Name: 结合QD - FRET技术和微流体实时监测DNA纳米复合自组装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: 学习利用QD-FRET技术与微流体实时监测DNA纳米复合物的静电自组装过程。该方法通过量子点供体和有机荧光受体标记，实现基因治疗载体聚电解质复合物的可控合成与动态表征。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

由NIH基金HL89764以及NSF基金0546012、0730503和0725528提供资助支持。

A. DNA的生物素标记
质粒DNA通过鸟嘌呤特异性的生物素标记物进行共价生物素标记，方法参照生产商说明（Mirus Bio, Madison, WI），但调整条件使每条DNA分子上带有约1-2个生物素标记。本方案中标记的质粒DNA为pEGFP-C1（4.9 kb，Clontech, Mountain View, CA）。
<ol><li>将所需量的pDNA溶解于无DNase和RNase的TE缓冲液（分子生物学级纯度）水中，配制成1μg/μL的DNA溶液。</li>
 <li>使用以下反应体系进行标记反应。最后加入LabelIT试剂。</li>
</ol>
 对于 100μg DNA 反应：
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>
 无 DNase 和 RNase 的水 </td>
 <td>75 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X 标记缓冲液 A</td>
 <td>20 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1μg/μL DNA</td>
 <td>100 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LabelIT 试剂</td>
 <td>5 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总体积</td>
 <td>200 μL</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
<ol start="3">
 <li>在 37 °C 下孵育反应 1 小时。</li>
 <li>按照标准方案，通过乙醇或异丙醇沉淀纯化标记的样品。</li>
</ol>
注意：基于凝胶过滤的柱子可能导致较高的紫外吸收或荧光背景，这可能会影响DNA定量或荧光表征。 
 注意：生物素化程度可通过基于HABA的检测方法来确定。
 B. Cy5-阳离子聚合物的标记
本研究中使用壳聚糖（390 kDa，83.5% 脱乙酰化，Vanson，Redmond，WA）作为阳离子聚合物的模型。壳聚糖聚合物主链上的游离伯胺基团用 Cy5-NHS（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）进行标记。
<ol>
 <li>为确保Cy5染料完全偶联，计算所需Cy5-NHS的用量，使Cy5与伯胺的摩尔比为1 : 200。</li>
 <li>通过加入NaOH将壳聚糖溶液（溶于25 mM醋酸盐缓冲液）的pH调节至约6.5。需注意，NHS反应在碱性pH下效率更高，但此处壳聚糖的溶解度限制了可操作的pH范围。</li>
 <li>在搅拌条件下，逐滴缓慢加入计算量的Cy5-NHS（1 mg/ml DMSO溶液）至壳聚糖溶液中。</li>
 <li>将混合物在室温下避光振荡过夜。</li>
 <li>为纯化产物，使用10 k MWCO Slide-a-Lyzer（Pierce）在室温避光条件下，以1%醋酸盐缓冲液透析2小时。</li>
 <li>更换缓冲液，再次在室温避光条件下透析2小时。</li>
 <li>更换缓冲液，在4 °C避光条件下透析过夜。</li>
 <li>将纯化后的标记聚合物于-20 °C保存。</li>
</ol>
注意： 本研究中，通过测量 Cy5-NHS 酯在 670 nm 处的发射强度构建标准曲线。通过测量 Cy5 标记的壳聚糖在标准曲线中 670 nm 处的发射强度来表征标记密度。也可使用吸光度测定标记效率，但本实验未进行。
C. QD标记的DNA和Cy5-聚合物的制备
pDNA与QD的摩尔比保持过量（pDNA : QD ≈ 1 : 2），以确保QD与pDNA完全偶联。每个pDNA上标记的QD数量可通过透射电子显微镜（TEM）成像或其他等效设备进行估算。在本研究中，通过TEM和单分子光谱法估计每个pDNA上的QD数量约为~1-3个。1 制备过程中请使用Millipore Milli-Q梯度水（>18.0 MW，0.2 μm过滤）。
<ol> 
 <li>根据所需的 N/P 比值（壳聚糖溶液中质子化胺基与 DNA 溶液中负电磷酸基团的理论摩尔比），计算 10μg 质粒 DNA 所需的壳聚糖用量。</li>
 <li>将链霉亲和素功能化的 605 量子点（Qdot 605 ITK，Invitrogen，Carlsbad，CA）加入生物素标记的质粒 DNA 溶液中。</li>
 <li>将溶液在室温避光条件下孵育 15 分钟。</li>
 <li>将标记量子点的 DNA 加入 50 mM 硫酸钠溶液中，终体积为 200μL。</li>
 <li>根据所需的 N/P 比值，用 Milli-Q 水稀释 Cy5 标记的壳聚糖，终体积为 200μL。</li>
 </ol>
 注意：将反应置于避光条件下，以防止可能的荧光漂白。 
 重要提示：使用 Qdot 605 ITK™ 链霉亲和素偶联物（ITK 系列）时需谨慎，因为该产品目录中的量子点设计用于 FRET 实验。常规 Qdot 系列表面带有聚乙二醇（PEG）涂层，以防止非特异性结合，尤其适用于细胞标记。然而，这种额外的涂层会增加供体与受体之间的距离，导致能量转移效率降低。
 D. 使用标准光刻技术制备 SU-8 模板
<ol>
 <li>将硅片用食人鱼溶液清洗，并在 200 °C 下烘烤 5 分钟。</li>
 <li>为获得指定的 25 μm 厚度模具，将负性光刻胶（SU-8 2025，Microchem，Newton，MA）以 2000 rpm 的转速在硅片上旋涂 30 秒。</li>
 <li>在加热板上对硅片进行前烘，以 65 °C/hr 的升温速率升至 95 °C。</li>
 <li>通过含有微通道设计的掩膜版（CAD/Art Services，Bandon，OR）将硅片暴露于紫外光（365 nm）下，剂量为 250 mJ/cm2。</li>
 <li>在加热板上对曝光后的硅片进行后烘，以 65 °C/hr 的升温速率升至 95 °C。</li>
 <li>使用 SU-8 光刻胶显影液对硅片进行显影。</li>
 <li>将已形成图案的硅片在加热板上进行坚膜烘烤，以 65 °C/hr 的升温速率升至 200 °C，随后在 200 °C 下保持至少 5 小时，再逐渐冷却至室温。</li>
</ol>
 重要提示：在 SU-8 母版烘烤过程中必须逐步升温，否则 SU-8 结构可能因应力释放而从硅片上脱落，或在 SU-8 结构上产生裂纹。
 E. 从母模复制成型PDMS并键合至盖玻片
<ol>
 <li>将SU-8母模放入称量皿中。</li>
 <li>按10 : 1的比例混合硅弹性体与固化剂（聚二甲基硅氧烷，PDMS，Sylgard 184，Dow Corning，Midland, MI）。</li>
 <li>将PDMS混合物倒入SU-8母模上，并将称量皿置于真空干燥器中以去除气泡。</li>
 <li>在65 °C下固化PDMS 1–2小时。</li>
 <li>从硅母模上剥离PDMS芯片。</li>
 <li>在微流控器件上打孔以形成通道的进样口和出样口。</li>
 <li>用乙醇清洗PDMS芯片和盖玻片，然后空气干燥。</li>
 <li>对清洗后的PDMS芯片和盖玻片进行氧气等离子体处理（20 W，1分钟）。</li>
 <li>立即把PDMS芯片与盖玻片键合。</li>
 <li>将键合好的微流控芯片置于95 °C烘箱中过夜。</li>
</ol>
重要提示：等离子体处理和过夜烘烤对于提高键合强度至关重要。
F. 在微流控装置中监测DNA纳米复合物的形成
<ol>
 <li>在加载试剂之前，先用去离子水充满微流控通道（确保微流控通道内无气泡），以保证实验过程中液体流动顺畅。</li>
 <li>通过视频中所述的管路，将量子点标记的 DNA 溶液和 Cy5 标记的壳聚糖溶液分别装入两个玻璃注射器中。</li>
 <li>将管路连接至微流控装置的两个进样口，操作过程中需避免引入任何空气。在层流条件下，设置流速为 20 nL/min（使用 PHD-2000 注射泵，Holliston, MA）。</li>
 <li>在显微镜下观察微通道内的流动情况。</li>
 <li>当流动稳定后（约 15 至 20 分钟），应在通道中央观察到由量子点介导的荧光共振能量转移（FRET）信号。</li>
 <li>沿通道不同位置采集荧光图像（使用冷却 CCD 相机，Qimaging，BC，加拿大）。</li>
 <li>使用 ImageJ 和 OriginLab 软件分析荧光图像。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1432/1432fig1.jpg" alt="QD-FRET 光谱分析（含吸收峰），用于蛋白质研究的 DNA 纳米复合物示意图。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 图 1. QD-FRET 可灵敏地指示 DNA 纳米复合物自组装的起始
<ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>量子点介导的荧光共振能量转移（QD-FRET）可在胞外或胞内环境中提供一种定量且高度灵敏的多聚复合物稳定性检测方法，从而实现对DNA与基因载体之间相互作用起始的明确检测。选择605QD和Cy5作为FRET配对，是基于最大化供体与受体之间的光谱重叠并最小化潜在的串扰。对于该配对，Förster距离为69.4Å。3</li>
 <li>QD-FRET DNA纳米复合物的自组装。将阴离子质粒DNA（pDNA）和阳离子基因载体分别标记上QD（能量供体）和Cy5（能量受体）。通过静电复合共沉淀形成QD-FRET纳米复合物。在488 nm激发下，QD-FRET介导的Cy5发射表明形成了致密且完整的纳米复合物。滞留时间（tR）可根据两股流体汇合处到待研究反应位置的距离（x）以及平均流速（v）进行计算。由于层流的特性，混合仅发生在界面处（每张图像的中心），从而可精确计算作为tR函数的质量传递。通过调节施加的流速可调整时间分辨率。（插图）当两股流体相遇时，在界面处立即观察到FRET介导的信号，表明结合迅速，根据所施加的流速，结合发生在几毫秒内。比例尺：100μm。</li>
</ol>

<ol><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> J Control Release. 116, 83-89 (2006).</li>
<li>Chen, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+dot-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET.</a> Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).</li>
<li>Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Quantum-Dot-Based+DNA+Nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mat%22%5BJournal%5D)">Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor.</a> Nat Mat. 4, 826-831 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

<ul><li>本研究的意义：
 <ol>
 <li>这是首次通过量子点荧光共振能量转移（QD-FRET）信号，在简单的微流控芯片内实时（毫秒级分辨率）监测聚合物-DNA纳米复合物自组装动力学过程。</li>
 <li>量子点介导的荧光共振能量转移（FRET）可对分子间相互作用的起始及自组装全过程提供高灵敏度和定量化的检测信号，而微流控技术则提供了高度可控的微环境，可用于在DNA纳米复合物合成过程中对其空间演化进行分析。</li>
 <li>微流控技术与纳米光子学的结合，为研究各类复合反应提供了一种新颖且富有前景的方法。</li>
 <li>所获得的QD-FRET聚合物-DNA纳米复合物可直接用于构建结构与功能之间的关系。1,2</li>
 </ol>
</li></ul>

<table><tbody><tr><td>SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>质粒DNA</td><td>Clontech Laboratories</td><td>pEGFP-C1</td><td>4.9 kb，分子量 = 3.3 × 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Label&lt;/em&gt;IT 生物素标记试剂盒</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR 3400</td><td>标准方案的标记效率约为每20-60个碱基对双链DNA中引入一个标记，本研究中对标记密度进行了调整。</td></tr><tr><td>链霉亲和素605QD</td><td>Invitrogen</td><td>Qdot&amp;#174; 605 ITK&amp;#174; 链霉亲和素偶联物</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-NHS酯</td><td>Amersham</td><td>PA15101</td><td></td></tr><tr><td>壳聚糖</td><td>Vanson</td><td>390 kDa</td><td>脱乙酰度83.5%</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545C</td><td>1号；尺寸：40 × 22 mm</td></tr><tr><td>耐压玻璃注射器</td><td>Hamilton Co</td><td>TLL系列</td><td>根据样品体积选用50&amp;#x03BC;L至500&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Tygon管</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>0.02内径，100英尺</td><td>Tygon微孔管，0.02内径，100英尺</td></tr><tr><td>连接器</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-23R</td><td>定制长度为0.750&quot;</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD-2000</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>QImaging</td><td>增强型Retiga冷却相机</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX-51</td><td>100 W汞弧灯</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>v1.36b</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>Origin Pro8</td><td>OriginLab</td><td>学生版</td><td></td></tr><tr><td>显微镜滤光片组</td><td>Omega Optical</td><td>475AF40</td><td>两个通道的激发滤光片</td></tr><tr><td>显微镜滤光片组</td><td>Omega Optical</td><td>595AF60</td><td>605QD通道的发射滤光片</td></tr><tr><td>显微镜滤光片组</td><td>Omega Optical</td><td>670DF40</td><td>QD-FRET通道的发射滤光片</td></tr><tr><td>显微镜滤光片组</td><td>Omega Optical</td><td>500 DRLP</td><td>605QD通道的长通二向色镜</td></tr><tr><td>显微镜滤光片组</td><td>Omega Optical</td><td>595DRLP</td><td>QD-FRET通道的长通二向色镜</td></tr></tbody></table>

结合量子点-荧光共振能量转移与微流控技术实时监测dna纳米复合物的自组装过程

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

基因组学的不断进步持续推动着靶向细胞和分子水平致病机制的治疗手段的发展。基于核酸的治疗剂通常在细胞内发挥作用，因此需要高效的细胞内递送系统。一种广泛应用的方法是通过静电自组装将DNA与基因载体结合形成纳米复合物，从而促进DNA的细胞摄取并保护其免受降解。然而，高效基因载体的合理设计仍具挑战性，因为过早解离或结合过于稳定均会损害DNA的细胞摄取效率和治疗效果。通过体相混合方法合成的纳米复合物表现出多样化的细胞内解组装和转运行为，这归因于纳米复合物在尺寸和稳定性上的异质性。此类异质性阻碍了对自组装动力学的准确评估，并增加了将其物理性质与转染效率或生物活性相关联的难度。本文提出了一种纳米光子学（即量子点荧光共振能量转移，QD-FRET）与微流控技术相结合的新方法，用于表征层流条件下纳米复合物自组装过程的实时动力学。QD-FRET可对分子相互作用的起始提供高灵敏度指示，并在整个合成过程中实现定量监测；而微流控技术则提供了一个高度可控的微环境，能够以高时间分辨率（约毫秒级）对自组装过程进行空间解析。在聚合物纳米复合物的模型体系中，该分析平台捕捉到了自组装过程中的两个 distinct 阶段。在微尺度下获得的自组装动力学信息对于基于微反应器的反应尤为有价值，此类反应与众多微纳尺度应用密切相关。此外，通过合理设计微流控装置可实现纳米复合物的定制化，所获得的QD-FRET标记的聚合物DNA纳米复合物可直接用于建立结构与功能之间的关系。

关键词：基因组学，核酸治疗，基因载体，纳米复合物，静电自组装，细胞摄取，微流控，纳米光子学，QD-FRET，自组装动力学，聚合物，转染效率，结构-功能关系

我们提出了一种纳米光子学（量子点-荧光共振能量转移，QD-FRET）与微流控技术相结合的创新且强大的方法，用于研究聚电解质聚集体（polyplexes）的形成过程，该方法有望为未来基于核酸的治疗药物提供对聚集体更精确的控制，并实现均匀、可定制聚集体的合成。

结合量子点-荧光共振能量转移与微流控技术实时监测DNA纳米复合物的自组装过程

基因组学的进展持续推动着靶向细胞和分子水平病理机制的治疗手段的发展。通常……

该实验步骤首先对DNA和聚合物进行标记，以制备量子点或QD荧光共振能量转移（FRET）探针。其中，血浆DNA与量子点结合，作为能量供体；而离子型聚合物则标记了有机荧光染料Flora Four Sci Five，作为能量受体。混合量子点FRET后，纳米复合物通过静电自组装形成，随后可在相互作用发生时追踪由量子点介导的FRET信号。该量子点FRET体系被引入微流控通道中，其中各组分仅通过混合界面的扩散发生相互作用。由此可通过量子点FRET与微流控技术的结合实时监测DNA纳米复合物的自组装过程。大家好，我是来自约翰斯·霍普金斯大学机械工程系生物与单分子动力学实验室的Megan Ho。今天我们将向您展示一种结合量子点与微流控技术以实时监测DNA折纸自组装过程的实验方法。在我们的实验室中，我们利用该方法研究用于基因治疗定位的DNA折纸复合物。那么我们开始吧。使用MIRIs bio的生物素标记试剂盒，可通过鸟嘌呤特异性的生物素标签将生物素共价连接到血浆DNA上，标记程度经过优化，使每条DNA分子上大约带有1至2个生物素标签。首先，将所需量的血浆DNA溶解于TE缓冲液中，配制成浓度为1微克/微升的DNA溶液。通过混合血浆DNA-DNA无RNA水、10×标记缓冲液A和Label IT试剂来建立标记反应。Label IT试剂最后加入。将反应体系在37摄氏度孵育1小时。孵育一小时后，通过乙醇沉淀法纯化标记的样品。按照标准操作步骤进行。将标记的 DNA 储存于负20摄氏度，直至使用。下一步是对离子型聚合物进行标记。在本实验中，我们以壳聚糖作为离子型聚合物的模型，利用sci-fi NHS标记壳聚糖聚合物主链上的游离伯胺基团。首先计算所需scifi NHS的量，使scifi与伯胺基团的摩尔比为1:200，以确保荧光染料能够完全偶联。在搅拌下，向醋酸盐缓冲液（25 毫摩尔）中的壳聚糖溶液加入氢氧化钠，调节其 pH 至约 6.5，然后逐滴加入计算量的 sci-fi NHS。用铝箔包裹小瓶，使混合物避光，并在室温下振荡过夜。次日，使用 Pierce 的 10 K-M-W-C-O 透析膜，以 1% 醋酸盐缓冲液为透析液，在室温避光条件下透析两小时，对混合物进行纯化。两小时后，更换1%醋酸盐缓冲液，再透析两小时。室温避光条件下再次更换缓冲液，随后在4摄氏度避光条件下透析过夜。次日，从透析盒中取出纯化的标记聚合物。将标记有SCI五的壳聚糖收集到微量离心管中，并在-20摄氏度下保存。将链霉亲和素功能化的605量子点加入生物素化的血浆DNA溶液中。请确保使用ITK系列的量子点进行偶联，而不是普通的量子点系列，因为ITK系列的量子点是专为FRET实验设计的。将溶液在室温下孵育15分钟。量子点标记反应需避光进行，以防止可能的光漂白。孵育15分钟后，将标记有量子点的DNA加入50毫摩尔的硫酸钠溶液中，使终体积为200微升。为制备科幻聚合物，根据所需的NP比计算10微克质粒DNA所需的壳聚糖量。NP比是指壳聚糖溶液中质子化胺基与DNA溶液中带负电磷酸基团的理论摩尔比。用Milli-Q水将科幻壳聚糖稀释至目标NP比，最终体积为200微升。此时，量子点标记的DNA溶液与科幻壳聚糖溶液已准备就绪，可按第六节所示方法加载至微流控装置中。硅片需预先经piranha溶液清洗并烘烤，以去除表面水分，适用于指定25微米主模厚度的制备。在硅片上旋涂负性光刻胶，转速为2000 RPM，持续30秒。将晶圆置于热板上进行软烘，以每小时65摄氏度的升温速率升至95摄氏度。此步骤将蒸发SU-8光刻胶中的溶剂，并在紫外光曝光前使其固化。软烘后，在硅片上覆盖含有微通道设计的掩膜，于365纳米波长紫外光下曝光，剂量为250毫焦每平方厘米，曝光后在热板上以每小时65摄氏度的升温速率升至95摄氏度进行烘烤。使用SU-8光刻胶显影液显影，以检查是否完全显影。将晶圆浸入异丙醇中。异丙醇不应变浑浊。最后，为增强SU-8结构，将图案化的晶圆置于热板上进行硬烘烤，以每小时65摄氏度的升温速率升至200摄氏度。将晶圆在 200 摄氏度下保持至少五小时，然后逐渐冷却至室温。将 SU8 母版放入称量舟中。将硅胶弹性体与固化剂聚二甲基硅氧烷（PDMS）按10:1的比例混合。将PDMS混合物倒入SU-8模具中，并将称量皿置于真空干燥器中以去除气泡。在65°C下固化PDMS一至两小时。PDMS 固化后，使用打孔器从硅胶母模上剥离 PDMS 胶片，制备出两个通道入口和一个通道出口，用于流体装置。用乙醇清洗 PDMS 胶片和盖玻片，然后晾干。将清洗后的 PDMS 胶片和盖玻片在 20 瓦的氧气等离子体中进行处理。首先立即将PDMS条与盖玻片键合。将键合好的微流控芯片置于95摄氏度的烘箱中过夜。等离子体处理和过夜烘烤对于增强键合强度至关重要。在加载试剂之前，先用清水填充微流控通道，以确保内部无气泡。这将保证流体流动顺畅。实验过程中，通过管路将先前制备好的量子点（QD）、标记DNA以及科幻标记的壳聚糖溶液分别装入两个独立的玻璃注射器中。将管路连接至微流控装置的两个入口。操作过程中需小心，避免引入任何空气。在层流条件下，将流速设定为 20 纳升每分钟。当流动稳定约15至20分钟时，在显微镜下检查微通道。应在通道中心观察到量子点介导的荧光共振能量转移（FRET）。使用冷却CCD相机在通道的不同位置采集荧光图像。使用 ImageJ 和 OriginLab 软件分析这些图像。沿通道不同轴向位置监测由 FRET 介导的信号。根据应用的流速，利用该公式计算停留时间，其中 TISA bar 表示停留时间。时间 X 是指两股流体汇合处到待研究反应位置之间的距离，V 为平均流速。随后，可在本系统中分析由 FRET 介导的科幻信号的横截面强度分布。实验测得的分布曲线呈高斯分布。我们刚刚向您展示了如何在简单的微流控通道中通过量子介导的线程来监测DNA钉状复合物。进行这些操作时，重要的是要记住在微流控通道上设计一个标记，以便根据施加的流速和通道几何形状直接确定停留时间。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

combining-qd-fret-microfluidics-to-monitor-dna-nanocomplex-self

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

结合QD - FRET技术和微流体实时监测DN​​A纳米复合自组装

基于液滴的微流控平台有望用于高通量实验，因其能够以千赫兹速率低成本生成皮升级、自成隔室的微小反应容器。通过与快速、灵敏且高分辨率的荧光光谱方法相结合，可高效地提取、利用并整合这些系统中产生的大量信息。...

微流控液滴平台的荧光检测方法

本视频介绍了一种利用单分子成像技术，在特定基因位点上可视化融合蛋白凝聚体在DNA分子上组装的方法。这些凝聚体的形成源于LCD-LCD和LCD-DBD相互作用，从而能够招募RNA聚合酶II并增强基因转录。...

单分子成像可视化融合蛋白在DNA幕上凝聚体的组装

本文介绍了检测单个荧光标记的蛋白质分子与悬浮在两个光镊微球之间的单个DNA分子相互作用的仪器设备和方法。...

结合单分子操控与成像技术研究蛋白质-DNA相互作用

我们介绍一种基于微流控技术的电化学生物芯片，用于检测DNA杂交。在单链DNA探针功能化之后，通过互补和非互补的单链DNA靶标研究其特异性、灵敏度和检测限。结果表明DNA杂交事件对电化学系统的影响，检测限为3.8...

一种基于微流控的电化学生物芯片用于无标记DNA杂交分析

我们描述了一种具有简化（模拟）读出方式的终点数字检测方法，用于定量核酸。我们使用标准的qPCR仪对基于液滴的数字检测进行整体荧光测量，并通过显微镜确认结果。...

数字核酸定量检测的简易批量读取方法

我们提出一种简单的二氧化硅胶体纳米粒子自组装技术，用于在聚二甲基硅氧烷（PDMS）中的两个微通道之间构建纳米流体结。利用该技术，可在微通道内构建孔径低至约45...

通过胶体颗粒自组装工艺在PDMS微流控芯片中制备亚50 nm纳米流体结

单细胞测序可揭示生物系统中的基因型异质性，但现有技术缺乏对群落组成和功能进行深度分析所需的通量。本文介绍了一种微流控工作流程，可用于对来自不同细胞群体的超过&gt;50,000个单细胞基因组进行测序。...

一种用于单细胞基因组测序的超高通量微流控平台

利用量子点标记的DNA和全内反射荧光显微镜，我们可以在使用未标记蛋白质的情况下研究限制性内切酶的反应机制。这种单分子技术能够大规模多重观测单个蛋白质-DNA相互作用，并可将数据汇总以生成具有充分统计量的停留时间分布。...

限制性内切酶介导的DNA切割单分子停留时间分析

本文介绍了利用单分子成像技术——DNA幕帘法，研究EWS-FLI1凝聚物在DNA上组装的生物物理机制。...

单分子成像观察EWS-FLI1凝聚体在DNA上的组装

通过微流控腔室研究可视化单分子生物化学过程时，使用玻璃筒体的气密性注射器、将管路稳定连接至流动池，以及在注射器与管路之间安装切换阀以消除气泡，可极大地方便实验操作。本方案描述了双光镊技术，可用于观察DNA的动态过程及分子间相互作用。...

使用双光镊与微流控技术进行单分子研究

学习利用QD-FRET技术与微流体实时监测DNA纳米复合物的静电自组装过程。该方法通过量子点供体和有机荧光受体标记，实现基因治疗载体聚电解质复合物的可控合成与动态表征。

结合量子点-荧光共振能量转移与微流控技术实时监测DNA纳米复合物的自组装过程

探索更多视频