Name: 成人的心肌细胞的分离和遗传操作共聚焦成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 学习分离和培养成年大鼠心肌细胞的方法，利用腺病毒基因转移技术表达荧光融合蛋白或生物传感器，并通过共聚焦显微镜进行高分辨率成像。该技术可用于研究心脏细胞生理学和病理学。

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本工作得到了德国国家科学基金会（DFG）和德国联邦风险评估研究所（BfR，德国）的支持。

包含四个主要步骤的实验方案整体设计如图1所示。所有步骤均进行了详细描述。细胞分离、转导与培养，以及约24小时后的共聚焦成像，构成连续且必需的时间流程。病毒构建应在细胞分离之前完成，随后用于基因转导。
 1. 从大鼠心脏分离成年心肌细胞
 <ol>
 <li>使用腹腔注射麻醉剂溶液（每100 g体重注射170 μl）对体重约250 g的成年雄性Wistar大鼠（6–12周龄）进行麻醉。</li>
 <li>此外，注射柠檬酸盐溶液（每克体重2 μl）以防止手术过程中血液凝固。</li>
 <li>应准备好Langendorff灌注装置。所有溶液均需用氧气饱和。</li>
 <li>当大鼠被麻醉后，将其固定在手术板上，并用70%乙醇对上半身进行消毒。</li>
 <li>通过切断颈动脉处死动物。</li>
 <li>使用剪刀打开胸腔，此时心脏和主动脉应可触及。去除心包膜。</li>
 <li>使用26号针头将5 ml冰冻的溶液A+分别注入两个心室，以停止心脏跳动并冲洗血液。</li>
 <li>用夹子夹住主动脉，并在主动脉弓第一分支处将其截断。</li>
 <li>将心脏从胸腔中取出，并用镊子和夹子将主动脉连接至灌注装置的插管上，以实现逆行Langendorff灌注。注意避免刺破主动脉瓣。</li>
 <li>需用结扎线固定主动脉/插管部位。其他开放的血管也需结扎。</li>
 <li>在室温（23°C）下，以约70 mbar的压力，用氧气饱和的溶液A+对心脏进行逆行灌注，持续10分钟。确保无气泡进入主动脉。</li>
 <li>通过蠕动泵将灌注液切换为Liberase溶液，在37°C下以4 ml/min的流速灌注约25分钟。灌注结束时，心脏应呈现大理石样的白色。消化时间可能需要根据具体情况或组织状态进行调整。</li>
 <li>将心脏从灌注装置上取下，放入含有37°C溶液A的培养皿中。切除残留的血管和心房。弃去血管，心房（如需要）可另行处理（不属于本方案内容）。将心室切成约6块。</li>
 <li>将组织块转移至含有20 ml、37°C溶液A的100 ml锥形瓶中，在37°C水浴中轻轻振荡5分钟，最后弃去上清液。</li>
 <li>上述步骤重复一次或两次。上清液应略显浑浊。</li>
 <li>通过向锥形瓶中残留有溶液A的细胞和组织加入20 ml、37°C的溶液B1/2，开始逐步增加细胞外钙离子浓度。在37°C水浴中轻微振荡5分钟，随后弃去上清液。</li>
 <li>再加入20 ml溶液B1/2。（此时溶液/上清液中应含有活细胞。）取一滴细胞悬液转移至倒置细胞培养显微镜下的培养皿中。若细胞自发活动（收缩）较强，则需等待细胞静止后再进行后续操作。</li>
 <li>再次弃去上清液，并加入20 ml溶液B1/2。</li>
 <li>将塑料巴斯德吸管的尖端剪去，使其开口足够大，以便组织块在振荡时能顺利通过。通过火焰处理使切口处的锋利边缘变钝（熔化）。</li>
 <li>现在对组织块进行轻柔地吹打。组织块应“分散”成单个细胞。</li>
 <li>将含有细胞的上清液倾出，并用溶液B稀释至所需细胞密度，该密度取决于实验类型，应通过实验经验确定。</li>
</ol>
2. 用于融合蛋白转导的腺病毒构建
为了产生腺病毒，使用 MP Biomedicals 的 Transpose-Ad 腺病毒载体系统1。本方案从已有的并经过验证的入门载体（pCR259）开始，用于表达荧光融合蛋白或 GEB s2。
<ol>
<li>将上述含有目的基因的 pCR259 载体 10 ng 与 100 μl HighQ-1 Transpose-AD™ 294 感受态细胞共转化。</li>
<li>将该混合物在冰上孵育 20 分钟，随后在 42°C 进行 45 秒的热激处理，再放回冰上静置 2 分钟。</li>
<li>加入 900 μl 无选择性 LB 培养基，在 37°C 下轻柔振荡培养 4 小时。</li>
<li>分别取 50 μl、100 μl 和 200 μl 涂布于含有 LB 培养基并添加氯霉素（Cm，20 μg/ml）、氨苄青霉素（100 μg/ml）、四环素（15 μg/ml）、X-Gal（280 μg/ml）和 IPTG（40 μg/ml）的平板上。（若使用更昂贵的染料 Bluo-Gal（300 μg/ml），可实现更明显且更快的蓝色显色。当对蓝/白斑菌落的识别与区分尚不熟练时，建议使用此染料。）</li>
<li>在 37°C 下培养 24 小时，随后置于 4°C 直至能够清晰识别蓝色菌落。若难以判断哪些菌落为真正的白色菌落，可挑取部分菌落，在另一含有三种抗生素、X-Gal 和 IPTG 的平板上进行复制培养，并在 37°C 过夜培养以进一步确认。 
 注：HighQ-1 Transpose-AD™ 294 细胞含有两个重要质粒：腺病毒骨架（Transpose-Ad™ 294）以及一个表达转座酶的辅助质粒，该酶可介导目的基因插入到 Transpose-AD 294 质粒 LacZ 基因内的靶位点。</li>
<li>为鉴定含有目的基因的阳性克隆（即目的基因已插入病毒骨架中），按 2.7–2.9 所述进行菌落 PCR。使用位于多克隆位点两侧的载体引物（正向引物 5'CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG3'，反向引物 5'GCGGATAACAATTTCACACAGG3'），对所有 100% 白色菌落进行菌落 PCR，并以一个蓝色菌落作为对照（代表未插入目的基因的 Transpose-AD 294 质粒）。蓝色菌落将产生较短的 PCR 片段（约 200 bp），含有目的基因的菌落则显示较大的 PCR 产物（大小取决于目的基因长度），而出现两条条带的菌落为混合菌落，若需继续使用，应进行分离纯化。</li>
<li>根据下表配制主混合液（master mix）。</li>
<li>用灭菌牙签挑取单个 100% 白色菌落，并首先在含 Cm 的 LB 平板上复制一个菌落。</li>
<li>将菌落转移至 PCR 混合液中，轻轻搅动 3–4 次后取出牙签，避免其吸收过多 PCR 混合液。PCR 程序取决于插入片段的 kb 数及所用聚合酶，引物退火温度为 57°C，建议进行 35 个循环。</li>
<li>对阳性克隆进行过夜培养（LB 培养基加 Cm），并使用商品化无离心柱型质粒提取试剂盒提取质粒，因为离心力会破坏体积较大的病毒载体。</li>
<li>将 0.5 μg 提取的质粒转化至 100 μl DH5α 感受态细胞中。将 DNA 与细胞在冰上孵育 30 分钟，42°C 热激 45 秒，再置于冰上 2 分钟。</li>
<li>加入 900 μl 无选择性 LB 培养基，在 37°C 下轻柔振荡培养 1 小时。</li>
<li>取 50 μl 涂布于含 LB 培养基并添加 Cm、X-Gal 和 IPTG 的平板上，在 37°C 培养 24 小时。</li>
<li>挑取并复制最多 20 个 100% 白色菌落至分别含有氨苄青霉素、四环素和氯霉素并添加 IPTG 与 X-Gal 的平板上，37°C 过夜培养。选择 100% 白色、抗氯霉素、对氨苄青霉素和四环素敏感的菌落。</li>
<li>菌落 PCR（可选）：可再次通过菌落 PCR 检测阳性克隆，以确认其含有插入片段。</li>
<li>挑取单个阳性重组子菌落，在 600 ml LB 培养基（含 Cm）中培养。</li>
<li>使用质粒大提试剂盒提取质粒。</li>
<li>取 5 μg 质粒用 Pac I 在 37°C 消化 2 小时，随后在 65°C 反应 20 分钟以终止反应。</li>
<li>将整个消化产物在室温下用真空浓缩仪（SpeedVac）浓缩 30 分钟，终体积为 10 μl，或采用酚-氯仿抽提法进行纯化。</li>
<li>在 37°C 水浴中轻轻振荡解冻一支冻存的 QBI-HEK 293 细胞，用 70% 乙醇擦拭管外壁，并在无菌操作台中无菌操作。</li>
<li>将细胞转移至无菌 15 ml 离心管中，边轻柔振荡边逐滴加入 10 ml DMEM（含 10% FCS），随后在 250×g 离心 10 分钟以收集细胞沉淀。</li>
<li>弃去上清液，通过轻柔吹打将沉淀重悬于 10 ml DMEM（含 10% FCS）中。</li>
<li>接种至一个 75 cm2 培养瓶中，并向细胞中加入 10 ml 含 10% FCS 的 DMEM。在 37°C、5% CO2 培养箱中过夜培养。</li>
<li>次日检查细胞密度。QBI-HEK 293 细胞应以 1:10 至 1:20 的比例传代。</li>
<li>吸除培养基，加入 2 ml 胰蛋白酶消化 1–3 分钟，加入 10 ml DMEM 终止消化，250×g 离心 10 分钟。</li>
<li>小心吸除培养基，加入 10 ml 新鲜培养基，重悬细胞并计数。</li>
<li>在六孔板中分别接种 2×105、3×105、4×105、5×105 和 6×105 个细胞/孔。将培养板置于 37°C、CO2 培养箱中培养。</li>
<li>次日，选取一个汇合度约为 50% 的孔，用于转染浓缩的 Pac I 消化产物。我们使用 Lipofectamine 2000 转染效果良好，但其他方法（如磷酸钙转染法）也应适用。</li>
<li>转染前 3–4 小时更换培养基，使细胞在转染过程中处于指数生长期。</li>
<li>将 5 μl Lipofectamine 与 250 μl DMEM 混合，在室温下孵育 5 分钟。</li>
<li>将 Lipofectamine-培养基混合物加入 DNA（Pac I 消化产物）中，通过轻敲反应管混匀，切勿用移液器吹打混匀。室温孵育 20 分钟。</li>
<li>将转染混合物逐滴加入细胞中，并轻轻摇动培养板使其混合均匀。在 37°C、5% CO2 条件下培养，4–5 小时后更换培养基。</li>
<li>转染两天后，收集细胞培养上清液，转移至新的培养瓶（75 cm2）中。</li>
<li>用 500 μl 胰蛋白酶消化细胞，时间不超过 5 分钟。加入 1 ml DMEM，收集全部细胞悬液，并与 17 ml 新鲜培养基（含 FCS 的 DMEM）一同加入培养瓶中。在 37°C、5% CO2 条件下培养，直至出现细胞病变效应（CPE）。参见图 2 了解 CPE 的典型形态。</li>
<li>将细胞连同培养基收集至 50 ml 离心管中，于 -80°C 冻存。通过三次冻融循环（-80°C 与 37°C 水浴交替）裂解细胞。</li>
<li>在 4°C、8000×g 条件下离心 20 分钟，将上清液倾入 100 mm 培养皿中，弃去沉淀。使用孔径为 0.45 μm 的无菌滤器过滤上清液。此即为第一代病毒原液（传代 1）。</li>
<li>取该病毒原液的 1/3，用于转导一个汇合度为 70% 的 75 cm2 培养瓶中的 QBI-HEK 293 细胞。在 37°C、5% CO2 条件下培养，直至出现 CPE。</li>
<li>若细胞出现 CPE，收集细胞并按前述方法提取病毒。此为病毒传代 2。</li>
<li>使用第 2 代病毒重复步骤 2.37 和 2.38，依此类推，直至病毒扩增至足够量的病毒原液。病毒可通过特定离心管（Millipore 公司 Amicon Ultra-15 Centrifugal filter unit，含 ultracel-100 膜）进行浓缩，并在 -80°C 保存数月。通过空斑实验（plaque assay）测定感染性病毒颗粒数量。</li>
<li>使用第 2 代或更高代次的病毒进行细胞转导及进一步扩增。</li>
</ol>
3. 原代细胞培养与腺病毒转导
<ol>
<li>将直径为 20 mm 的无菌圆形盖玻片放入标准的 12 孔板中。</li>
<li>在每张盖玻片上均匀分配 20 μl ECM 溶液，弃去剩余溶液。在 37°C 下干燥至少 1 小时；或者可在室温下过夜干燥（12 小时）。</li>
<li>每孔加入含抗生素和 ITS 补充物的 1 ml M199 培养基。</li>
<li>向每孔加入 200 至 400 μl 的细胞悬液（来自步骤 1.21）。细胞在 37°C、5% CO2 培养箱中培养。</li>
<li>让细胞沉降，1 小时后更换培养基。</li>
<li>更换培养基后，立即轻轻摇动培养板，将适量含病毒的溶液（来自第 2 代或更高代次）混入孔中。</li>
<li>若进行长期培养，每 2 天更换一次培养基。</li>
<li>转染后 24 小时可检测到 GEB 表达。</li>
</ol>
4. 用于三维亚细胞结构和 Ca2+ 信号的共聚焦成像
共聚焦成像可在任何共聚焦显微镜上进行。然而，钙成像实验需要至少达到视频速率（25–30 Hz）的采集速度。这限制了可用技术的选择，只能采用多光束扫描仪（例如尼普科夫盘、扫场扫描仪或千束阵列扫描仪）或极快的单光束扫描仪（例如共振扫描仪或声光偏转器（AOD）扫描仪）。相关综述见参考文献3。三维亚细胞成像需要配备Z轴驱动装置。本实验中使用的是千束阵列扫描仪（VTinfinity，VisiTech Int.，英国桑德兰）。
<ol>
<li>显微镜及外周设备需要设置为工作模式。特别是激光器，可能需要一段预热时间，直至达到稳定的输出功率。</li>
<li>细胞需要转移至实验腔室（盖玻片转移）。将带有细胞的盖玻片转移至实验腔室中，然后加入1 mL Tyrode溶液（含1.8 mM细胞外钙）。</li>
<li>实验腔室需放置于显微镜载物台上。刺激电极、灌流装置及其他外周设备（如温度控制装置）需相应安置到位。</li>
<li>使用白光和/或落射荧光照明对细胞进行聚焦和选择。</li>
<li>需设置采集参数（如激光功率、曝光时间等）或完整的实验方案。</li>
<li>可采集时间序列和/或Z轴层扫图像。</li>
<li>在该系统上，还可结合电生理学（膜片钳）和/或光学操控技术（如光漂白后荧光再分布（FRAP）或包括双光子解笼在内的物质解笼技术），进行更高级的多模态测量。</li>
<li>图像分析，特别是三维重建，需使用专用分析软件完成，例如Imaris（Bitplane AG, Zürich, Switzerland）、VeloCity（Improvision, Coventry, UK）或Arivis Browser（arivis GmbH, Rostock, Germany）。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
该方案的最终结果是获得可用于提取更多数据的图像序列。
一个例子是对细胞内结构和细胞器的研究。图3展示了高尔基体三维排列的一个实例。与电子显微镜相比，所有这些研究均可在活细胞上进行。
<img src="/files/ftp_upload/1433/JoVEFig1.jpg" alt="心肌细胞分离、腺病毒转导及钙信号共聚焦成像示意图。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 图1： 主要实验步骤的总体流程。
<img src="/files/ftp_upload/1433/JoVEFig2.jpg" alt="未转导的Q-HEK细胞与病毒转导后出现细胞病变效应的显微镜图像。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 图2：左侧图像显示培养中未转导的Q-HEK细胞，融合度为90-95%。右侧图像显示病毒转导后的细胞病变效应。细胞变圆并从培养板底部脱落。由于病毒活跃复制，这些细胞的细胞核占据了细胞的大部分空间。
<img src="/files/ftp_upload/1433/JoVEFig3.jpg" alt="显示四种蛋白质定位分析方法的比较荧光显微图像。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 图3： 转染了靶向高尔基体的YFP融合蛋白的成年大鼠心肌细胞。腺病毒基因转导后（培养一天）的心肌细胞表达该荧光融合蛋白。图A显示从z轴层扫数据中获取的一个共聚焦光学切片。图B显示使用理论点扩散函数（PSF）去卷积处理后的同一细胞图像。该去模糊后的图像堆栈随后用于重建细胞，获得如图C所示的三维体积重建图像，或图D所示的三维表面重建图像。标尺代表10 μm。

<ol><li>Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaestner%2C+L+%22Molecular+Imaging+II%22">Molecular Imaging II</a>. Licha, K., Lin, C. P. Vol. 7370, SPIE. Bellingham. 737008-737008 (2009).</li>
<li>Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).</li>
<li>Shorte, S. L., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaestner%2C+L+%22Imaging+Cellular+and+Molecular+Biological+Functions%22">Imaging Cellular and Molecular Biological Functions</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. 289-289 (2007).</li>
<li>Kaestner, L., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaestner%2C+L+%22Optics+in+Life+Science%22">Optics in Life Science</a>. Popp, J., von Bally, G. Vol. 6633, SPIE. Munich. 66330K-66330K (2007).</li>
<li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+%28shRNA%29+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).</li>
</ol>

所述的大鼠心肌细胞分离方法可根据需要调整用于其他物种，例如小鼠4。需要调整的参数包括消化用的酶混合液（见下文）以及消化时间。需注意，某些物种的细胞（如小鼠）可能比其他物种（如大鼠）更脆弱。
胶原酶的选择可能是分离过程中最关键的一步。我们选用Liberase Blendzyme，因为它是一种合成的酶混合物，几乎不存在批间差异。传统方法是使用从溶组织梭菌（Clostridium histolyticum）提取的所谓粗制胶原酶，这也是一种有效的方法。然而，由于存在批间差异，每一批新酶都需要重新优化实验条件。
除了荧光融合蛋白和GEB转导外，腺病毒基因转移还可用于功能蛋白的过表达或其下调（例如通过RNAi5）。这得益于其转导效率高（&gt; 95%）且可重复。

<table><tbody><tr><td>麻醉溶液</td><td>Serumwerk Bernburg GmbH（Ursotamin），拜耳医药保健（Rompun）</td><td></td><td>1 ml 乌索他明（100 mg/ml 氯胺酮盐酸盐）与 240 的混合物 &amp;#x03BC;l Rompun（2% 盐酸赛拉嗪）</td></tr><tr><td>柠檬酸盐溶液</td><td></td><td></td><td>117.64 mg 柠檬酸钠溶于 10 ml 0.9% NaCl 溶液</td></tr><tr><td>溶液A</td><td></td><td></td><td>134 mM NaCl，4 mM KCl，11 mM 葡萄糖，1.2 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，1.2 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，10 mM HEPES，用10 M NaOH调节pH至7.35，经无菌过滤</td></tr><tr><td>溶液A+</td><td></td><td></td><td>溶液A中加入0.2 mM EGTA，用10 M NaOH调节pH至7.35，经无菌过滤</td></tr><tr><td>Liberase 溶液</td><td>F. Hoffmann&amp;#8208; 罗氏有限公司</td><td>11988476 001</td><td>500 &amp;#x03BC;15 ml 溶液A中的l储备液（储备液：10 mg/ml Liberase Blendzyme 4溶于去离子水）</td></tr><tr><td>溶液B</td><td></td><td></td><td>溶液A的含量加200 &amp;#x03BC;M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 0.1% DNase 溶液</td></tr><tr><td>溶液B&lt;sub&gt;1/2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>溶液A与溶液B按1:1比例混合</td></tr><tr><td>DNase 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶 I，2 型，40 KU（15 mg）溶于 5 ml 10 mM Tris 中&amp;#8208;HCl 缓冲液，调节至 pH = 7.35，额外添加成分：50 mM NaCl，10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，1 mM 二硫苏糖醇&amp;#8211;赤藓醇；将该溶液与5 ml甘油混合</td></tr><tr><td>细胞外基质蛋白（ECM）溶液</td><td>细胞外基质蛋白（ECM）溶液</td><td>E1270</td><td>1 ml 原液按购买时的状态用 6 mL M199 培养基稀释</td></tr><tr><td>M199 培养基</td><td>PAA Laboratories</td><td>E15&amp;#8208;834</td><td>M199 培养基添加 1 &amp;#x03BC;l/ml ITS 溶液和 20 &amp;#x03BC;l/ml 青霉素&amp;#8208;链霉素溶液（5000 单位/毫升）</td></tr><tr><td>ITS 溶液</td><td></td><td></td><td>25 mg 胰岛素，25 mg 转铁蛋白和 50 &amp;#x03BC;l 将亚硒酸盐储备液溶解于5 ml去离子水中（储备液：0.5 mg/ml 亚硒酸钠溶于去离子水中）。加入数滴1 M HCl，直至溶液变为澄清。分装后可冷冻保存。</td></tr><tr><td>Tyrode</td><td></td><td></td><td>135 mM NaCl，5.4 mM KCl，1.8 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，10 mM 葡萄糖，10 mM HEPES，用 10 M NaOH 调节 pH 至 7.35，经无菌过滤</td></tr><tr><td>预混液</td><td></td><td></td><td>5 &amp;#x03BC;10 l&amp;#215;PCR&amp;#8208;缓冲液，5 &amp;#x03BC;l MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (25 mM)，2 &amp;#x03BC;l 上游引物，2 &amp;#x03BC;l 反向引物，1 &amp;#x03BC;l dNTP&amp;#180;s（各10 mM），33 &amp;#x03BC;1 L&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 1 &amp;#x03BC;1 μL DMSO &amp;#x03BC;l Taq&amp;#8208;每个样品的DNA聚合酶</td></tr><tr><td>LB&amp;#8208;培养基</td><td></td><td></td><td>10 g/l 胰蛋白胨，5 g/l 酵母提取物，5 g/l NaCl（若用作固体培养基则含 15 g/l 琼脂），pH 7.0</td></tr><tr><td>Pac I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547L</td><td>准备：50 &amp;#x03BC;基因组 DNA，5 &amp;#x03BC;10 l&amp;#215;缓冲液，0.5 &amp;#x03BC;100 l&amp;#215;BSA，0.75 &amp;#x03BC;l Pac I，用H填充&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 加至终体积 50&amp;#x03BC;l</td></tr></tbody></table>

成年心肌细胞的分离与遗传操作用于共聚焦成像

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

从成年心脏分离的心肌细胞被广泛接受为介于胚胎和新生肌细胞与完整工作心脏之间的一种模型。因此，心肌细胞可作为心脏细胞生理学与病理生理学、药物研究以及转基因动物模型探索的良好模型。本文介绍了一种从心脏分离细胞的方法，并展示如何在无需培育转基因动物的情况下对心肌细胞进行遗传操作：即长期培养（1周）与腺病毒介导的基因转移相结合的技术。后者涵盖了从病毒构建到细胞转导的全过程。该方法可用于表达基因编码的生物传感器（GEBs）、荧光融合蛋白，也可用于蛋白质的过表达或下调，例如利用RNA干扰技术。本文以表达标记亚细胞结构（高尔基体）的融合蛋白为例进行说明。此类蛋白表达可通过共聚焦显微镜对z轴层扫图像进行三维重建，实现亚细胞结构的可视化。本方案整合了细胞培养、分子生物学与生物物理学的前沿技术，为细胞心脏病学的新领域探索提供了有效途径。

关键词：心肌细胞，原代培养，腺病毒基因转移，基因编码生物传感器，荧光融合蛋白，RNA干扰，共聚焦显微成像，三维重建，高尔基体，细胞心脏病学

成年心肌细胞是从动物心脏中分离并可培养数天的原代细胞。在此培养期间，可利用腺病毒基因转导表达基因编码的生物传感器（GEBs）或荧光融合蛋白。这两种方法均可通过共聚焦显微镜进行细胞水平的研究。

从成年心脏分离的心肌细胞被广泛接受为一种介于胚胎和新生肌细胞与……之间的中间模型

该实验首先从成年大鼠体内取出心脏，随后对心脏进行消化处理并分离出单个心肌细胞。分离得到的细胞进行培养。腺病毒基因转导可导致荧光融合蛋白或基因编码的生物传感器在心肌细胞中表达，表达报告蛋白的心肌细胞可通过共聚焦显微镜进行观察和进一步分析。大家好，我是来自斯兰德大学医学院分子细胞生物学研究所的Kain。我是同样来自分子细胞生物学研究所的Lars。我也是来自同一实验室的Uncle。今天，我们将向您展示一种分离心肌细胞并转导荧光融合蛋白或基因编码生物传感器的方法，以及随后的共聚焦成像步骤。我们在实验室中使用该方法在细胞水平上研究心脏生理学、病理生理学和药理学。现在，让我们开始吧。开始此操作前，准备离体心脏灌注（LOR）装置，配制并填充所有溶液，并将设备预热至37摄氏度。确保所有溶液均充分饱和氧气，并从管路中彻底排除气泡。选用6至12周龄、体重约250克的成年雄性Wistar大鼠，通过吸入二氧化碳进行预麻醉，以方便动物操作。麻醉通过腹腔注射进行，每100克体重注射170微升麻醉溶液。此外，为防止手术过程中血液凝固，按每克体重2微升的剂量注射柠檬酸盐溶液。当大鼠麻醉后，将其固定在手术板上，并用70%乙醇对身体上部进行消毒。通过切断颈动脉处死动物，然后用剪刀打开胸腔。暴露心脏和主动脉后，去除心包膜。使用26号针头向两个心室各注射5毫升冰冻的a plus溶液，以停止心脏活动并冲洗血液。接下来，用镊子夹住主动脉，并在主动脉弓处剪断，位置位于主动脉首次分支处。剪断后，将心脏从胸腔中取出，并使用镊子和夹子将主动脉连接到灌流装置的插管上。注意避免损伤主动脉瓣。需要用结扎线在主动脉周围结扎以固定心脏。导管、装置以及开放的血管也需进行结扎。现在可以使用氧气饱和的溶液，在室温下以约70毫巴的压力逆行灌注心脏10分钟。确保在10分钟结束时无气泡进入主动脉。灌注结束时，使用蠕动泵以每分钟4毫升的速率，将灌注液更换为37摄氏度的解离酶溶液，持续约25分钟，此时心脏应呈现大理石样的白色。消化时间可能需要根据心脏的大小进行调整。用裂解液消化后，将心脏从灌流装置中取出，放入含有溶液A的培养皿中。在37摄氏度条件下，剪去残留的血管和心房，然后将心室切成大约六块。将切好的心室组织块转移至含有20毫升溶液A的100毫升锥形瓶中，溶液温度为37摄氏度，在37摄氏度水浴摇床中轻轻振荡孵育5分钟。五分钟后，组织块大部分仍位于烧瓶底部，上清液略显浑浊。弃去上清液，并重复轻柔振荡。接下来，向锥形瓶中剩余的细胞和组织加入10毫升37摄氏度的溶液B，使细胞外钙离子浓度升高。将锥形瓶置于37摄氏度水浴摇床中轻轻振荡5分钟，再次弃去上清液。加入20毫升溶液B一。此时一半的溶液中含有活细胞。取一滴细胞悬液转移至培养皿中，使用倒置细胞培养显微镜进行观察。若细胞表现出强烈的自发性收缩，则需等待细胞恢复静止状态。再次弃去上清液，加

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

成人的心肌细胞的分离和遗传操作共聚焦成像

本文介绍了使用兰格多夫灌流系统分离成年小鼠心肌细胞的方法。所获得的细胞具有钙耐受性，电生理静息，并可进行培养，以及利用腺病毒或慢病毒感染来调控基因表达。此外，还可利用MMSYS系统和膜片钳技术分析其功能特性。...

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与功能表征

为了研究心肌细胞的收缩功能和钙瞬变，可从野生型和突变型小鼠心脏中分离出单个心肌细胞。这有助于表征由任何原因引起的心功能障碍中细胞功能障碍所起的作用。...

小鼠心肌细胞的分离与生理学分析

我们描述了一种分离成年小鼠心肌细胞的可靠方法。该方案可稳定地从多种基因修饰小鼠中培养出具有功能的成年心肌细胞。...

成年小鼠心肌细胞的分离与培养用于细胞信号转导研究 体外 心脏肥大

在心肌细胞中，管状膜结构形成细胞内网络。本文描述了以下优化方案：i）从小鼠心脏分离心肌细胞（包括质量控制），ii）用于先进荧光显微镜成像的活细胞染色，以及...

心房与心室心肌细胞中管状膜网络的分析

本方案描述了一种可重复地分离成年小鼠心肌细胞并进行长期培养的逐步操作方法，具有较高的得率、纯度和细胞活性。...

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与转导

本方案采用组织块消化法从成年小鼠心脏中分离单个心房心肌细胞。该方法可用于分离右心房或左心房心肌细胞，进而用于膜片钳实验中对心房心肌细胞电生理特性的表征研究。...

从成年小鼠中分离心房心肌细胞

我们介绍了分离小鼠心肌细胞的方法，以及如何利用荧光光度法结合同时进行的数字细胞形态测量，同步获得动作电位或钙瞬变信号与肌节缩短信号。...

分离小鼠心室肌细胞的光学成像

本研究的目的是建立一种可重复地从成年心脏中分离心肌细胞并测量其DNA含量和核化程度的方法。...

从固定心脏中分离心肌细胞用于免疫细胞化学和倍性分析

本文描述了一种从单个成年小鼠心脏的心房和心室同时分离心肌细胞和非心肌细胞的方法。该方案可稳定获得高活力的心肌细胞和非心肌细胞，并详细说明了适用于细胞表型鉴定和体外分析的优化细胞特异性培养条件。...

成年小鼠心脏中同时分离与培养心房心肌细胞、心室心肌细胞及非心肌细胞

本方案描述了对朗根多夫（Langendorff）方法的改进，包括主动脉插管的深度，以实现从成年小鼠中同时分离心房和心室肌细胞。...

对Langendorff法的改良以实现从成年小鼠中同时分离心房和心室心肌细胞

在心脏病学领域，细胞和分子功能实验的金标准是心肌细胞。本文介绍了对非兰格多夫技术进行的改进，用于分离小鼠心肌细胞。...

一种简单高效且可重复分离小鼠心肌细胞的方法

学习分离和培养成年大鼠心肌细胞的方法，利用腺病毒基因转移技术表达荧光融合蛋白或生物传感器，并通过共聚焦显微镜进行高分辨率成像。该技术可用于研究心脏细胞生理学和病理学。

成年心肌细胞的分离与遗传操作用于共聚焦成像

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