人死后脑组织中的单细胞群获得高品质的RNA

我们描述一个过程，利用激光捕获显微切割分离和提取RNA从一个同质的细胞群，锥体神经元，在上级死后人类大脑颞上回第三层。其后，我们线性放大（T7基于）的mRNA，Affymetrix公司人类X3P芯片杂交样品。

该程序首先在设置在零下 17 摄氏度的低温恒温器上将 8 微米液氮蒸气冷冻组织块切片到普通不带电荷的载玻片上。此后，用 histo 基因染色试剂盒对切片进行染色。识别出锥体神经元后，大约 500 个细胞被激光捕获到 HS 捕获帽上。

将带有细胞的盖子放入含有 50 微升提取缓冲液的微量离心管中，倒置并置于先前位于伊拉克的 Falcon 管中，置于设置为 42 摄氏度的水浴中。经过短暂的离心步骤后，取下瓶盖。然后，剩余的溶液即可用于 RNA 分离。

大家好，我是来自麦克莱恩医院结构和分子神经科学系 Wilson Wu 实验室的 Charmaine Peterson。今天，我们将向您展示一种从人类死后脑组织中激光捕获寄生金属神经元的程序。我们在实验室中使用该程序来使用微阵列技术研究精神分裂症受试者的上回和不良回的差异基因表达。

那么让我们开始吧。脑组织是从哈佛脑组织资源中心获得的，在组织切片前以液氮蒸气冷冻块的形式。减少 RNA 污染很重要，所有表面，包括工作区域、切片刀片和载玻片都用 RNA 去污溶液（如 RNA SAP）处理，并用 100% 乙醇擦拭。

该程序首先在设置为零下 17 摄氏度的低温恒温器上将液氮蒸气冷冻组织块切片到不带电的普通载玻片上。组织切片现在已准备好使用 histo 基因快速染色试剂盒鉴定锥体神经元。制备乙醇脱水系列：将 25 毫升适当浓度的乙醇和不含 RNA 的水等分装到组织基因试剂盒提供的染色罐中。

将所有罐子放入冰桶中，除了一个 75% 乙醇罐。将 75% 乙醇放入零下 20 摄氏度的冰箱中。接下来，通过每 100 μL 染色液添加 1 μL RNA 抑制剂来制备染色液。

由于我们将在两张载玻片上对四个组织切片进行染色，因此在微量离心管中的 400 微升染色溶液中加入 4 微升 RNA 抑制剂。将染色溶液放在冰上。在通风橱下。

将分子筛加入二甲苯罐中以去除多余的水分，这可能会损害组织提升。打开水浴，将温度设置为 42 摄氏度，并将 50 毫升的 Falcon 管放入水浴中，由架子支撑。从零下 80 摄氏度的冰箱中取出两张载玻片，然后用 Kim 抹布解冻。

零下 20 摄氏度的冰箱中，将组织在 75% 乙醇中短暂固定约 20 秒或直到载玻片的角落开始解冻。然后使用无 RNA 的镊子，将载玻片转移到无核酸酶的水中进行第 32 次洗涤 玻片清洗后，用 PAP 屏障笔勾勒切片轮廓，将染色溶液浓缩在切片上 用组织基因染色溶液对四个切片染色 20 秒。每个切片使用 97 μL 染色划痕 RNA 抑制剂，将先前制备的乙醇中的切片在冰上脱水 30 秒。

最后的 100% 乙醇步骤应延长至 3 分钟，以达到充分脱水以充分提升组织。最后，将载玻片浸入二甲苯中 5 分钟，让载玻片完全风干，然后再进行激光捕获显微解剖，在对单细胞激光捕获程序进行染色后，必须立即去除锥体神经元。显微解剖或 LCM 需要一个 42 摄氏度的水浴，其中包含一个 50 毫升的 Falcon 管，该管由前面设置的 a 支撑。

单细胞 LCM 是通过 ARCTURUS XT 激光捕获系统和软件完成的。要开始此过程，请将玻片和瓶盖加载到 arcturus XT 装置上。使用捕获 HS 上限，但将程序设置保留在宏上。

单击带有概述的框加载以获取每张幻灯片的概述照片。以 2 倍放大倍率调整亮度焦点，以确定激光捕获的最佳部分。避免过度折叠的组织切片，但选择完整、光滑且有染色的切片。

好吧，在您将要捕获的一般区域上放置一个上限，确保在我们的示例中包括要捕获的区域。皮层的第三层。确保帽轨没有搁在任何折叠上，因为这会使帽倾斜，从而导致光斑尺寸可变。

接下来，以 40 倍放大倍率手动确认红外激光点的位置。蓝色十字应位于红外激光光斑的中心。如果没有，请通过右键单击该点并选择位于的 IR 点来调整其位置。

在 40 倍放大倍率下，根据以下标准识别锥体神经元，一个在形状上细胞我们的锥体，第二个，顶端和/或基底树突的近端部分是可识别的。通过单击位置功能上的加号来保存盖子的位置。这样，如果盖子被移动，它总是会返回到您调整光斑大小的同一位置。

在控制框中输入这些值，70 为 power，16 为 duration。由于这些参数对我们的组织是特定的，我们建议您在开始之前根据您的特定组织样本测试和调整这些变量。使用激光捕获单个单元格，取消单击自动移动舞台选项，并确保正确大小的符号与右侧面板上的符号相关。

选择右下角的圆圈选项，选择要测试捕获的神经元。将蓝色十字与圆圈对齐后，单击测试 IR 点激活激光。激光产生的光斑应首先在捕获的物体周围有一个清晰的黑环。

确保环足够大以包含细胞，但又足够小，以至于不包含不需要的组织或其他细胞。如果此环太轻，则未捕获单元。如果黑环中间有黑点，则激光强度斩击持续时间过长。

在要捕获的层内组织的不同部分重复此过程。要检查污点大小是否因位置而异，请进行相应调整。识别锥体神经元以捕获大约 500 个细胞。

按下激光捕获按钮以捕获细胞。将盖子移至 QC 站。确保至少 90% 的神经元被移除。

如果没有，请在捕获大多数单元格的区域捕获更多单元格。将盖子放入含有 50 μL 提取缓冲液的 0.5 mL 微量离心管中。瓶盖设计完美贴合，以防止缓冲液泄漏。

将组件倒置，确保提取缓冲液覆盖整个瓶盖，并将其放在 50 毫升 Falcon 管的底部，置于 42 摄氏度的水浴中。孵育神经元 30 分钟以从帽上去除组织，孵育后，以 800 gs 离心试管和帽组件 2 分钟。离心后，取下盖子。

如果 RNA 分离仅在稍后进行。将剩余的细胞提取物储存在零下 80 摄氏度。否则，如下一节所示，继续从细胞提取物中分离 RNA，使用 PICO pure 分离试剂盒进行 RNA 分离，该试剂盒旨在从 LCM 样品中分离少量细胞并保留低丰度 mRNA。

要开始此过程，请将试剂盒中提供的 70% 乙醇添加到细胞提取物中，并在预处理的纯化柱上离心。为了在洗涤后将 RNA 与柱过滤器结合，用 D Ns 处理 RNA 以消除 DNA 干扰的风险。此步骤在实时 R-T-P-C-R 等下游应用中尤为重要。

DNA 消化后，加入 40 微升洗涤缓冲液 1，并以 8， 000 Gs 离心纯化柱 15 秒，然后根据试剂盒提供的方案进行洗涤，但将洗涤缓冲液 2 的最终洗涤步骤从两分钟延长到两分半钟，以确保柱中没有洗涤缓冲液残留， 这会降低您的 RNA 产量。将色谱柱转移到另一个微量离心管中。加入 elucian 缓冲液，在色谱柱中的过滤器上孵育 1 分钟，离心色谱柱以洗脱 RNA。

最后，通过运行 Experian High Sense 实验室芯片检查提取的 RNA 的质量，该芯片提供虚拟凝胶和电泳图移液器，将 1.3 μL 样品移液到 0.5 mL试管中。对于质量控制测试，将样品的其余部分在零下 80 摄氏度下冷冻。一旦 RNA 的质量得到验证，就可以对其进行扩增、标记和杂交。

对于基因表达谱分析，将使用 ribo amp HS plus 试剂盒进行两轮线性扩增，这应产生大约 50 微克的扩增 RNA，足以进行微阵列和 Q-R-T-P-C-R 实验。使用 Molecular Devices 的 turbo 生物素标记试剂盒和标记来标记扩增的 RNA。最后，将使用来自 atrix 的人类 X 基因芯片 pro beret 进行基因表达分析。

组织切片应产生两张载玻片，每张载玻片两节，每例总共四节。每个部分都应该光滑，撕裂、开裂或折叠最少。锥体神经元应进行 20 至 25 μm 左右的深色染色，呈锥体形状，顶端树突可见。

在 LCM 过程中，激光脉冲穿过热塑性薄膜后，细胞粘附在盖子上，因此不再在载玻片上离开周围组织。在大约 85% 到 100% 的神经元后面，应在宏设置下用捕获 HS 帽粘附在帽上，并正确调整激光功率和强度。对于每个切片，每个切片应获得大约 500 至 700 个细胞，因此每箱至少需要 500 pg 的总 RNA。

总 RNA 分离后，通过 BioRad Experian 通过电泳图和虚拟凝胶评估 RNA 质量。在电泳图中，您应该看到两个不同的峰，对应于死后组织的 18 s 和 20 a s 核糖体 RNA 单元。然而，情况并非总是如此，因为组织可能会因切片前的因素而退化。

您通常会看到一个大的凸起，表明降解，在 18 秒左右有一个大峰值，在红色箭头指示的 28 秒左右有一个较小的峰值。相反，降解过多的劣质 RNA 将由曲线下面积较大的电泳图表示。除了在两轮线性扩增后降低扩散位置以测试 mRNA 的质量外，我们还使用 BioRad Experian 标准 Sense 实验室芯片和 NanoDrop 分光光度计。

传统的 Atrics 微阵列技术要求 mRNA 转录本扩散长度至少为 600 个核苷酸，以便使用此方案进行检测。正如电泳图所示，mRNA 扩散达到 1000 个核苷酸的范围，大峰随时间缓慢下降。虚拟凝胶也证实了这一结果。

如果转录本长度短于 600 个核苷酸，则不应包括样品对于杂交，NanoDrop 读数表明样品的平均比率为 2 60 比 2 80 或纯度为 2.5。平均浓度为 1.7 μg/μL，每个样品约 50 μg mRNA，足以用于微阵列分析和后续验证，这需要 15 至 20 μg mRNA 并随后使用 QR TPCR 验证结果。我们的结果表明，通过该方案，获得的 RNA 的数量和质量都足以通过 atrix 人 X 芯片研究基因表达差异。

与 Atrics Human X 3 P 芯片杂交后，我们实现了平均 26.6% 的百分比检出，表明杂交和探针强度足够。我们刚刚向您展示了如何从死后人脑组织中激光捕获寄生金属神经元，以便使用从这些细胞中获得的 RNA。对于微阵列 G 分析研究，在执行此程序时，重要的是在无 RNA 的环境中执行所有步骤并及时完成这些步骤，以保持 RNA 的完整性。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。