Name: 人死后脑组织中的单细胞群获得高品质的RNA (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-06T19:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: 学习使用激光捕获显微切割技术从人死后脑组织的锥体神经元中分离RNA，并通过微阵列技术进行基因表达分析。该方法为研究精神分裂症等神经精神疾病的分子机制提供了可靠手段。

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我们衷心感谢Molecular Devices Analytical technologies/Arcturus慷慨捐赠本研究所用的试剂。同时感谢哈佛组织资源中心提供尸检后的人类脑组织。资助：RO1MH76060 和 P50MH080272。

<ol><li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Res. 33, e56-e56 (2005).</li>
</ol>

本视频文章的制作由 Life Technologies 赞助。

本文旨在定制一种利用Arcturus XT系统及相关RNA提取试剂盒，从异质性尸检脑组织中分离出均一细胞群体的实验方案。如上所述，我们对厂商提供的原始方案进行了一些修改，以最大限度地保持RNA的完整性。成功捕获单个细胞完全依赖于在捕获前优化各项步骤，以获得数量最多且RNA质量良好的细胞。这些步骤包括与组织切片和染色相关的各种参数。简而言之，在组织制备方面，具体包括：1）降低切片时的温度梯度；2）每张载玻片仅放置两个切片；3）所有脱水步骤均在冰上进行；4）在染液中添加RNase抑制剂；5）将最后一步100%乙醇中的脱水时间延长至3分钟。
关于捕获，我们认为使用CapSure HS帽并配合显微切割软件的Macro模式设置，应能确保获得最佳结果。捕获单个细胞时，必须控制环境湿度，因为高湿度会显著降低组织的“提升”效果。高温也会对RNA质量产生不利影响。
使用PicoPure试剂盒进行RNA提取时，包含两个洗涤步骤。在将样品转移至另一微量离心管进行RNA洗脱前，必须确保完全去除所有洗涤缓冲液，因为最终样品中残留的缓冲液会导致可用于扩增的起始RNA量减少。为确保彻底去除缓冲液，我们采用2.5分钟的离心时间，而不是试剂盒说明书建议的2分钟。
在大多数情况下，线性扩增步骤按照制造商的说明书进行。然而，使用该方案时应注意两个关键点：1）尽量减少在离心管之间转移样品时造成的RNA损失，建议仅使用配套的0.5 ml离心管，并配合0.5 ml适配块在PCR仪中进行操作；2）在将样品转移至纯化柱以纯化cDNA时，第一次转移后务必对样品管进行短暂离心，以收集管壁残留液体。这样可额外获得1–2 µl样品加入纯化柱，从而提高cDNA的回收率。
当使用TURBO末端标记试剂盒对有限量的aRNA样本进行生物素标记时，我们建议额外添加几个 &mu;在上柱前加入数微升水，以增加从柱子中提取的标记RNA产量。额外延长一分钟离心时间也会对此有所帮助，特别是在处理降解组织（如FFPE组织）时。
我们确信，该实验方案能够帮助使用者从异质性的死后脑组织中分离出小而均一的结构，例如单一的细胞群体。这可以减少周围结构及其他细胞类型在脑内各层中造成的稀释效应，从而使研究结果更特异性地反映目标细胞类型的特征。由于所获得RNA的质量足以用于微阵列研究，我们得以进一步精确定位在疾病状态下受影响的特定细胞群体的分子特征谱。

<table><tbody><tr><td>4.5&amp;#8221; 镊子</td><td>VWR international</td><td>82027-392</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus XT&amp;#8482; 激光显微切割（LCM）系统</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>13821-00</td><td></td></tr><tr><td>CapSure&amp;#8482; HS LCM 帽</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>LCM 0214</td><td></td></tr><tr><td>CapSure&amp;#174; Macro LCM 帽</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>LCM 0211</td><td></td></tr><tr><td>Experion&amp;#8482; 自动电泳仪</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7001</td><td></td></tr><tr><td>Experion&amp;#8482; RNA HighSens 芯片</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7155</td><td>10 片</td></tr><tr><td>Experion&amp;#8482; RNA HighSens 试剂</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7156</td><td>10 片</td></tr><tr><td>Experion&amp;#8482; RNA StdSens 芯片</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7153</td><td>10 片</td></tr><tr><td>Experion&amp;#8482; RNA StdSens 试剂</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7154</td><td>10 片</td></tr><tr><td>Falcon&amp;#174; 聚丙烯圆锥形离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp&amp;#174; 带凸盖的薄壁反应管</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010611</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip&amp;#174; 人 X3P 芯片</td><td>Affymetrix</td><td>900516</td><td>6 片</td></tr><tr><td>Histogene&amp;#174; LCM 冷冻切片染色试剂盒</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>KIT0401</td><td>用于染色液、染色缸、乙醇和二甲苯</td></tr><tr><td>Histogene&amp;#8482; LCM 载玻片</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>12231-00</td><td></td></tr><tr><td>显微载玻片盒</td><td>VWR international</td><td>48444-004</td><td></td></tr><tr><td>Microm HM 505E 冷冻切片机</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22-050-350</td><td>当前产品已停售，此为类似产品的目录编号</td></tr><tr><td>微处理器控制 280 系列水浴锅</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>51221048</td><td>型号 282</td></tr><tr><td>分子筛</td><td>EMD Millipore</td><td>MX1583L-1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>n/a</td><td>NanoDrop 1000 已停售，NanoDrop 2000 性能相当</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>PEN 膜玻璃载玻片</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>LCM 0522</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure&amp;#174; RNA 提取试剂盒</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>RiboAmp&amp;#174;HS&lt;sup&gt;PLUS&lt;/sup&gt; 生物素标记试剂盒</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>KIT0511B</td><td>12 次反应，包含 TURBO 生物素标记&amp;#8482; 试剂盒</td></tr><tr><td>RNase Zap&amp;#174;</td><td>Ambion</td><td>AM9780/2</td><td></td></tr><tr><td>无 RNase 的 DNase 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNasin&amp;#174; Plus</td><td>Promega Corp.</td><td>N261B</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&amp;#8482; III 逆转录酶</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr></tbody></table>

从人死后脑组织的单细胞群体中获取高质量rna

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

我们拟通过分析第三层锥体神经元的基因表达谱，研究精神分裂症患者中观察到的颞上回灰质减少现象。众所周知，大脑皮层是一种高度异质性的结构，包含不同的区域、层次和细胞类型，每种结构单元都具有独特的细胞和分子组成，因而表现出差异化的基因表达谱。为了规避组织异质性带来的混杂效应，我们采用激光捕获显微切割技术（LCM）来分离特定的细胞类型，即锥体神经元。
使用Arcturus XT LCM系统捕获了约500个经Histogene染色液染色的锥体神经元。从捕获的细胞中提取RNA，并使用Arcturus/Molecular Devices试剂盒进行两轮基于T7的线性扩增。Experion LabChip（Bio-Rad）凝胶及电泳图谱显示所获得的a(m)RNA质量良好，转录本长度超过适用于微阵列分析的600nt。所获得的mRNA平均产量为51μg，A260/280比值平均为2.5，表明样品纯度符合要求。采用Affymetrix公司的人类X3P GeneChip探针阵列进行基因表达谱分析。

我们描述了一种利用激光捕获显微切割技术，从死后人脑颞上回第三层的同质细胞群体——锥体神经元中分离并提取RNA的方法。随后，我们对mRNA进行线性扩增（基于T7系统），并将样本杂交至Affymetrix人类X3P微阵列。

从人死后脑组织的单细胞群体中获取高质量RNA

我们拟通过分析基因表达，研究精神分裂症患者中观察到的颞上回灰质减少现象。

该实验步骤首先将八微米厚的液氮蒸汽冷冻组织块置于设定为零下17摄氏度的恒冷切片机上，切片至普通未带电荷的玻璃载片上。随后，使用组织基因染色试剂盒对切片进行染色。在鉴定出锥体神经元后，约500个细胞被激光捕获至HS捕获帽上。将带有细胞的盖子倒置放入含有50 µL裂解缓冲液的微量离心管中，然后将该管放入之前置于伊拉克的Falcon管中，并置于42 °C的水浴中。经过短暂离心步骤后，移除盖子。剩余溶液即可用于RNA提取。大家好，我是来自麦克莱恩医院结构与分子神经科学系吴威尔逊实验室的Charmaine Peterson。今天我们将向您展示一种从人类死后脑组织中激光捕获参数神经元的技术。在我们的实验室中，利用该技术结合微阵列技术，研究精神分裂症患者大脑 superior 和 poor 回中基因表达的差异。下面我们开始。脑组织来自哈佛脑组织资源中心，为液氮蒸汽冷冻的组织块，在进行组织切片前保存于此状态。为减少RNA污染，所有表面均需处理，包括工作区域、切片刀和载玻片，应使用RNA去污染溶液（如RNA SAP）处理，并用100%乙醇擦拭。该实验步骤首先将液氮蒸汽冷冻的组织块置于设定为零下17摄氏度的冷冻切片机上进行切片，并将切片转移至普通的未带电荷的玻璃载片上。组织切片现已准备好，可使用Histo Gene快速染色试剂盒鉴定锥体神经元。配制乙醇脱水系列：将适量浓度的乙醇各25毫升以及无RNA酶的水分别加入Histo Gene试剂盒提供的染色缸中。将所有瓶子放入冰桶中，除了一瓶75%乙醇。将这瓶75%乙醇放入-20摄氏度冰箱中。接下来，通过在每100微升染色液中加入1微升RNAs抑制剂来配制染色溶液。由于我们将在两张载玻片上对四个组织切片进行染色，因此在微量离心管中将四微升RNAs抑制剂加入400微升染色液中。将染色液置于冰上，并在通风橱内操作。向二甲苯罐中加入分子筛以去除过量水分，水分可能影响组织漂浮。打开水浴锅并将其温度设定为 42 摄氏度，将一个由支架支撑的 50 毫升 Falcon 管放入水浴锅中。从负 80 摄氏度冰箱中取出两张载玻片，并在 Kim 擦纸上解冻。在−20 °C冰箱中，用75%乙醇对组织进行短暂固定，时间约为30秒，或直至载玻片边缘开始解冻。然后使用无RNA酶的镊子将载玻片转移至无核酸酶的水中，洗涤32秒。洗涤后，用PAP隔离笔围绕组织画圈，以使染色液集中在组织区域。将四份组织切片用组织基因染色液染色20秒，每份切片加入97微升染色液/RNA酶抑制剂。随后，将切片在预冷的冰上乙醇中依次进行脱水，每步30秒。最后一步使用100%乙醇应延长至三分钟，以实现充分脱水，从而获得足够的组织剥离效果。最后，将切片浸入二甲苯中五分钟，待切片完全空气干燥后，再进行激光显微切割。锥体神经元必须在染色后立即进行单细胞激光显微切割。显微切割或LCM需要一个预先准备好的42摄氏度水浴，内含一个由支架支撑的50毫升Falcon管。单细胞激光显微切割（LCM）通过 ARCTURUS XT 激光捕获系统及配套软件完成。开始该操作前，将载玻片和捕获帽装载到 Arcturus XT 仪器上。使用捕获 HS 型捕获帽，但程序设置需保持在宏观（macro）模式。单击加载概览的框，以获取每张切片的概览图像。在2倍放大下调节亮度和焦点，以确定激光捕获的最佳区域。应避免选择折叠过度的组织切片，而应选择完整、平整且染色良好的切片。在需要采集的区域上方放置一个盖片，确保将我们所需采集的区域（本例中为大脑皮层的第三层）包含在内。注意盖片的支架不要压在任何褶皱上，否则会导致盖片倾斜，从而造成点样大小不一。接下来，在 40 倍放大倍数下手动确认红外激光光斑的位置。蓝色十字应位于红外激光光斑的中心。若未对准，请右键单击光斑并选择“定位红外光斑”来调整其位置。在40倍放大倍数下，根据以下标准鉴定锥体神经元：第一，细胞呈锥体形；第二，可识别出顶树突和/或基底树突的近端部分。通过点击位置功能上的加号来保存盖玻片的位置。这样，如果盖玻片被移动，它将始终返回到您已调整好光斑大小的精确位置。将控制框中的参数设置为功率 70，持续时间 16。由于这些参数针对我们的组织类型而设定，建议您在正式开始前，根据具体的组织样本对这些变量进行测试和调整。在使用激光捕获单个细胞时，取消勾选自动移动载物台选项，并确保所选符号的大小与右侧面板上的符号相匹配。在右下角选择圆形选项，以选中您希望测试捕获的神经元。将蓝色十字与圆形对齐后，点击“测试红外光斑”以激活激光。激光产生的光斑应首先在捕获物体周围形成一个清晰的暗环。确保环的大小足以包含整个细胞，但又足够小，以免纳入不需要的组织或其他细胞。如果该环过浅，则说明细胞未被捕获。如果暗环中心出现暗点，则表明激光强度或持续时间过大。在目标层内组织的不同区域重复此过程。为确保捕获位点的大小不因位置不同而有所差异，需相应调整。鉴定锥体神经元并进行捕获，目标数量约为500个细胞。按下激光捕获按钮以捕获细胞。将帽移至质控站。确保至少90%的神经元已被移除。如果未捕获足够细胞，则在先前捕获细胞最多的区域继续捕获更多细胞。将帽放入含有50微升裂解缓冲液的0.5毫升微量离心管中。该帽的设计可完美贴合，防止缓冲液泄漏。将组装件倒置，确保提取缓冲液完全覆盖帽部，并将其置于已预热至42摄氏度的水浴中50毫升Falcon管底部。孵育神经元30分钟，以使组织从帽部脱离。孵育结束后，将管和帽的组装件在800 ×g条件下离心2分钟。离心完成后，移除帽部。如果RNA提取将在稍后进行，请将剩余的细胞提取物于-80摄氏度保存。否则，请按照下一节所示，直接从细胞提取物中提取RNA。RNA提取采用PICO pure提取试剂盒，该试剂盒专为从LCM样品中分离少量细胞并保留低丰度mRNA而设计。开始此实验步骤时，将试剂盒中提供的70%乙醇加入细胞提取物中，然后在预处理的纯化柱上进行离心。为了在洗涤后使RNA结合到柱过滤膜上，需用DNase处理RNA，以消除DNA干扰的风险。此步骤在实时逆转录聚合酶链式反应（real-time R-T-P-C-R）等下游应用中尤为重要。DNA 消化后，加入 40 微升洗涤缓冲液一，将纯化柱在 8,000 G 下离心 15 秒。随后按照试剂盒提供的说明书进行洗涤操作，但将使用洗涤缓冲液二的最后洗涤步骤从 2 分钟延长至 2.5 分钟，以确保柱中无残留洗涤缓冲液，否则可能降低 RNA 产量。将纯化柱转移至另一微量离心管中。加入洗脱缓冲液，静置滤膜及纯化柱上 1 分钟，然后离心以洗脱 RNA。最后，通过运行Experian High Sense实验室芯片来检测提取RNA的质量，该芯片可提供虚拟凝胶和电泳图谱。取1.3微升样品加入0.5毫升离心管中。用于质量控制检测的其余样品应于-80摄氏度冷冻保存。一旦RNA质量得到确认，即可进行扩增、标记和杂交。对于基因表达谱分析，将使用ribo amp HS plus试剂盒进行两轮线性扩增，预计可获得约50微克的扩增RNA，足以用于微阵列和定量逆转录PCR实验。采用分子设备公司（Molecular Devices）的Turbo Biotin标记试剂盒对扩增后的RNA进行标记。最后，将使用Affymetrix公司的人类X3P基因芯片进行基因表达谱分析。组织切片应使每个病例制备出两张载玻片，每张载玻片上含两个切片，共四个切片。每个切片应平滑，撕裂、裂纹或折叠等现象应尽可能少。锥体神经元应呈深染，大小约为20至25微米，具有锥形形态，并可见顶端树突。在激光显微切割（LCM）过程中，激光脉冲穿透热塑性膜后，细胞会粘附到帽盖上，因此不再留在载玻片上的周围组织中。使用宏模式设置的捕获HS帽盖，并正确调节激光功率和强度时，约有85%至100%的神经元应粘附到帽盖上。每个切片可获得约500至700个细胞，每例样本可得到至少500皮克的总RNA。在总RNA提取后，应使用BioRad Experian系统通过电泳图谱和虚拟凝胶来评估RNA质量。在电泳图谱中，使用死后组织时应可见两个明显的峰，分别对应18S和20S核糖体RNA组分。然而，情况并不总是如此，因为在切片前的多种因素可能导致组织降解。通常会看到一个较大的隆起，表明存在降解，在约 18 s 处有一个较大的峰，以及一个较小的 28 s 峰，如红色箭头所示。相比之下，降解程度过高的低质量 RNA 会在电泳图谱曲线下方显示出较大的面积。除了通过检测扩增后片段位置的下移来评估两轮线性扩增后 mRNA 的质量外，我们还同时使用 BioRad Experian 标准 Sense 实验室芯片和 NanoDrop 分光光度计。传统的Atrics微阵列技术要求mRNA转录本的片段长度至少达到600个核苷酸，才能在此方案中被检测到。根据电泳图谱显示，mRNA片段长度已达到1000个核苷酸范围，其特征是随时间推移出现逐渐下降的大峰。该结果也通过虚拟凝胶图像得到证实。如果转录本长度短于600个核苷酸，则不应将该样本纳入分析。对于杂交实验，NanoDrop检测结果显示，各样本的A260/A280比值（即纯度）平均为2.5。平均浓度为1.7微克/微升，每份样本可获得约50微克mRNA，足以用于微阵列分析以及后续验证，后者需要15至20微克mRNA，并通过qRT-PCR对结果进行进一步验证。我们的结果表明，采用本实验方案所获得的RNA在数量和质量上均足以用于 atrix human X three P 芯片进行基因表达差异的研究。在与 Atrics Human X three P 芯片杂交后，我们获得的平均有效信号比例为 26.6%，表明杂交效果良好且探针信号强度足够。我们刚刚向您展示了如何从人类尸检脑组织中通过激光显微切割技术捕获浦肯野神经元，以获取这些细胞中的 RNA。在进行该操作用于微阵列基因表达谱研究时，至关重要的是在无 RNA 酶的环境中完成所有步骤，并及时高效地进行操作，以保持 RNA 的完整性。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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