从胚胎斑马鱼和cDNA合成的基因表达分析的RNA分离
August 7th, 2009
孤立的高品质，完整的RNA是一个必不可少的步骤在许多实验室的协议。在这里，我们从整个斑马鱼的胚胎，随后应用在各种实验程序，包括基因表达芯片分析cDNA合成RNA的提取证明。
为了开始 RNA 分离并获得足够的产量，将 50 个斑马鱼胚胎拉入研钵微熔管中。彻底匀浆后，首先使用三醇、试剂和氯仿提取 RNA。然后使用 Qiagen RNEZ 微型试剂盒对 RNA 进行纯化和纯化，以产生高质量、未降解的总 RNA，用于未来的应用和长期储存。
RNA 被合成成更稳定的 CD NA 产物。纯化 cDNA 以去除原始 RNA 模板链。您好，我叫 Sam Peterson，来自普渡大学健康科学系 Jennifer Freeman 博士的实验室。
今天，我们将向您展示如何从整个斑马鱼胚胎中提取高质量的 RNA 并将其转化为 CDNA 产品。通常，我们使用该程序来研究基因表达谱。那么让我们开始吧。
使用 RNA 时，在没有 RNA 的环境中工作非常重要。使用简单的预防措施，例如保留仅用于 RNA 程序的管道宠物，并在开始提取总 RNA 之前用 RNA 喷洒工作区域 在通风橱中开始提取工作，并将 50 个斑马鱼胚胎拉入 1.5 毫升微量 fuge mort 管中。尽可能多地去除水，并立即加入 250 微升含有苯酚的三醇试剂。
使用颗粒杵躺下并匀浆胚胎约 20 次，直到组织被充分破坏。然后加入 750 μL 三唑试剂，在室温下孵育 5 分钟，以使核蛋白复合物完全解离。5 分钟后，加入 N 0.2 毫升氯仿，通过摇动试管 15 秒混合，在室温下孵育样品 2 分钟，然后在 4 摄氏度下以 12， 000 G 离心 15 分钟。
混合物将分离成下层红色苯酚氯仿相、间相和无色上层水相。顶层大约为 0.6 毫米，它包含 RNA 将整个顶层水层（大约 0.6 毫米）转移到新的微型引信管中。注意不要转移任何间相层，以沉淀 RNA，加入 0.5 毫升异丙醇混合物。
让我们在室温下静置 10 分钟，然后将样品在 12， 000 G 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟。RNA 应形成凝胶状沉淀。在不干扰沉淀的情况下去除上清液，加入 1 毫升 75% 乙醇洗涤，以 7， 500 G 的温和倒置离心机在 4 摄氏度下以 7， 500 G 离心 5 分钟。
离心后，去除乙醇，将试管倒置干燥 10 分钟。加入 100 μL 不含 RNA 的水，并在 55 摄氏度下孵育 10 分钟，以重悬沉淀。手指频繁涡旋以帮助 RNA 再水化。
现在 RNA 已从胚胎中提取，继续进行 RNA 纯化和 D a 处理。要清洁 RNA，请从 Rogen RN easy 迷你试剂盒开始。首次使用时，将 4 体积的 100% 乙醇加入 1 体积的缓冲液 RPE 中，在通风橱中工作。
每 1 mL 缓冲液 RLT 中加入 10 μL β me capto 乙醇。然后通过上下吹打数次向混合的样品中加入 350 微升缓冲液 RLT 和 250 微升 100% 乙醇，并将整个样品转移到 R 和 Easy 色谱柱上，该色谱柱加载到 2 毫升收集管中。离心后，在室温下以 8， 000 G 离心 1 分钟，弃去流出液，向离心柱中加入 700 μL 缓冲液 RW 1。
再次以 8， 000 G 离心 1 分钟，然后弃去流出液以去除样品中的 DA。随后使用不含 RNA 的 DNA 试剂盒进行 DNA 处理。收到试剂盒后，向 DNA 中加入 550 μL 无核酸酶水，倒置轻轻混匀，将分成 10 μL 的储备液等分储存，并在零下 20 摄氏度下冷冻。
将 70 微升缓冲液 RDD 加入 10 微升 DNA 的一种储备液中，通过温和倒置离心机短暂混合，然后直接添加到 R 和易离心柱中 A.在室温下孵育 DNA 的处理 30 分钟。然后将 350 微升缓冲液 RW one 加入离心柱中，在室温下以 8， 000 G 离心 1 分钟，弃去流出液，向离心柱中加入 500 微升缓冲液 RPE。在室温下孵育样品 5 分钟。
在室温下再次以 8， 000 G 离心 1 分钟，弃去流出液，向离心柱中加入 500 μL 75% 乙醇。以 8， 000 G 的离心速度重复离心，但离心后在室温下离心 2 min，弃去流出液，让色谱柱立即干燥 5 min。在室温下以 8， 000 G 离心 5 分钟，以去除任何残留的乙醇示踪剂。
现在将离心柱转移到新的 1.5 mL 收集管中，加入 10 μL 无核酸酶的水，孵育 1 分钟，以 10， 000 G 洗脱 RNA 离心机，放置 1 分钟。在室温下，RNA 将流出。再加入 10 μL 水重复洗脱。
按照制造商的说明作，使用 NanoDrop ND 1000 分光光度计检查 RNA 的数量和质量。此外，运行变性凝胶或使用 Agilent 2100 生物分析仪检查 RNA 的完整性。如果 RNA 质量和数量令人满意，请继续进行 CDNA 合成。
最后，将 RNA 储存在零下 80 摄氏度，直到可以进行 CD NA 合成。通过混合并短暂离心 RNA 引物的每个组分来开始 CD NA 合成。混合 RNA DN NTP 和寡核苷酸 dt。
将每种成分添加到无菌 naut 0.5 毫升微量熔融管中，至总共 10 微升。有关特定卷，请参阅随附的书面协议。然后将样品在 65 摄氏度下孵育 5 分钟。
在样品调用时，立即将样品转移到冰浆中 10 分钟，按照随附的书面方案中概述，制备总共 9 μL 的缓冲液预混液。冷却后，将缓冲液预混液与轻轻混合的 RNA 引物混合物混合，并通过短暂离心收集。接下来，将混合样品放入热循环仪中，在 42 摄氏度下孵育 2 分钟。
要开始逆转录，请在试管中加入 1 微升上标 2 RT 并混合。继续在 42 摄氏度下孵育 1 小时。在 70 摄氏度下终止反应 15 分钟。
然后将样品冷却至 4 摄氏度，并转移到冰浴中。向样品中加入 1 微升 RNA H 并孵育 20 分钟 在 37 摄氏度下，RNA h 降解 RNA 模板，只留下单链 CD NA 产物 cDNA 合成现已完成，只需要额外的纯化和浓缩步骤。要分离 CD NA 产物，以 12， 000 G 离心 2 分钟，制备 1.5 mL 锁相凝胶管。
所有凝胶都应位于试管底部。加入 81.5 微升缓冲至 pH 值 8 点的 tris 饱和苯酚，将 81.5 微升 24 加入 1 个氯仿 Amal 醇中，并将样品加入锁相凝胶管中，通过温和倒置混合数次，将样品以 12， 000 G 离心 5 分钟。在室温下，CDNA 应处于上层水相。
将上层相（应约为 20 μL）转移到干净的 1.5 mL 微量管中。要沉淀 CDNA，请加入 2 微升 pH 值为 5.2 的三摩尔乙酸钠，并轻轻混合。加入 7 微升每毫升 5 毫克的糖原，轻轻混合。
然后加入 30 μL 异丙醇并轻轻混匀，让样品在室温下孵育 10 分钟。然后在室温下以 12， 000 G 离心 20 分钟。离心后，试管底部出现一个小的 CDNA 沉淀。
用 perpet 小心去除上清液。加入 500 μL 70% 乙醇洗涤沉淀，倒置混匀，以 12， 000 G 离心样品 5 分钟。离心后，用 ape 去除 SUP 纳脱剂。
重复洗涤，加入乙醇离心机并去除 SUP natant。第二次洗涤后，短暂地旋转试管以收集任何剩余的液体。去除多余的液体，让沉淀在室温下干燥 5 分钟。
然后加入 20 μL 不含核酸酶的水以使沉淀物再水化。将样品置于 55 摄氏度下 5 分钟。为了再水化，CD NA 可以在零下 20 摄氏度下储存。
最后，按照制造商的说明，使用 Nano Drop ND 1000 分光光度计检查 CD NA 产品的数量和质量，从 50 个斑马鱼胚胎中提取和纯化 RNA 通常产生大约 15 微克高质量总 RNA，使用 NanoDrop ND 1000 分光光度计评估，两个 60 比两个 80 的吸光度比约为 1.9 比 2 点零。使用变性 RNA 凝胶评估提取的 RNA 的完整性。RNA 表现为一条拖带，带有两个亮带，对应于 18 s 和 28 s 核糖体 RNA。
28 s 波段的强度应约为 18 S 波段的两倍。或者，使用 Agilent 2100 生物分析仪评估 RNA 完整性。可以看到对应于 18 s 和 28 s 核糖体 RNA 的两个尖峰。
28 s 峰值应大于 18 s 峰值。使用 NanoDrop ND 1000 评估，5 μg 总 RNA 的逆转录通常会产生 1 至 2 μg 的 CD NA。CDNA 的两个 60 比 2 80 吸光度比约为 1.8。
我们刚刚向您展示了如何从整个斑马鱼胚胎中分离总 RNA，并将该 RNA 转化为 CD NA 产物。执行此过程时，请务必记住维护没有 RN AIS 的环境。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文演示了从整个斑马鱼胚胎中提取高质量RNA的方法，这是许多实验室方案中的关键步骤。该过程包括用于基因表达微阵列分析等应用的cDNA合成。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 分子生物学
背景
- RNA分离对于许多实验程序至关重要。
- 高质量RNA对于准确的基因表达分析必不可少。
- 斑马鱼胚胎是发育研究的模式生物。
- cDNA合成允许稳定的基因表达分析。
研究目的
- 演示一种从斑马鱼胚胎中提取RNA的可靠方法。
- 提供未来应用的cDNA合成方案。
- 通过微阵列技术促进基因表达分析。
使用的方法
- 在研磨棒微融合管中对斑马鱼胚胎进行均质化。
- 使用triol试剂和氯仿提取RNA。
- 使用Qiagen RNEZ minikit纯化RNA。
- 从提取的RNA合成cDNA。
主要结果
- 成功提取了高质量、非降解的总RNA。
- 合成并纯化了cDNA，移除了原始RNA模板。
- 该方法允许RNA的长期存储以供未来实验使用。
- 证明了适用于基因表达微阵列分析。
结论
- 该方案提供了一种从斑马鱼胚胎中提取RNA的可靠方法。
- 高质量RNA和cDNA对于准确的基因表达研究至关重要。
- 该方法可以适用于分子生物学中的各种实验应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-quality RNA isolation and cDNA synthesis from zebrafish embryos enable reliable gene expression profiling, a foundational step in target validation and mechanistic de-risking for early discovery programs. This protocol supports reproducible quantitative outputs that inform lead identification and portfolio prioritization in preclinical research. The method provides a disease-relevant system for assessing transcriptional responses to pharmacological perturbations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitative gene expression analysis in a vertebrate model system.
- Operational Value: Provides standardized RNA extraction and cDNA synthesis workflows with built-in quality control checks to ensure sample integrity.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by generating reproducible transcriptional readouts for pathway clarification and target confidence assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces high-purity cDNA suitable for downstream applications such as RT-PCR and microarray analysis, enabling reliable compound screening.
- Operational Value: Delivers consistent RNA yield and quality metrics (e.g., NanoDrop ratios, gel electrophoresis) that support assay standardization across experiments.
- Scalability: Uses commercially available kits and standardized reagents, facilitating adaptation to higher-throughput workflows in discovery biology.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Generates cDNA from zebrafish embryos, a disease-relevant system, enabling mechanistic studies that bridge discovery and preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative gene expression data that inform go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target pathways.
- Biomarker Alignment: Supports identification of transcriptional biomarkers that can be tracked across developmental stages and treatment conditions.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in zebrafish models before progressing to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification through quantitative gene expression analysis in a vertebrate system.
- Screening: Produces standardized cDNA outputs suitable for reliable compound evaluation in gene expression assays.
- Analytics: Delivers quantifiable RNA and cDNA yields with quality metrics (e.g., 260/280 ratios, ribosomal RNA bands) that allow comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Supports continuity from discovery to preclinical work by providing disease-relevant transcriptional data from zebrafish embryos.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable RNA isolation and cDNA synthesis platform applicable across multiple targets and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing RNA degradation risk and ensuring sample integrity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through QC checkpoints and commercially validated kits.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through reliable gene expression data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative transcriptional data for target comparison.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling and RNase-free technique to prevent sample degradation.
- Depends on access to centrifugation equipment, spectrophotometers (e.g., NanoDrop), and optional bioanalyzers for QC.
- Necessitates standardized workflows across teams to ensure consistent RNA yield and quality metrics.
- Must account for model-specific adaptations when applying the protocol to different developmental stages or zebrafish strains.
- Practical limitation: RNA instability necessitates rapid processing and cold storage to maintain sample integrity for downstream applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Extraction of Total RNA using TRIzol Reagent
0:41
Introduction
7:57
cDNA Synthesis using the Invitrogen SuperScript First-Strand System
3:55
RNA Cleanup using the Qiagen RNEasy Mini Kit
10:28
cDNA Isolation and Precipitation
14:57
Conclusion
13:50
Representative Results/Outcome
