组织靶向胚胎嵌合体：斑马鱼原肠胚细胞移植

该实验步骤首先将单细胞斑马鱼胚胎排列在显微注射板中。向卵黄中显微注射荧光葡聚糖溶液。位于已注射细胞下方的胚胎即为移植供体。

将供体和受体胚胎进行包埋，并培养至盾牌期，将两个经DEC包被的葡聚糖注射胚胎并排加载到移植板的一个孔中。在每对供体下方重复此操作。每个孔中加入一个受体胚胎，以将移植细胞靶向定位至前脑未来端脑区域，并将移植细胞移植至中线。

位于动物极与盾区的中点处。将供体gasa的细胞移植到受体Gasa中。培养至30小时后固定。

如有必要，进行免疫化学染色，封片并成像。或者，将活体宿主封片并进行时间序列成像。大家好，我是伊丽莎白·德·谢恩（Elizabeth De Shane），来自马萨诸塞州北安普顿市史密斯学院生物科学系迈克尔·艾斯博士（Dr. Michael ESI）的实验室。

我是本实验室的首席研究员Michael Besi博士。今天我们将向您展示如何利用斑马鱼模型系统，通过原肠胚期细胞移植来制备嵌合胚胎。在本实验室中，我们采用这一技术研究特定基因在前脑联合发育过程中的功能，以及联合形成过程中轴突与胶质细胞相互作用的机制。

那么我们开始吧。首先，通过小心地将三根长4英寸、直径1毫米的无纤维毛细管各折成两半，来制备显微注射板用的槽模。使用超级胶水将其中两段毛细管的一半并排粘在平面上。

第三个毛细管位于下方两个毛细管之上，嵌入凹槽中形成金字塔形状。利用这三个毛细管，使模具干燥。每个注塑板应制作大约三到五个模具。

接下来，通过将 20 至 25 毫升熔融的 1.5% 琼脂糖胚胎培养基倒入 100 毫米的培养皿中来制备注射用培养皿。立即将三到五个已制备好的槽模放入培养皿底部，确保模具的平面一侧接触培养皿底部，并被琼脂糖完全覆盖。当琼脂糖凝固后，切出包含这些槽模的一大块琼脂糖方块，从而取出槽模。

轻轻移除外侧被切割方块周围的琼脂并弃去。将方形琼脂块翻转，用精细镊子彻底去除槽模。将熔化的琼脂倒入培养皿中，围绕方形琼脂块浇注，以固定新形成的孔穴。

静置使其凝固。培养皿可用帕拉膜密封后，在4°C下保存数周。若琼脂中出现任何生长迹象，应予以丢弃。

最后，为了制备注射针，使用微量移液毛细管拉制仪将内含细丝的1毫米直径、4英寸长的玻璃毛细管拉制成针头。在完成显微注射平板和针头的准备后，我们接下来观察胚胎的收集以及显微注射装置的设置。受精卵在产出后应立即收集，并置于盛有胚胎培养基的培养皿中进行维持。

使用宽口玻璃移液管将胚胎排出至室温注射板的孔中，孔内预先加入胚胎培养基。用闭合的钝头镊子轻轻将胚胎楔入槽的底部。若胚胎的绒毛膜或卵黄受到损伤，应予以弃用。

接下来，用一到两微升稀释的荧光Alexa 594葡聚糖溶液填充注射针。通过毛细作用使葡聚糖溶液移至注射针尖端。将注射针连接到立体定位微操作器的毛细管固定装置上，并初步调节微注射装置的压力。

40至50 PSI，脉冲持续时间为500毫秒。使用镊子轻轻刮擦或剪断注射针尖以打破密封。理想情况下，针尖直径应为0.05至0.15毫米。

为校准针头，使用体视显微镜将右旋糖酐排出至含有矿物油的微米尺上。通过调节脉冲气压持续时间以及针头尺寸来调整团注体积。提示：在整个注射过程中，团注体积应维持在0.8至1纳升范围内。

现在可以在体视显微镜下使用约 3.2 倍放大倍数开始进行葡聚糖的显微注射。从槽的一端开始对胚胎进行注射，平稳地刺穿胚胎的绒毛膜和细胞膜，进入卵黄。将葡聚糖溶液注射到细胞下方。

务必使用进入胚胎时相同的平稳动作将注射针取出。移动培养皿，使下一个胚胎对准位置，并继续沿槽逐个注射。定期检查压力和注射量大小。

现在用镊子轻轻将胚胎从槽中推出。将它们转移到盛有含抗生素胚胎培养基的培养皿中。在28.5摄氏度条件下孵育胚胎，并观察是否有未受精卵或死亡胚胎。

胚胎现已准备好用于后续移植。在气体孵育过程中，卵黄的部分区域仍会暴露在外。卵黄极为脆弱，容易黏附在培养皿的塑料表面并发生撕裂。

因此，胚胎需要在移植前一天接种到包被好的培养皿中。通过将5至10毫升融化的琼脂糖倒入直径为100毫米的培养皿中制备这些去胶培养皿。仅需约2至3毫米厚的薄层琼脂糖即可在去胶过程中为胚胎提供缓冲保护。

让平板冷却。接着，将30毫升1.5%琼脂溶液倒入100毫米的培养皿中，制备独立的移植平板，并插入移植孔模具。该模具应包含104个三角形凹槽，每个凹槽由三条90度边和一条45度斜边组成。

孔穴设计为并排容纳两个胚胎。注意不要在模具下方困住气泡，并让琼脂糖凝固。移除模具后，会显现出一个凹陷区域，其中包含带有斜边的方形孔穴。

为了准备用于移植的宿主和供体胚胎，需要监测其发育情况，以保持接近同龄的配对。为此，可将胚胎置于23至31摄氏度之间的不同温度下培养，以减缓或加速其发育。宿主和供体胚胎均应在预期发育阶段前一小时手工接种于包被好的培养板上。

对于原肠胚阶段的移植，此操作需在受精后5小时内（HPF）完成，即在5.5 HPF的盾牌期之前。使用玻璃移液器将宿主和供体胚胎加载到装有含抗生素胚胎培养基的移植板中。其中，第一行每孔放置两个供体胚胎，后续两行每孔放置一个宿主胚胎。

进行移植时，我们使用蔡司（Zeiss）Luer 荧光体视显微镜，该显微镜具备全自动操纵杆控制的变倍和调焦功能。尽管这种自动化显微镜并非必需，但它能显著提高这些精细外科移植操作的便捷性和效率，尤其是在需要进行大量移植时尤为有利。为搭建移植装置，先将艾诺（Einor）空气轨道调节至其刻度的中间位置，将空气轨道管路连接至毛细管 holder，并将该 holder 固定在艾诺自动微操纵器上。在胚胎和移植装置准备就绪后，我们现在可以开始进行原肠胚期细胞移植。

完成原肠胚阶段细胞移植最关键的技能是能够识别背侧生发层细胞的解剖结构——即斑马鱼中的盾板（shield）。本文展示了一段从不同视角观察原肠胚发育过程的序列影片，并在侧面观中突出显示盾板的位置。盾板或背侧位于右侧，以红色轮廓标出，用于确定前脑移植细胞的来源位置及中线靶向区域。

在动物极与盾区正中间的位置，我们将开始旋转胚胎，首先朝向您转动，以观察动物极，并在此过程中标示出盾区及移植位点。接着，胚胎绕其自身轴线旋转，使盾区位于下方。随后，原肠胚再向上旋转回位，为您提供一个正对的背侧视图。

现在将胚胎按顺序旋转回六小时原肠胚期（six HPF）的侧视位置。使用显微操作器，轻轻用毛细管尖端触碰胚胎，将其旋转至适合细胞提取的位置，使其中线和胚盾可见，并朝向毛细管尖端。通过从明场照明切换至荧光照明，可轻松确认供体胚胎。此处，胃部细胞发出红色荧光。吸取少量胚胎培养基进入毛细管，以避免细胞接触气液界面而受损。

在供体胚胎的中线位置，恰好介于动物极与盾区之间，轻轻刺破外胚层。在气囊区域，表面外胚层与下方卵黄之间的细胞层厚度仅约20微米，因此需小心避免刺穿卵黄，否则常会导致胚胎在数小时内死亡。

使用空气移液管缓慢地将细胞吸入毛细管中。始终确保可见水线，并轻微晃动吸头。当吸头位于供体内部时，有助于松开细胞间的连接。

应从供体胚胎中提取约10至50个细胞。接下来，将毛细管从供体中移除。以相似的方向定位受体，并刺入受体胚胎，将细胞注入完全相同的位置。在受体胚胎中，从明场照明切换至荧光照明可观察到毛细管针头中带有葡聚糖标记的细胞进入受体胚胎的过程。

最后，移植完成后，从孔中取出供体和受体胚胎，将其分开，并轻轻放置于含有抗生素胚胎培养基的A型包被培养皿中。将胚胎在28.5°C条件下孵育，直至移植过程完全结束。

让我们开始进行可视化和成像。首先，将胚胎固定在适合成像的适当发育阶段，使用经免疫化学验证的固定剂进行处理。在本实验中，具体操作为：在室温下用4%多聚甲醛固定2小时，或在4°C条件下旋转过夜。

随后用固定后的胚胎冲洗两次，每次三到五分钟。使用 0.1 摩尔的 pb。如有需要，进行适当的免疫标记。

将胚胎置于75%甘油中，室温下沉降，随后于4摄氏度保存。准备载玻片，通过在载玻片上用石蜡油绘制两个与方形盖玻片内径相匹配的方形轮廓，以固定两个胚胎。用盖玻片覆盖每个胚胎，并进行必要的解剖操作，以获得前脑的正面观。

通过在中脑处垂直切断，分离出前脑。将该组织连同少量甘油置于石蜡中。将组织调整至适当位置，并在标本上覆盖盖玻片。

或者，对于活体胚胎，将其置于载玻片上含0.75%琼脂糖的溶液中。在琼脂糖凝固前，将培养皿底部朝上，用钨针调整胚胎至成像所需的正确方向。固定和活体样本均需进行成像。

使用 Leica SP 五激光共聚焦显微镜获取 ZS 层切图像，并利用 Velocity 软件进行三维或四维图像处理，以生成嵌合胚胎，其中胚胎内部分星形胶质细胞群体在基因型或表型上存在差异。我们采用了一种多方面的策略，结合使用 GFP 转基因胚胎标记星形胶质细胞，并通过按原肠胚阶段进行的细胞移植，将克隆细胞特异性地靶向至头区。我们依据斑马鱼原肠胚的命运图谱，选择性地从动物极与胚盾等距的中线位置提取细胞。

随后将这些提取的细胞移植到野生型宿主gasa的相同位置，并将宿主培养至30小时后受精（HPF），然后对所有轴突进行免疫标记，作为前脑解剖结构的参考标志。在此处所示的示例中，对一个宿主胚胎进行共聚焦成像，显示在整个头部区域存在分散的GFP阳性细胞。通过该克隆分析可观察到这些GFP阳性细胞的完整形态，结果显示其中大多数细胞呈现出典型的放射状胶质细胞形态，其胞体位于室管膜区附近，而较大的终足则沿放射状突起延伸至表面。

对这些采集的光学切片进行三维重建，可以清晰显示这些细胞相对于标记轴突的位置。另一种常用于观察移植细胞的方法是，将荧光细胞谱系染料显微注射到单细胞期的野生型或GFP转基因胚胎的卵黄中。在本示例中，我们将Alexa 594葡聚糖注射到野生型胚胎中。

在单细胞阶段，让胚胎发育至盾片期，然后按照上述方法进行四次靶向脑部的移植。但不同的是，我们将细胞移植到转基因宿主的原肠胚中，并通过激光扫描对头部背侧进行成像。共聚焦显微镜显示，在前脑的GFP阳性细胞核中，存在荧光红色的供体细胞簇。

我们进一步通过激光扫描共聚焦显微镜，每隔三分钟采集一次该宿主的图像，持续两小时。利用IMP公司提供的Velocity软件进行四维重建，展示了杆状细胞膜及GFP阳性细胞核的动态细胞运动。我们刚刚向您演示了如何准备斑马鱼胚胎细胞移植所需的全部仪器和试剂。

具体而言，我们在囊胚期（gaso期）展示了该技术。然而，该方法同样适用于囊胚期的移植操作。在使用此操作流程时，重要的是要将移植细胞最终期望到达的位置，与这些细胞在囊胚期早期命运图谱中的原始位置进行精确定位对应。有关进一步指导，请参考Dr. Scott Frazier于1995年发表的关于斑马鱼命运图谱的详细研究《Fate Maps of the Zebrafish Embryo》。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。