快速，灵敏的胶体考马斯亮G - 250染色蛋白聚丙烯酰胺凝胶
2009年8月3日
该视频应普及胶体考马斯亮蓝G - 250染色协议，根据康等。
在本视频中，我们将演示改良的 kumasi 染色方案在检测聚丙烯酰胺凝胶中数 ng 蛋白质的强大功能。使用第一维分离前的二维凝胶电泳示例。固定化的 pH 梯度试纸条在变性缓冲液条件下再水化。
试纸条重新溶胀过夜后，通过阳极杯加载蛋白质样品。在聚焦过程中，蛋白质根据其等电点分离。第二维分离由 SDS 页面执行。
然后将凝胶转移到染色皿中，并通过用胶体 kumasi 染色来检测蛋白质。您好，我是来自奥洛大学生物医学研究中心 Sabina Meka 实验室的 Nadine de Bala。今天，我将提请您注意一个广为人知的程序，根据 Kangan 同事的说法，Cy Brilliant Blue 是一种通常用于电泳分离后蛋白质可视化的堤坝，但通常被认为不太适用于比较蛋白质组学。
然而，cos 胶体染色在灵敏度、成本和实用性方面具有卓越的功能。我们在实验室中使用 K 染色方案进行几乎平均的基于凝胶的应用，尤其是在分析蛋白质组学中以确定心肌蛋白表达变化。我将演示如何使用该方法检测二维电泳凝胶碱性 pH 范围内的心肌蛋白。
那么让我们开始吧。明白了。2D 凝胶电泳的第一个维度是等电聚焦或 IEF，固定化 pH 梯度试纸条或 IPG 试纸条用于此分析。
在 IEF 之前，使用 IM Mobilly 干条膨胀盘在 125 微升再水化溶液中将四个 IPG 条带单独再水化至少 10 小时，此时 IPG 条带被再水化并准备好用于蛋白质样品应用。将来自四种不同心脏制剂的 TCA 沉淀蛋白质样品溶解在 IEF 样品缓冲液中，浓度为每 100 μL 100 μg 蛋白质。蛋白质样品在室温下在涡旋中溶解至少需要 30 分钟。
同时，准备 IM Molene 干条试剂盒的附加组分，以便在 multi four 电泳单元中进行 IEF。首先将冷却装置的温度设置为 20 摄氏度，将 3 到 4 毫升的覆盖液移液到冷却板上，然后将 Immobilien 干条托盘放在上面，红色电极连接朝向阳极。将约 10 毫升覆盖油倒入 Immobilien 干式带材托盘中，然后将 Immobilien 干式带材对准器放在涂油托盘上，凹槽面朝上。
接下来，从再溶胀托盘中取出再水化的条带，并将其凝胶面向上转移到对准器的凹槽中。带材的酸性端应朝向阳极。最后，所有条带都应与其阳极边缘对齐。
将蒸馏水饱和的电极条横向放在凝胶条的末端，确保电极条至少部分接触凝胶表面。最后，将电极放置在电极条上，使彩色标记指向相应的电子触点。将样品杯棒放在固定干条托盘的阳极附近，并将样品杯放在每个 IPG 条带上方。
轻轻向下按压样品杯，以确保与 IPG 试纸条良好接触。将 70 至 80 毫升覆盖油倒入托盘中，以覆盖 IPG 试纸条。不应将油泄漏到样品杯中。
如果油漏入杯中，请用移液管将其取出并再次调整杯子。最后，加入约 150 毫升的覆盖油以完全覆盖样品杯。现在通过在覆盖液表面下移液，将蛋白质样品加入样品杯中。
杯子的体积为 100 微升。应用完所有蛋白质样品后，连接所有导联。将 multi four 装置插入电源，并在 IEF 之后的梯度模式下进行 11.1 kV 小时的等电聚焦，将 IPG 条带放入凝胶面朝上的托盘中，并在平衡过程中进行还原和烷基化。
对于还原，每个试纸条使用 2.5 毫升 1% DI 三和所有平衡溶液。然后摇动 15 分钟，然后完全更换 DTT 溶液，并在 2.5%I oto 乙酰胺平衡溶液中烷基化试纸条，再振荡 15 分钟。在装满水的烧杯中冲洗平衡条一次，然后将它们吸干到滤纸上以去除多余的平衡缓冲液。
接下来，将条带转移到一个 XSDS 运行缓冲液中。试纸条中的蛋白质现在可用于 2D 凝胶电泳的第二维。第二个维度由垂直电泳系统上的 SDS 页面进行。
适当数量的 1 毫米厚。12% 丙烯酰胺凝胶在使用前一天浇注，并用湿纸覆盖。在室温下，将平衡的 IPG 条置于分离凝胶的顶部，并用热农业溶液固定每个蛋白质分离 2.5 小时，从 80 伏特开始，持续 15 分钟，然后是 120 伏特，直到染料前沿到达凝胶盒的底部。
当蛋白质通过 SDS 页面分离时，准备凝胶上胶体 kumasi 染色的溶液。在制备染色液时，按以下顺序保持组分的顺序添加非常重要。首先，将 100 克硫酸铝和大约 1.5 升毫立方水溶解在烧杯中并搅拌。硫酸铝溶解后，混合 200 毫升乙醇，并向溶液中加入 0.4 克 CBG 二 50。
一旦 CBB G two 50 完全溶解，立即加入 47 毫升邻磷酸。此步骤允许 kamasi 分子聚集成它们的胶体状态。最后，加入 milli Q 水至最终体积为 2 升。
最终的静置解决方案将使颗粒四处游动。请勿筛选此解决方案。染色液也可以提前配制，避光保存直至使用。
当 SDS 凝胶完成时。小心地从玻璃板中取出凝胶，并将其转移到装满 Milli Q 水的染色皿中。将装有凝胶的培养皿放在水平摇床上，摇晃 10 分钟。
再重复洗涤 2 次，持续约 5 到 10 分钟。使用新鲜的毫立方水，充分洗涤凝胶很重要，因为残留在凝胶上的 SDS 会破坏染料与蛋白质的结合，导致灵敏度差。第三次洗涤结束时，将盘中的水倒出。
凝胶现在可以进行染色了。首先，摇动 Kumasi 溶液以均匀分散胶体颗粒。然后加入足够的溶液以覆盖凝胶。
将盖有 Kumasi 溶液的培养皿放在盘子上。在摇床上凝胶并搅拌 2 至 12 小时。10 分钟后，您将看到第一个蛋白质斑点出现。
80% 到 100% 的染色可以在孵育后 2 小时内完成。但我们建议过夜孵育以实现接近 100% 的染色。染色完成后，去除 Kamasi 溶液并用 Milli Q 水冲洗凝胶两次。
冲洗凝胶后，用不起毛的纸巾去除染色皿中粘附的染料颗粒。将 des 染色液添加到凝胶中，并在摇床上停留 10 至 60 分钟。最后，用 Milli Q 水冲洗凝胶两次。
凝胶将恢复其原始厚度，kumasi 染色剂的颜色强度也将增强。如果您遵循此实验步骤，您的 2D 凝胶应得到明显分离，并能很好地染色深蓝色蛋白质斑点。我们的 2D 凝胶 kumasi 染色结果与银染的结果相当。
根据 Chef Chenko 等人的方案，据报道其具有高灵敏度并与质谱法兼容。以二维凝胶电泳为例，我们刚刚向您展示了 kangs cooma sustaining 是多么快速、简单和灵敏。为了检测 po 丙烯酰胺凝胶中的蛋白质，可以在两小时内完成维持。
手术本身需要很少的劳动力。最后但并非最不重要的一点是，您可能能够检测到低至 1 纳克的蛋白质。因此，该协议绝对是基于监狱的蛋白质组学的去标记方法的良好替代方案。
当您使用维持程序时，请务必记住使用分析级化学品和最高纯度的水。此外，将组分依次添加到染色溶液中是制备的关键步骤。最后，不要忘记在电泳分离后有效清洗凝胶上残留的 SDES。
否则，您的凝胶上不会看到任何东西。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本视频演示了一种修改的考马斯亮蓝G-250染色法，用于在聚丙烯酰胺凝胶中检测纳克级蛋白质。该协议高效，可在2小时内完成染色，适用于基于凝胶的蛋白质组学分析。
主要研究组成部分
科学领域
- 蛋白质组学
- 生物化学
- 电泳
背景
- 考马斯亮蓝G-250是用于蛋白质检测的染料。
- 二维凝胶电泳根据等电点和分子量分离蛋白质。
- 修改后的协议旨在提高蛋白质检测的灵敏度和效率。
- 染色是在研究中分析蛋白质样品的关键步骤。
研究目的
- 推广一种用于蛋白质检测的高效染色协议。
- 展示该协议在基于凝胶的蛋白质组学中的应用。
- 为研究人员提供快速可靠的方法。
使用的方法
- 修改的考马斯亮蓝G-250染色协议。
- 用于蛋白质分离的二维凝胶电泳。
- 通过阳极杯加载蛋白质样品。
- 使用固定pH梯度条进行再水化。
主要结果
- 成功检测到凝胶中平均4纳克的蛋白质。
- 染色在2小时内完成。
- 协议展示了易用性和效率。
- 适用于蛋白质组学的各种分析目的。
结论
- 修改后的染色协议对低蛋白浓度有效。
- 它增强了基于凝胶的蛋白质组学的工作流程。
- 研究人员可以从这种快速可靠的方法中受益。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables detection of low-abundance proteins in polyacrylamide gels with sensitivity down to 1 ng/band, supporting analytical proteomics workflows where quantitative protein expression changes are measured. The method offers a cost-effective, mass spectrometry-compatible alternative to silver or fluorescence staining, improving target validation confidence in discovery-stage research. Its rapid staining completion within 2 hours enhances throughput for screening applications in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting low-abundance protein biomarkers in disease models.
- Operational Value: Provides reproducible protein visualization for functional target validation and pathway clarification.
- Predictive Value: Supports portfolio triage through quantitative detection of expression changes in preclinical models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by ensuring reliable protein detection.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative outputs essential for assay reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables reliable compound evaluation through sensitive, consistent protein staining across replicate gels.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by detecting phosphorylation-dependent protein shifts in 2D gels.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation with consistent staining performance.
- Risk Mitigation: Reduces false-negative risks in target engagement studies through enhanced sensitivity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, particularly for analytical proteomics applications requiring quantitative protein detection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling detection of low-abundance proteins in complex mixtures.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, quantitative protein staining compatible with high-throughput gel processing.
- Analytics: Provides nanogram-level sensitivity and linear dynamic range for comparing protein expression across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by detecting disease-relevant protein modifications in model systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomics capability across multiple projects due to its simplicity, low cost, and compatibility with MS.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through sensitive, quantitative protein detection.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of staining workflows across laboratories.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions via reduced mechanistic ambiguity and improved data quality in proteomics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through reliable detection of low-abundance targets and biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 2D gel electrophoresis and protein sample preparation.
- Needs instrumentation for isoelectric focusing, SDS-PAGE, and horizontal shaking for staining.
- Demands cross-team standardization of staining solution preparation and washing protocols.
- Requires adaptation considerations for different gel percentages and protein sample types.
- Practical limitation: Sensitivity may vary slightly depending on protein properties, as noted in the source.
