neMESYS</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 Sil Elast Kit</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Photometrics</td><td>QuantEM 512SC</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载物台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微流控探针支架测角仪</td><td>Melles Griot</td><td>07GON504</td><td></td></tr><tr><td>线性位移台</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>LS-50</td><td>用于MFP的z轴控制</td></tr><tr><td>手动线性位移台</td><td>Newport Corp.</td><td>443-4 系列</td><td>用于MFP的x轴和y轴控制</td></tr><tr><td>显微镜载物台</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>PZ-2000</td><td>具备x、y和z轴控制功能</td></tr></tbody></table>

微流体探针：操作及其在局部表面处理中的应用

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

微流控装置可利用极微量的样品进行检测，并已逐渐用于控制细胞的微环境。微流控技术通常与封闭的微通道相关，这限制了其应用范围，仅适用于可被引入并在有限空间内进行培养（针对细胞而言）的样品。另一方面，微移液系统已被用于对细胞和表面进行局部灌注，特别是采用推-拉装置，其中一个移液管作为流体来源，另一个作为流体接收端，但该方法在三维空间中难以实现流动的精确限制。此外，移液管易碎且定位困难，因此通常仅用于静态配置。 
微流控探针（MFP）突破了封闭式微流控通道结构所带来的限制，无需将样品封闭于微流控系统内部，而是可通过MFP直接将微流体流送至样品表面，并在样品上进行扫描。注射口与抽吸口之间的距离仅有数十微米，使得注入间隙中的微射流受到周围液体的流体动力学作用而被限制，并完全从另一开口被抽吸回收。该微射流可在基底表面平移冲洗，为试剂的局部沉积/递送提供了精确工具，通过探针在表面扫描，可实现大范围区域的操作。 
在本视频中，我们介绍微流控探针1（MFP），详细说明如何组装MFP，将其安装在倒置显微镜上，并相对于基底表面进行对准，最后展示如何利用它处理浸没在缓冲液中的基底表面。

在本视频中，我们介绍微流控探针1（MFP）。我们将详细说明如何组装MFP，将其安装在倒置显微镜上，并相对于基底表面进行对准，最后展示如何利用它在缓冲溶液中处理基底表面。

微流控装置可利用极少量的样品进行检测，并已逐渐被用于控制细胞的微环境。

本实验流程展示了如何组装和使用微流控探针（MFP）。MFP的微流控组件包括气密性注射器、玻璃毛细管、Upchurch公司的微紧固接头以及MFP探针头。本视频将介绍组装和对准过程中的关键步骤。组装完成后，MFP 可与多种基底和试剂联用，用于表面图案化与加工。大家好，我是 Cecil Perot。我是加拿大蒙特利尔麦吉尔大学生物医学工程系 David Yaker 实验室的一名博士后研究员。大家好，我是Mohammad Kasime，我在麦吉尔大学生物医学工程系David Y的实验室攻读博士学位。大家好，我是David Yoker。我是生物医学工程系的一名助理教授，今天很高兴向您介绍微流控探针的演示。我们将向您展示微流控探针的操作与使用流程。在我们的实验室中，该流程用于表面处理与图案化。现在开始本实验方案。使用塑料注射器和针头将试剂注入气密型玻璃注射器中，并确保其中无气泡存在。通常，我们使用1至10微升的注射器进行进样，而用体积大5至10倍的注射器进行抽吸。接下来，使用低死体积的纳米紧固接头将注射器连接至毛细管。然后在显微镜下检查毛细管是否充满液体并观察是否存在气泡。在连接毛细管之前，需预先用缓冲液充满MFP芯片，以防止气泡滞留。最后，将毛细管插入微加工制成的探头头部的PDMS连接部件中。多功能探针（MFP）组装完成后，即可开始进行设置。将基底插入自制的夹持装置中。固定在显微镜载物台上。微流体探针（MFP）与基底之间的间隙对于表面图案化过程至关重要。通过微米调节螺钉形成的三点支撑，以微米级精度调节水平对准。这是必要的，因为基底需要在MFP下方扫描进行处理。开始设置MFP时，先将探针头夹紧在探针支架中，并安装在倒置显微镜上方的探针台上。然后将注射器放入高精度注射泵中。接下来，使用一对测角仪，通过观察牛顿环（也称为干涉条纹）来调整微针探针（MFP）的台面与基底的对准情况。当MFP与基底接触时会出现这些条纹，接触点及条纹的频率可反映倾斜程度。当MFP与表面完全对准时，会形成一个覆盖整个表面的单一干涉环。该步骤还可用于校准微流体探针（MFP）与基底之间的间距。完成MFP的设置后，我们即可进入MFP的操作阶段。在MFP运行过程中， dispensing操作由LabVIEW软件控制。通过肉眼和CCD相机观察设备运行情况。在开始正式抽吸之前，先注入少量液体，以确保抽吸注射器方向正确且无气泡。然后将MFP浸入缓冲液中。现在可以开始注入液体，同时监测微珠的流动限制情况。注入与吸液的比例根据试剂在周围缓冲液中的扩散性以及所需的几何流动模式，从1:3到1:10不等。最后，该探针现在可用于多种应用。此处所示的表面图案是通过MFP在链霉亲和素包被的水凝胶玻璃载片上使用荧光素标记的生物素实现的。注射流速为每秒一纳升，抽吸流速为每秒十纳升，分别使用10微升和50微升的注射器。表面与探针之间的间距为五微米。微流探针（MFP）还可用于细胞和组织的局部染色与处理。流动限制可防止试剂扩散，从而实现对细胞的精确化学染色。如下图所示，使用浓度为100微克/毫升的dai对一层成纤维细胞进行了染色。我们已经向您展示了如何操作微流控探针。在进行此操作时，您必须确保系统中避免产生任何气泡，并确保微流控探针表面与基底平行。就这些。感谢观看，祝您的实验顺利。

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科研

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生物学

微探针：操作和使用的局部表面处理

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