Name: 组织有针对性的胚胎嵌合体:斑马鱼原肠胚细胞移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-11T16:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 57 s
Description: 学习斑马鱼原肠胚细胞移植技术，通过荧光标记和显微操作创建组织特异性嵌合体胚胎。该方法结合遗传学与胚胎学，用于研究前脑连合形成过程中的星形胶质细胞功能及轴突-胶质相互作用。

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我们感谢Barresi实验室成员对本手稿的支持和有益的建议。感谢Alexander Workman持续提供的技术支持，以及动物护理人员在维护史密斯学院斑马鱼种群方面给予的帮助。同时感谢Mike Hallacy、Rudi Rottenfusser和Carl Zeiss Microimaging出借部分显微成像设备用于本实验方案的拍摄。本研究工作得到了美国国家科学基金会（N.S.F.）资助的研究项目（编号0615594）的支持。

第1部分：Alexa 594标记的胚胎
1.1 显微注射板和注射针的制备
<ol>
 <li>制备显微注射板
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>采用 Westerfield（2007）1 描述的方法，制备包含三至五个1毫米槽道的琼脂糖模具作为注射板。这些槽道可紧密排列胚胎，便于高效、系统地进行显微注射。在制板前，取三根直径1毫米、长4英寸且无内丝的毛细管，小心将其折成两半。使用超级胶水将其中两根2英寸长的毛细管并排粘在平坦表面上，再将第三根毛细管嵌入其间的凹槽中并粘合在上方，形成由三根毛细管构成的金字塔形结构。待其干燥后重复此步骤，直至制备出足够数量的“槽道模具”。</li>
 <li>将20–25 mL熔融的1.5%琼脂糖（以胚胎培养基（EM）配制，含5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4和0.00003%亚甲蓝），深度约5 mm）倒入100 mm培养皿中。立即将先前制备好的三至五个金字塔形槽道模具放置于培养皿底部，确保模具的平面一侧紧贴培养皿底部，并完全被琼脂糖覆盖。</li>
 <li>待琼脂糖完全凝固后，需取出玻璃毛细管模具。取出时，先将包含三个毛细管模具的琼脂糖区域切割成大方块。轻轻去除方块边缘的琼脂并弃去。将该琼脂糖方块翻转，用精细镊子彻底移除槽道模具。随后将熔融琼脂糖倒入培养皿中，围绕该方块填充，以固定新形成的孔槽。静置凝固。制备好的注射板可用封口膜密封，于4 °C保存数周。若琼脂中出现任何微生物生长迹象，应立即丢弃。</li>
 </ol></li>
 <li>显微注射用针头
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>使用微量移液器毛细管拉制仪，将直径1毫米、长4英寸且带内丝的玻璃毛细管拉制成所需的注射针头。针头拉制可采用Flamming/Brown微量移液器拉制仪，设定加热温度为550，拉力为120，速度为200，时间/延迟为200。</li>
</ol></li>
</ol>
1.2 胚胎收集与显微注射装置的设置
<ol>
 <li>受精卵在产出后应立即收集，并置于盛有 EM 的培养皿中维持。荧光葡聚糖的最佳注射时期为单细胞期，最迟应在16细胞期之前完成2。</li>
 <li>使用宽口玻璃移液管将胚胎转移至室温下盛有 EM 的注射板孔中。用闭合的钝头镊子轻轻将胚胎楔入槽底。若胚胎的绒毛膜或卵黄受损，应予以弃用。</li>
 <li>用1–2μl稀释的荧光Alexa 594溶液（5% 质量浓度溶于0.2 M KCl）填充注射针。由于注射针内部沿全长分布有嵌入式细丝，荧光葡聚糖可通过毛细作用移至针尖。</li>
 <li>将注射针连接至立体定位显微操作仪的毛细管固定装置上。</li>
 <li>调节显微注射装置的压力，初始设定为40–50 Psi，脉冲持续时间为500 msec。</li>
 <li>轻轻用镊子刮擦注射针尖以打破密封（理想直径为0.05–0.15 mm）。在体视显微镜下，将葡聚糖排出至覆盖有矿物油的微米尺上，以校准针头。通过调节气压、脉冲持续时间及针尖大小来调整注射体积。整个注射过程中应保持每次注射体积为0.8–1 nl3。注射针尖常会被卵黄颗粒堵塞；调整压力或重新折断针尖可缓解此问题，否则必须更换新的注射针。</li>
</ol>
1.3 荧光 Alexa 594 的显微注射
<ol>
 <li>在高倍镜下，从槽的一端开始，平稳地刺穿胚胎的绒毛膜和细胞膜，进入卵黄。将葡聚糖溶液注射到细胞正下方。确保以与进入时相同的平滑动作将注射针抽出。移动培养皿，使下一个胚胎对准位置，继续沿槽逐个注射。定期检查压力和注射体积。当注射针位于胚胎内部时，切勿移动或弯曲针头，以免致命性损伤胚胎和/或折断注射针。</li>
 <li>用镊子轻轻将胚胎从槽中推出。将其转移至一个盛有抗生素青霉素/链霉素胚胎培养液（Pen/Step EM）的培养皿中，培养液配制方法如 Nusslein-Volhard 和 Dahm（2002）所述（6.5 M CaCl2 1 ml，3.5 M NaHCO3 1 ml，20x EM 25 ml，以及 60 mg/ml 青霉素和 100 mg/ml 链霉素储备液各 10 ml），为后续移植做准备。将胚胎在 28.5 °C 下孵育，并监测未受精卵或胚胎死亡情况。</li>
</ol>
第2部分：原肠胚阶段移植
2.1 脱绒毛膜及移植板制备
<ol>
 <li>去壳板。尚未完成外包的去壳胚胎需要使用软底培养板，以避免卵黄粘附在塑料表面并发生撕裂。在移植前一天，使用前述的1.5%琼脂糖溶液，将5–10 mL熔化的琼脂糖倒入100 mm培养皿中制备去壳板。仅需2–3 mm的薄层琼脂糖即可在去壳过程中为胚胎提供缓冲。静置冷却。</li>
 <li>移植板。需按文献4所述方法制备带有分隔小室的专用培养板。将30 mL的1.5%琼脂糖溶液倒入100 mm培养皿中，并插入移植小室模具。该模具应包含104个三角形凹槽，每个凹槽由三个90度边和一个45度斜边组成。这些小室设计用于并排容纳两个胚胎（图1A，紫色框）。放置模具时应注意避免其下方困住气泡。待琼脂糖凝固后移除模具，即可露出一个带有方形小室且边缘呈斜坡状的凹陷区域。</li>
</ol>
2.2 胚胎与移植装置的准备
<ol><li>供体与受体胚胎的定位
<ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>需要监测受体和供体胚胎的发育情况，以保持接近匹配的年龄配对。为此，可将胚胎在不同温度（25–31 °C）下培养，分别减缓或加速其发育。</li>
 <li>供体和受体胚胎均应在预定时间前1小时，在琼脂包被的去壳板上手工去壳。若进行原肠胚阶段的移植，则需在5 hpf前完成此步骤。</li>
 <li>在盾牌期之前（5.5 hpf），将受体和供体胚胎加载到装有抗生素EM的移植板中。使用玻璃移液管将胚胎逐个装入直径1 mm的孔中。示例如下：第一行放置供体胚胎（共18个，每孔2个胚胎），接下来两行放置受体胚胎（每孔1个胚胎，每行9个胚胎）。</li>
</ol></li>
<li>移植装置的准备
<ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>移植操作在Zeiss Lumar荧光体视显微镜上进行，该显微镜具备全自动、操纵杆控制的变焦和调焦功能。虽然移植操作可在无此自动化功能的显微镜下完成，但该功能显著提高了操作的便捷性和效率，尤其在需要进行大量移植时更为明显。</li>
 <li>将Eppendorf AirTram 设置在其刻度的中间位置。将 AirTram（图1A，红色框）的管路连接至毛细管固定器，并将固定器固定在Eppendorf自动显微操作仪（图1A）上。该显微操作仪为全自动、操纵杆控制。尽管此自动化并非完全必需，但能显著提升针头在胚胎周围及内部移动的操控能力。此外，许多研究人员更偏好使用据称能提供更平滑细胞吸取控制的 OilTram；然而，我们在使用 AirTram 时未遇到任何困难。</li>
 <li>所用毛细管为无菌Eppendorf TransferTips (ES)，其尖端具有15 µm斜面开口，且在距尖端1 mm处有20度弯曲角（图1A绿色框）。</li>
</ol></li>
</ol>
2.3 原肠胚阶段细胞移植
<ol>
 <li>在6小时pf时，使用显微操作仪轻轻用毛细管尖端触碰胚胎，使其旋转至适合细胞提取的位置，确保胚胎的中线和盾区可见，并朝向毛细管尖端的对侧。吸取少量胚胎培养基（EM）进入毛细管，以防止细胞接触气-液界面，避免细胞受损。</li>
 <li>根据斑马鱼命运图谱，若要将细胞靶向移植至前脑，需将供体胚胎（罗丹明注射或GFP转基因胚胎）在动物极与盾区正中间的中线位置进行移植5。在此位置轻轻刺破供体胚胎的外胚层。原肠胚期外胚层与下方卵黄之间的细胞层较薄，因此需小心避免刺入卵黄，否则常导致数小时内胚胎死亡。使用AirTram缓慢将细胞吸入毛细管中，始终确保水线清晰可见。毛细管尖端在供体胚胎内轻微晃动有助于松动细胞间的连接。应在将毛细管移出供体胚胎前，吸取约10–50个细胞。</li>
 <li>将毛细管从供体胚胎中取出，以相似方式调整受体胚胎方向，并将细胞注入受体胚胎动物极与盾区之间完全相同的位置。</li>
 <li>移植完成后，将供体与受体胚胎从移植孔中取出，分离后轻柔地转移至含有抗生素EM的琼脂包被培养皿中。长时间将胚胎留在移植孔中会增加死亡率。于28.5 °C条件下培养胚胎。</li>
</ol>
2.4 胚胎的观察与成像
<ol><li>固定胚胎和活胚胎的制备。
<ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>来源于转基因GFP或罗丹明注射胚胎的宿主胚胎，可进行活体成像或固定后成像。本文提供了固定和活体成像的示例。固定胚胎在30 hpf时用4%多聚甲醛溶于0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）中，在4 °C下固定过夜1。</li>
 <li>用0.1 M PB将胚胎漂洗2次，随后洗涤3次，每次5分钟。</li>
 <li>在本示例中，固定后的宿主胚胎使用抗乙酰化微管蛋白（α-AT）抗体对所有轴突进行免疫标记，方法如前所述6。</li>
 <li>将胚胎置于75%甘油中，室温下沉降，随后在4 °C保存。</li>
 <li>准备载玻片以固定两个胚胎。在载玻片上用石蜡油绘制两个正方形轮廓，使其内侧形状和直径与正方形盖玻片相匹配。</li>
 <li>去除胚胎的卵黄，若需观察前脑的正面结构，可沿中脑垂直切断以分离前脑。将组织置于石蜡油凹槽内，仅保留少量甘油。调整组织至合适位置，并在样本上加盖盖玻片。</li>
 <li>活体样本被固定于含4%三卡因（Tricaine）的EM溶液配制的0.75%琼脂糖溶液中，置于玻璃底培养皿上。在琼脂糖凝固前，使用钨针调整胚胎位置，以确保成像时方向正确。在我们的分析中，前脑被直接贴附于盖玻片下方。</li>
</ol></li>
<li>成像
<ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>固定和活体宿主均使用Leica SP5激光扫描共聚焦显微镜进行成像。获取Z轴层扫图像，并使用Volocity软件完成三维或四维图像处理。</li>
</ol></li></ol>
结果：
为了研究星形胶质细胞在前脑中的作用，有必要对这些细胞进行可视化，并将不同的遗传操作靶向间脑和端脑中的小细胞簇。为了产生这类嵌合胚胎（其中胚胎内部分星形胶质细胞群体在基因型或表型上存在差异），我们采用了一种多方面的策略，结合使用标记星形胶质细胞的GFP转基因胚胎与原肠胚期细胞移植技术。为了特异性地将克隆靶向间脑区域，我们利用斑马鱼原肠胚的命运图谱，选择性地从动物极与盾区中点处的中线位置提取细胞5（图1B）。将这些提取的tg[gfap:gfp]细胞移植到野生型宿主原肠胚的相同位置，随后将胚胎培养至30小时（30hpf），并用抗所有轴突的抗体（α-乙酰化微管蛋白）进行免疫标记，作为前脑解剖结构的参考标志。如本例所示，对一个宿主胚胎进行共聚焦成像，可观察到GFP阳性细胞广泛分布于端脑和间脑中（图2A）。在此克隆分析中可清晰观察到这些GFP阳性细胞的完整形态，显示大多数细胞呈现典型的放射状胶质细胞形态，其胞体位于室管膜区附近，而放射状突起的末端膨大终止于软脑膜表面（图2A，插图）。对采集的光学切片进行Z轴三维重建，可清晰显示这些细胞相对于标记轴突的位置关系（影片1）。
另一种常用于可视化移植细胞的方法是，首先将荧光细胞谱系染料（如Alexa 594）显微注射到单细胞期的野生型或GFP转基因胚胎的卵黄中。例如，我们在单细胞期将Alexa 594注射到野生型胚胎中，随后让其发育至盾牌期原肠胚，然后进行如上所述的前脑靶向移植，但此次移植至tg[gfap:nuc-gfp]转基因宿主原肠胚中。通过激光扫描共聚焦显微镜对端脑背侧进行成像，可在前脑的GFP+细胞核中观察到呈荧光红色的供体细胞簇（图2B）。我们进一步对这一宿主进行分析，使用激光扫描共聚焦显微镜每隔三分钟采集一次Z轴层扫图像，持续两小时。Volocity软件（Improvision）对这一时间序列进行的四维重建显示了罗丹明标记的细胞膜与GFP+细胞核的动态细胞运动（影片2）。<img border="0" src="/files/ftp_upload/1422/1422fig1tmb.jpg" alt="用于细胞成像的激光扫描显微镜装置；胚胎细胞移植过程示意图。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1422/1422fig1.jpg">点击此处查看图1的放大版本。</a> 图1：移植装置及实验方法示意图。A) 用于进行原肠胚期移植的装置。使用蔡司Lumar荧光体视显微镜进行此类移植操作。该显微镜通过操纵杆控制焦距和变焦（左红色圆圈）。Transferman NK用于调节毛细管的位置，同样由操纵杆控制（右红色圆圈）。在准备过程中，将60-80个胚胎分别放入事先用塑料模具在100 mm培养皿中制备的琼脂小孔内（紫色轮廓框）。移植用毛细管（由Eppendorf公司生产的TransferTip）具有15 μm的内径开口和20度倾斜角度的尖端（绿色轮廓框）。细胞的吸取由Eppendorf的AirTram装置控制（红色轮廓框）。B) 原肠胚期将细胞从供体胚胎移植至受体胚胎的操作示意图。细胞来源于tg[gfap:GFP]胚胎（图中所示）或注射了Alexa 594（如实验方案所述）的供体胚胎。细胞从盾板与动物极之间中线位置取出，并移植到受体胚胎的相同区域。受体胚胎经固定后，采用激光扫描共聚焦显微镜进行成像。<img border="0" src="/files/ftp_upload/1422/1422fig2tmb.jpg" alt="荧光显微镜图像，神经组织分析，α-AT，gfp:GFP标记，Alexa 594，细胞研究。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1422/1422fig2.jpg">请点击此处查看图2的放大版本。</a> 图2. 斑马鱼前脑原肠胚阶段移植示例。 A) 野生型宿主胚胎的额面观，其间脑和端脑（斑马鱼前脑）中移植了tg[gfap:gfp]细胞。轴突以红色标记（α-乙酰化微管蛋白抗体），移植的细胞以绿色标记（内源性GFP表达）。胚胎发育至30 hpf。插图显示GFP阳性细胞的放射状胶质形态。B) 活体tg[gfap:nuc-GFP]宿主胚胎端脑的背侧观，移植细胞呈现罗丹明荧光（红色）。宿主胚胎的细胞核以绿色标记（GFP）。虚线勾勒出前脑的前表面，实线表示室管膜区。比例尺为10μm。
视频1. 前脑联合纤维中异位标记的放射状胶质细胞之间的关系。 将囊胚期 tg[gfap:GFP] 胚胎的细胞移植到非GFP转基因的野生型品系中。通过激光共聚焦显微镜采集Z轴层扫图像，随后使用 Volocity 软件进行三维重建。图像最初显示的是30小时受精后（30hpf）斑马鱼前脑的额面视图，与图2B相比进行了水平翻转。可见前联合（AC，上方）和视后联合（POC，下方）中的轴突（抗乙酰化微管蛋白染色，红色）。绿色细胞为GFP阳性移植细胞，它们在前脑定植并呈现出典型的放射状胶质细胞形态。随着视频播放，画面逐渐聚焦于两个具有终足并接触POC的放射状胶质细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1422/Deschene&amp;BarresiMovie1.mov"> 点击此处下载视频1。</a>
视频 2. 前脑中移植的 Alexa 594 标记细胞的延时成像。来自先前注射了 Alexa 594 的原肠胚的细胞被移植到 tg[gfap:nuc-gfp] 转基因胚胎中。该视频展示了一个持续 2 小时的时间序列的三维投影，每 5 分钟采集一次 Z 层扫描图像。Z 层扫描数据通过激光扫描共聚焦显微镜获取，并使用 Volocity 软件完成四维重建。移植的细胞以 Alexa 594 标记（红色），GFP 阳性细胞核呈绿色。在该延时视频播放过程中，四维图像从 30 小时受精后（hpf）前脑的背侧视图开始，并围绕 X 轴旋转，可清晰观察到所有移植细胞的细胞膜以及 GFP 阳性细胞核均发生移动。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1422/Deschene&amp;BarresiMovie2.mov"> 点击此处下载视频 2。</a>

<ol><li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 5th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).</li>
<li>Zebrafish A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. ed , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li>
<li>Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. Zebrafish, a practical approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. ed 1, Oxford University Press. 121-121 (2002).</li>
<li>Woo, K., Shih, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+maps+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Fate maps of the zebrafish embryo.</a> Curr Opin Genet Dev. 5 (4), 439-439 (1995).</li>
<li>Barresi, M. J., Hutson, L. D., Chien, C. B., Karlstrom, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+regulated+Slit+expression+determines+commissure+and+glial+cell+position+in+the+zebrafish+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog regulated Slit expression determines commissure and glial cell position in the zebrafish forebrain.</a> Development. 132 (16), 3643-3643 (2005).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75 (5), 551-551 (1997).</li>
<li>Halloran, M. C., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Development. 127 (9), 1953-1953 (2000).</li>
<li>Hardy, M. E., Ross, L. V., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+gene+misexpression+in+zebrafish+embryos+induced+by+local+heat+shock+using+a+modified+soldering+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Focal gene misexpression in zebrafish embryos induced by local heat shock using a modified soldering iron.</a> Dev Dyn. 236 (11), 3071-3071 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

构建嵌合胚胎是一种强大的工具，可用于解决多种模式系统中的诸多研究问题，这些模式系统主要包括果蝇（D. melanogaster）、线虫（C. elegans）、斑马鱼（D. rerio）和小鼠（M. musculus）。我们认为，斑马鱼模型系统在生成嵌合体方面具有独特优势，操作相对简便、快速且灵活多样。斑马鱼是一种体外发育的脊椎动物，相较于小鼠模型，其可及性显著更高。此外，斑马鱼的体型明显大于果蝇或线虫，这使得胚胎操作（例如细胞移植）更为简便。同时，将细胞移植技术与转基因技术相结合，能够开展多种实验，实现基因功能在特定组织局部的精确调控。例如，利用少量表达GFP或罗丹明标记的细胞克隆，可以完整表征单个细胞的形态，而这些形态在纯合转基因供体中常常难以分辨，或因常用抗体导致的亚细胞结构标记差异而无法观察。此外，通过使用转基因标记或荧光染料填充的细胞，我们能够在活体斑马鱼胚胎中长期追踪供体细胞的动态行为。对单个细胞进行延时成像，为在整体生物背景下分析细胞行为提供了全新的研究手段。
本实验室还将热激诱导型转基因品系与细胞移植技术相结合，使得在提高培养温度后，供体细胞中特定的轴突导向信号分子可被异常表达（数据未显示）。该技术是一种极为强大且直接的方法，能够以空间和时间特异性的方式在局部异常表达目标蛋白，从而让我们观察该特定蛋白对发育过程的影响。在本研究中，该技术有助于进一步揭示Slit-Robo导向信号在调控联合纤维和中线胶质细胞定位中的功能5。
其他局部异常表达基因的方法，例如局部紫外线解笼（focal UV uncaging）和局部热激工具（激光或电烙铁），确实提供了在少量细胞簇中调控基因和标记物表达的替代手段7-9；然而，细胞移植所建立的最终分析环境不受紫外线、激光或热损伤所引起的创伤干扰，使细胞移植成为一种更为可控的实验方法。总之，我们发现细胞移植技术是我们神经发育生物学研究中的关键组成部分。产生具有不同特性的细胞克隆，是发育生物学家研究细胞行为、基因功能及细胞自主性等基本问题的重要工具。

<table><tbody><tr><td>培养皿</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td>100 × 15 mm</td></tr><tr><td>玻璃底培养板</td><td>工具</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-2.0-C</td><td>35 × 15 mm，1.5号盖玻片，未包被，γ射线灭菌</td></tr><tr><td>宽口玻璃巴斯德吸管</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>63A-53-WT</td><td> </td></tr><tr><td>用于槽模（无纤丝）和注射针（带纤丝）的玻璃毛细管</td><td>工具</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150F-4</td><td>4英寸（100 mm），外径/内径1.5 / 0.84 mm</td></tr><tr><td>移植毛细管（TransferTip）</td><td>工具</td><td>Eppendorf</td><td>83000122-8</td><td>IV型，无菌，内径15&amp;#x03BC;m；20度弯曲</td></tr><tr><td>移植模具</td><td>工具</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>PT-1</td><td>含150个三角形凹槽，用于固定单个胚胎</td></tr><tr><td>琼脂糖，I型</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013-250G</td><td>在胚胎培养基中配制1.5%琼脂糖</td></tr><tr><td>（抗生素）胚胎培养基</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td>参见Westerfield, 2007</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td>参见Westerfield, 2007</td></tr><tr><td>持针镊</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>尖端长度100+ mm（钝头），50 mm尖端</td></tr><tr><td>罗丹明B葡聚糖</td><td>谱系示踪染料</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1824</td><td>分子量10,000 Da，可被赖氨酸固定，红色荧光染料（发射波长590 nm），由绿光（激发波长570 nm）激发</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX7</td><td> </td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Lumar</td><td>全自动操纵杆控制（Sycop）</td></tr><tr><td>移植装置</td><td>工具</td><td>Eppendorf</td><td>AirTram</td><td> </td></tr><tr><td>自动显微操作仪</td><td>工具</td><td>Eppendorf</td><td>TransferMan NK2</td><td>操纵杆控制</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>工具</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>00-42-101-0000</td><td>MM33 右手型</td></tr><tr><td>带背压单元的显微注射仪</td><td>工具</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-2 BPU</td><td> </td></tr><tr><td>Flamming/Brown 微电极拉制仪</td><td>工具</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P97</td><td>程序：加热550；&lt;br/&gt;速度200；&lt;br/&gt;时间/延迟200；&lt;br/&gt;拉力120。</td></tr></tbody></table>

组织靶向胚胎嵌合体：斑马鱼原肠胚细胞移植

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

发育生物学领域中的某些基本问题，只有在将细胞置于新环境或在较大背景下改变小群细胞时才能得到解答。观察单个细胞在独特环境中如何相互作用及其行为表现，对于表征细胞功能至关重要。确定特定蛋白质的局部异常表达如何影响周围细胞，可为该蛋白质在多种发育过程中所起作用提供重要信息。本实验室利用斑马鱼模型系统，将遗传学方法与经典的细胞移植技术独特地结合，以产生基因型或表型嵌合体。我们研究斑马鱼前脑联合形成过程中神经元与胶质细胞之间的相互作用。本视频介绍了一种方法，使我们能够探究间脑中星形胶质细胞群体的作用，以及特定导向信号在轴突跨越中线过程中所发挥的功能。由于斑马鱼胚胎具有透明性，因此是进行此类异位细胞移植或局部基因异常表达研究的理想模型。移植细胞的追踪可通过活体染料或表达荧光蛋白的转基因鱼系实现。本文演示了如何制备携带活体染料示踪剂的供体胚胎用于移植，以及如何从一个原肠胚期胚胎中提取细胞并移植至另一胚胎。我们展示了在斑马鱼胚胎前脑中存在异位的GFP+转基因细胞，并根据前脑联合的解剖位置对这些细胞的定位进行了表征。此外，我们还展示了将Alexa 594标记的细胞移植至GFP+转基因宿主胚胎后，通过激光扫描共聚焦延时显微镜获得的成像数据。这些结果表明，原肠胚期的细胞移植技术能够实现异位细胞的靶向定位，从而用于解答发育生物学中的多种问题。

关键词：斑马鱼，原肠胚期，细胞移植，异位表达，前脑联合，星形胶质细胞，轴突导向，活体染料，GFP，共聚焦显微镜

斑马鱼细胞移植技术能够结合遗传学与胚胎学方法，生成组织特异性的嵌合体。本视频展示了囊胚期阶段的细胞移植操作，该技术使我们的实验室得以研究前脑联合纤维形成过程中星形胶质细胞群体及特定导向信号分子的作用。

发育生物学领域中的某些基本问题，只有在细胞被置于新环境或小群细胞被操纵时才能得到解答……

该实验步骤首先将单细胞斑马鱼胚胎排列在显微注射板中。将荧光葡聚糖溶液显微注射到卵黄中。位于已注射胚胎下方的胚胎即为移植供体。包埋供体和宿主胚胎，并培养至盾牌期，将两个经DEC包被的葡聚糖注入胚胎并排加载到移植板的一个孔中。在每对供体下方重复此操作。每个孔中加入一个宿主胚胎，以将移植细胞靶向定位至前脑未来端脑区域，移植细胞应位于中线处。位于动物极与盾区的中点位置。将供体gasa的细胞移植到受体Gasa中。培养至30小时后固定。如有必要，进行免疫化学染色，封片并成像。或者，将活体宿主直接封片，进行时间序列成像。大家好，我叫Elizabeth De Shane，来自马萨诸塞州北安普顿市史密斯学院生物科学系Michael ESI博士实验室。我是本实验室的首席研究员Michael Besi博士。今天我们将向您展示如何利用斑马鱼模型系统，通过原肠胚阶段的细胞移植来制备嵌合胚胎。在我的实验室中，我们采用这一实验方法研究特定基因在前脑联合发育过程中的功能，以及联合形成过程中轴突与胶质细胞相互作用的机制。那么，让我们开始吧。首先，通过小心地将三根长4英寸、直径1毫米的无 filament 毛细管各折成两半，制备微注射板用的槽模。使用超级胶水将其中两根毛细管的一半并排粘在平坦的表面上。第三个毛细管位于这两个毛细管上方，并嵌入凹槽中，形成一个金字塔形状。利用这三个毛细管，使模具干燥。每个注塑板应制作大约三到五个模具。接下来，通过将 20 至 25 毫升熔融的 1.5% 琼脂糖胚胎培养基倒入 100 毫米的培养皿中来制备注射用培养皿。立即将三到五个已制备的槽模放入培养皿底部，确保模具的平面一侧接触培养皿底部，并被琼脂糖完全覆盖。当琼脂糖凝固后，切出包含这些槽模的一大块琼脂糖方块，从而取出槽模。轻轻移除外侧被切割的方形琼脂并弃去。将方形琼脂块翻转，用精细镊子彻底去除槽模。将熔化的琼脂倒入培养皿中，围绕方形琼脂块，以固定新形成的孔穴。静置使其凝固。平板可用帕拉膜密封后在4°C保存数周。若琼脂中出现任何生长迹象，应予以丢弃。最后，为了制备注射针，使用微量移液毛细管拉制仪将内含细丝的1毫米直径、4英寸长的玻璃毛细管拉制成针。在完成显微注射平板和针的准备后，我们接下来观察胚胎的收集以及显微注射装置的设置。受精卵在产出后应立即收集，并置于含有胚胎培养基的培养皿中进行维持。使用宽口玻璃移液管将胚胎吹入室温注射板的孔中，该孔内已加入胚胎培养基。用闭合的钝头镊子轻轻将胚胎楔入槽的底部，若胚胎的绒毛膜或卵黄受损，则应弃用。接下来，用一到两微升稀释的荧光Alexa 594葡聚糖溶液填充注射针。通过毛细作用使葡聚糖溶液移至注射针尖端。将注射针连接到立体定位微量操作器的毛细管固定装置上，并初步调节微注射装置的压力。40至50 PSI，脉冲持续时间为500毫秒。使用镊子轻轻刮擦或剪断注射针尖以打破密封。理想情况下，针尖直径应为0.05至0.15毫米。为校准针头，使用体视显微镜将右旋糖酐排出至带有矿物油的微米尺上。通过调节脉冲气压持续时间以及针头尺寸来调整团注体积。提示：在整个注射过程中，团注体积应维持在0.8至1纳升之间。现在可以开始在体视显微镜下使用约 3.2 倍放大倍数进行葡聚糖微注射。从槽的一端开始注射胚胎，平稳地刺穿胚胎的绒毛膜和细胞膜，进入卵黄。将葡聚糖溶液注射到细胞下方。务必使用进入胚胎时相同的平稳动作将注射针取出。移动培养皿，使下一个胚胎对准位置，并继续沿槽逐个注射。定期检查压力和注射量大小。现在用镊子轻轻将胚胎从槽中推出。将它们转移至含有抗生素胚胎培养基的培养皿中。在28.5摄氏度下孵育胚胎，并观察是否存在未受精卵或死亡胚胎。胚胎现已准备好用于后续移植。在气体孵育过程中，卵黄的部分区域仍会暴露在外。卵黄极为脆弱，容易黏附在培养皿的塑料表面并发生撕裂。因此，胚胎需要在移植前一天接种到包被的培养皿中。通过将5至10毫升融化的琼脂糖倒入直径为100毫米的培养皿中制备这些去胶培养皿。仅需约2至3毫米厚的薄层琼脂糖即可在去胶过程中为胚胎提供缓冲保护。让平板冷却。接下来，将30毫升1.5%琼脂糖溶液倒入100毫米的培养皿中，制备独立的移植平板，并插入移植孔模具。该模具应包含104个三角形凹槽，每个凹槽由三个90度边和一个45度斜边组成。孔穴设计为并排容纳两个胚胎。注意不要在模具下方滞留气泡，并让琼脂糖凝固。移除模具后，会显现出一个凹陷区域，其中包含带有斜边的方形孔穴。为了准备用于移植的宿主和供体胚胎，需要监测其发育情况，以保持接近相同年龄的配对。为此，可将胚胎置于23至31摄氏度之间的不同温度下培养，以减缓或加速其发育。宿主和供体胚胎均应在预期发育阶段前一小时手工接种到包被好的培养板上。对于原肠胚阶段的移植，此操作需在受精后5小时内（HPF）完成，即在5.5 HPF的盾牌期之前。使用玻璃移液器将宿主胚胎和供体胚胎加载至装有含抗生素胚胎培养基的移植板中。其中，第一行每孔放置两个供体胚胎，后续两行每孔放置一个宿主胚胎。进行移植时，我们使用蔡司（Zeiss）Luer型荧光体视显微镜，该显微镜具备全自动操纵杆控制的变焦和调焦功能。尽管这种自动化显微镜并非必需，但它能显著提高这些精细外科移植操作的便捷性和效率，尤其是在需要进行大量移植时尤为明显。为搭建移植装置，先将艾诺（Einor）空气轨道调节至其刻度的中间位置，将空气轨道管路连接至毛细管 holder，并将该 holder 固定在艾诺自动显微操作器上。在胚胎和移植装置准备就绪后，我们现在可以开始进行原肠胚期细胞移植。完成原肠胚阶段细胞移植最关键的技能是能够识别背侧生发层细胞的解剖结构，即斑马鱼中的盾板（shield）。本文展示了一段从不同视角观察原肠胚的序列影像，并在此侧视图中高亮标示盾板的位置。盾板或背侧位于右侧，以红色轮廓标出，是前脑移植细胞的靶向区域及中线位置。在动物极与盾区正中间的位置，我们将开始旋转胚胎，首先朝向您转动以显示动物极，同时沿途突出盾区及移植位点。接着，胚胎绕其自身轴线旋转，使盾区位于下方。随后，原肠向上回转，为您提供一个正对的背侧视图。现在将胚胎按顺序旋转回六小时体节期（HPF）的侧视位置。使用显微操作器，轻轻用毛细管尖端触碰胚胎，将其旋转至适合细胞提取的位置，使胚胎的中线和盾板清晰可见，并正对毛细管尖端。通过从明场照明切换至荧光照明，可轻松确认供体胚胎。此处，胃部细胞呈红色荧光，将少量胚胎培养基吸入毛细管中，以避免细胞接触气液界面，防止细胞受损。在供体胚胎的中线位置，精确地位于动物极与盾区之间，轻轻刺破外胚层。在气囊区域，表面外胚层与下方卵黄之间的细胞层厚度仅有约20微米，因此需小心避免刺穿卵黄，否则常会导致胚胎在数小时内死亡。使用空气导管缓慢地将细胞吸入毛细管中。始终确保可见水线，并轻微晃动管尖。当管尖位于供体内部时，有助于松动细胞间的连接。应从供体胚胎中提取约10至50个细胞。接下来，将毛细管从供体中移除。以相似方向定位受体胚胎，并刺入受体，将细胞注入完全相同的位置。在受体胚胎中，从明场切换到荧光照明可观察到毛细管针头内标记了葡聚糖的细胞进入受体胚胎的过程。最后，移植完成后，从孔中取出供体和受体胚胎，将其分开，并轻轻放置于含有抗生素胚胎培养基的A型包被培养皿中。将胚胎在28.5摄氏度条件下孵育，直至移植过程完全结束。让我们开始进行可视化和成像。首先，将胚胎固定在适合成像的适当发育阶段，使用经免疫化学验证的固定剂。在本实验中，具体操作为：在室温下用4%多聚甲醛固定2小时，或在4°C条件下旋转过夜。随后用0.1摩尔PB缓冲液将固定后的胚胎冲洗两次，每次三到五分钟。如有需要，进行适当的免疫标记。将胚胎置于75%甘油中，在室温下沉降，随后在4摄氏度保存。通过在载玻片上用石蜡油绘制两个与方形盖玻片内径相匹配的方形轮廓，制备可容纳两个胚胎的载玻片。用盖玻片覆盖每个胚胎，并进行必要的解剖操作，以获得前脑的正面观。通过在中脑处垂直剪切，分离出前脑。将该组织连同极少量甘油置于石蜡中。将组织调整至适当位置，并在标本上覆盖盖玻片。或者，对于活体胚胎，将其置于载玻片上含0.75%琼脂糖的溶液中。在琼脂糖凝固前，将培养皿倒置，使用钨针调整胚胎至成像所需的正确方向。固定和活体样本均需进行成像。使用 Leica SP 五激光扫描共聚焦显微镜获取 ZS 层切图像，并利用 Velocity 软件进行三维或四维图像处理，以生成嵌合胚胎，其中胚胎内部分星形胶质细胞群体在基因型或表型上存在差异。我们采用了一种多方面的策略，结合使用 GFP 转基因胚胎标记星形胶质细胞，并通过原肠胚期阶段的细胞移植技术，将克隆细胞特异性地靶向至头区。我们依据斑马鱼原肠胚的命运图谱，选择性地从动物极与胚盾等距的中线位置提取细胞。随后将这些提取的细胞移植到野生型宿主胚胎的相同位置，并将胚胎培养至30小时后受精（HPF），然后对所有轴突进行免疫标记，作为前脑解剖结构的参考标志。在此处展示的示例中，对一个宿主胚胎进行共聚焦成像，显示在整个头部区域存在分散的GFP阳性细胞。通过该克隆分析可观察到这些GFP阳性细胞的完整形态，结果显示其中大多数细胞呈现出典型的放射状胶质细胞形态，其胞体位于室管膜区附近，而较长的终足则沿放射状突起延伸至表面。对所采集的光学切片进行三维重建，可清晰显示这些细胞相对于标记轴突的位置。另一种常用于观察移植细胞的方法是，将荧光细胞谱系染料显微注射到单细胞期的野生型或GFP转基因胚胎的卵黄中。在本示例中，我们将Alexa 594葡聚糖注射到野生型胚胎中。在单细胞阶段，将胚胎培养至盾片期，随后如上所述进行四次脑部靶向移植。但不同的是，我们将细胞移植到转基因宿主的原肠胚中，并通过激光扫描对背侧头部进行成像。共聚焦显微镜显示，在前脑的GFP阳性细胞核中存在荧光红色的供体细胞簇。我们进一步通过激光扫描共聚焦显微镜，每隔三分钟采集一次Zacks，持续两小时，对该宿主进行了分析。利用IMP公司提供的Velocity软件对这一时间序列进行四维重建，展示了杆状结构细胞膜以及GFP阳性细胞核的动态细胞运动。我们刚刚向您展示了如何准备斑马鱼胚胎细胞移植所需的全部仪器和试剂。具体而言，我们在囊胚期（gaso期）演示了该技术。然而，该技术同样适用于囊胚期的移植实验。在使用此操作流程时，重要的是要将移植细胞最终期望到达的位置与这些细胞在囊胚期早期命运图谱中的位置精确对应。有关更多指导，可参考Scott Frazier博士1995年发表的关于斑马鱼命运图谱的详细研究《斑马鱼胚胎的命运图谱》（Fate Maps of the Zebrafish Embryo）。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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