Name: 从胚胎斑马鱼和cDNA合成的基因表达分析的RNA分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-07T16:40:00.000+00:00
Duration: 15 min 21 s
Description: 学习从斑马鱼胚胎中提取高质量RNA并进行cDNA合成的方法，用于基因表达微阵列分析。该方案包括组织匀浆、RNA纯化和反转录步骤，为发育生物学研究提供可靠的分子生物学技术支持。

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第1部分：使用TRIzol试剂提取总RNA
处理RNA时，必须在无RNase的环境中操作。采取一些简单的预防措施非常有帮助，例如专用于RNA实验的移液器，以及在开始实验前用去污染试剂（如RNAse Away）喷洒工作区域。
<ol>
<li>将50个斑马鱼胚胎放入1.5 ml离心管中，以获得足够量的RNA，并用移液器尽可能吸除多余水分。</li>
<li>立即向含有胚胎的离心管中加入250 μl TRIzol试剂1。TRIzol试剂含有苯酚，仅可在通风橱中使用。</li>
<li>使用研磨杵（约20次上下研磨）裂解并匀浆胚胎，直至组织充分破碎。</li>
<li>当细胞充分匀浆后，加入750 μl TRIzol试剂，使总体积达到1 ml。</li>
<li>为使核蛋白复合物完全解离，将匀浆样品在室温下孵育5分钟。此时样品可用液氮速冻并保存于-80°C，或继续后续操作。</li>
<li>继续操作时，加入0.2 ml氯仿，轻轻摇动离心管15秒以充分混匀。</li>
<li>在室温下孵育2分钟后，于4°C以12,000 x g离心15分钟。</li>
<li>混合物将分为下层红色酚-氯仿相、中间相和上层无色水相。RNA位于上层水相中。上层体积应约为初始TRIzol体积的60%（约0.6 ml）。使用1 ml移液器小心吸取上层水相转移至新的离心管中，注意避免吸取中间相。</li>
<li>为沉淀RNA，加入0.5 ml异丙醇。</li>
<li>室温静置10分钟后，于4°C以12,000 x g离心10分钟。RNA将在管底形成凝胶状沉淀。</li>
<li>小心吸除上清液（勿扰动沉淀），用1 ml 75%乙醇洗涤沉淀。通过轻柔颠倒混匀样品，然后于4°C以7,500 x g离心5分钟。</li>
<li>离心后，用移液器吸除乙醇，将样品倒置静置10分钟使其干燥。</li>
<li>加入100 μl无RNase水重悬沉淀，并于55°C孵育10分钟。建议在孵育过程中频繁用手轻弹混匀，以促进RNA溶解。可选步骤：可使用NanoDrop ND-1000分光光度计检测样品的纯度与浓度，或直接进入下一步操作。</li>
</ol>
第2部分：使用Qiagen RNEasy Mini试剂盒进行RNA纯化
Qiagen RNEasy Mini Kit2 可有效去除通过其他方法分离得到的 RNA 样品中的污染物和杂质。本实验步骤除试剂盒所含组分外，还需使用 β-巯基乙醇、乙醇和无核酸酶水。建议在本实验过程中进行可选的 DNase 处理。
<ol>
<li>首次使用试剂盒时，需通过向1体积的Buffer RPE中加入4体积的100%乙醇来配制Buffer RPE。</li>
<li>在实验当天，需新鲜配制Buffer RLT。计算所需Buffer RLT的总体积，每份样品需要350 μl。每1 ml Buffer RLT中加入10 μl β-巯基乙醇进行配制。此操作应在通风橱中进行。</li>
<li>向每份样品中加入350 μl Buffer RLT和250 μl 100%乙醇，通过反复吹吸数次充分混匀。</li>
<li>将总体积约为700 μl的样品转移至置于2 ml收集管中的RNEasy柱中，在室温下以8,000 × g离心1分钟。</li>
<li>离心后弃去穿流液，并向RNEasy离心柱中加入700 μl Buffer RW1。</li>
<li>在室温下以8,000 × g离心1分钟，随后弃去穿流液。</li>
<li>使用Qiagen无RNase DNA酶试剂盒进行DNA酶处理：DNA酶处理为可选步骤，但为获得最高质量的样品，强烈推荐执行此步骤。
<ol style="list-style-type:upper-alpha;">
<li>首次收到DNA酶处理试剂盒时，需通过向DNA酶中加入550 μl无核酸酶水来配制DNA酶I储存液。轻轻颠倒混匀，切勿涡旋。将储存液分装至单次使用的小管中，每管含10 μl。储存液可在-20°C保存长达9个月。如需，解冻后的分装液可在4°C保存6周，但解冻后不可再次冷冻。</li>
<li>每份样品中，将70 μl Buffer RDD与10 μl DNA酶I储存液混合，配制DNA酶I孵育混合液。通过轻柔颠倒混匀，并短暂离心以收集管壁残留液体。将80 μl DNA酶I孵育混合液直接加入RNEasy离心柱中，在室温下孵育30分钟。</li>
</ol></li>
<li>DNA酶处理完成后，向离心柱中加入350 μl Buffer RW1，并在室温下以8,000 × g离心1分钟。</li>
<li>离心后弃去穿流液，并向离心柱中加入500 μl Buffer RPE。在室温下孵育样品5分钟。</li>
<li>在室温下以8,000 × g离心1分钟，随后弃去穿流液。</li>
<li>离心后向离心柱中加入500 μl 75%乙醇。</li>
<li>重复离心步骤，在室温下以8,000 × g离心2分钟。</li>
<li>离心后弃去穿流液，并将离心柱在室温下干燥5分钟。</li>
<li>立即在室温下以8,000 × g离心5分钟，以去除残留的微量乙醇。</li>
<li>离心完成后，将离心柱转移至新的1.5 ml收集管中，加入10 μl无核酸酶水。孵育1分钟后，在室温下以10,000 × g离心1分钟。RNA将存在于穿流液中。</li>
<li>向离心柱中再加入10 μl无核酸酶水，在室温下孵育1分钟，然后在室温下以10,000 × g离心1分钟。</li>
<li>离心后移除并弃去离心柱。RNA将存在于穿流液中。</li>
<li>按照制造商说明书，使用NanoDrop ND-1000分光光度计检测RNA的浓度和质量。</li>
<li>此外，可通过变性凝胶电泳或使用Agilent 2100生物分析仪检测RNA的完整性。</li>
<li>样品应保存在-80°C，直至进行cDNA合成。</li>
</ol>
第3部分：使用Invitrogen SuperScript第一链合成系统进行cDNA合成
RNA 容易被 RNase 切割而发生降解。因此，许多基因表达实验方案都采用由 RNA 直接合成的更稳定的 cDNA 产物。本文详细介绍了使用 Invitrogen SuperScript First-Strand Synthesis System3 合成第一链 cDNA 的方法。每个 cDNA 合成反应最多可容纳 5 μg 的 RNA。
<ol>
<li>开始实验前，将各组分混合并短暂离心。</li>
<li>按照表1所述，在无菌的0.5 ml微量离心管中配制RNA/引物混合物。</li>
<li>将样品在65°C孵育5分钟。</li>
<li>立即转移样品至冰浴中，持续10分钟。</li>
<li>在样品冷却期间，根据表2列出的组分配制预混液。所列体积为每1个反应的用量，请根据反应总数相应调整体积。</li>
<li>冷却后，向每个RNA/引物混合物中加入9 μl步骤5中配制的预混液。轻轻混匀，并通过短暂离心收集液体。每个样品的总体积应为19 μl。</li>
<li>将样品在热循环仪中于42°C孵育2分钟。</li>
<li>向每管中加入1 μl（50单位）SuperScript II RT，混匀后在热循环仪中于42°C孵育60分钟。</li>
<li>在70°C终止反应15分钟，然后将样品冷却至4°C。热循环仪可对步骤8和9进行程序化设置。</li>
<li>待样品温度降至4°C后，将其转移至冰浴中。</li>
<li>在冰上向每管中加入1 μl RNAse H，在37°C孵育20分钟。此时总体积为21 μl。加入RNAse H可降解样品中的RNA模板，仅保留单链cDNA产物。</li>
</ol>
第4部分：cDNA的分离与沉淀
<ol>
<li>在cDNA产物的分离过程中将使用1.5 ml相锁凝胶管。通过在12,000 × g下离心2分钟来准备1.5 ml相锁凝胶管，确保凝胶完全沉降至管底。</li>
<li>向相锁凝胶管中加入81.5 μl苯酚（Tris饱和，pH 8.0缓冲）、81.5 μl 24:1氯仿-异戊醇以及样品（21 μl）。轻轻颠倒数次以充分混匀。</li>
<li>在室温下以12,000 × g离心样品5分钟。</li>
<li>cDNA应位于上层水相中。将上层水相转移至一支洁净的1.5 ml微量离心管中，总体积约为20 μl。</li>
<li>加入1倍体积的3 M NaOAc（pH 5.2），并轻轻混匀。例如，若上层水相体积为20 μl，则需加入20 μl的3 M NaOAc（pH 5.2）。</li>
<li>加入7 μl浓度为5 mg/ml的糖原，并轻轻混匀。</li>
<li>加入1倍体积的异丙醇，并轻轻混匀。通常异丙醇的体积约为30 μl。</li>
<li>将样品在室温下孵育10分钟，随后在室温下以12,000 × g离心20分钟。</li>
<li>管底应形成少量cDNA沉淀。小心使用移液器吸除上清液。</li>
<li>加入500 μl 70%乙醇，通过颠倒混匀。</li>
<li>以12,000 × g离心样品5分钟。</li>
<li>离心后用移液器吸除上清液，并重复70%乙醇洗涤及离心步骤（步骤10和11）。</li>
<li>离心后用移液器吸除上清液。若管壁仍有残留液体，可通过短暂离心收集。彻底去除多余液体后，将沉淀在室温下干燥5分钟。</li>
<li>加入20 μl无核酸酶水以重悬沉淀。将样品置于55°C下5分钟，以促进沉淀充分溶解。</li>
<li>使用NanoDrop ND-1000分光光度计按照制造商说明书检测cDNA产物的浓度和质量。cDNA可于-20°C保存。</li>
</ol>
代表性结果
RNA纯化后，从50个斑马鱼胚胎中通常可获得约15 μg高质量的总RNA。为评估总RNA质量，可使用分光光度计、凝胶电泳以及Agilent 2100生物分析仪。可使用NanoDrop ND-1000分光光度计测定260 nm处的吸光度与280 nm处吸光度的比值（图1）。A260/A280比值可反映是否存在污染物，并提示可能发生的降解。A260/A280比值在1.9–2.0之间视为可接受。此外，强烈建议通过RNA变性凝胶电泳来评估RNA完整性。RNA链将根据其大小分离，较小的RNA链在凝胶中迁移得更远。未降解的样品在凝胶上呈现为弥散条带，并伴有两条明显的条带。弥散条带由不同长度的mRNA群体形成，而两条明显条带分别对应28S和18S rRNA。28S条带的强度应约为18S条带的两倍（图2）。或者，也可使用Agilent 2100生物分析仪评估总RNA完整性。预期可见两个代表28S和18S rRNA的明显峰形。28S峰应大于18S峰，且两峰下的面积之比约为2:1。在已降解的样品中将无法观察到两个明显的峰。出现降解迹象的RNA样品不应继续用于后续实验操作。
分光光度法分析可用于评估cDNA产物的质量（图4）。A260/A280比值应约为1.8。在本实验室，以5 μg总RNA为起始量进行cDNA反应，通常可获得1–2 μg的cDNA产物。
<img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="核酸紫外吸收光谱图，DNA浓度分析，分光光度法结果。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1. RNA样品的NanoDrop光谱图。 RNA纯化后，可使用NanoDrop ND-1000分光光度计测定RNA的浓度和质量。通常从50个斑马鱼胚胎中可获得约15 μg高质量的总RNA，其A260/A280比值约为1.9–2.0。
<img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="RNA琼脂糖凝胶电泳；18S/28S条带；RNA纯度分析，分子量标记。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 图2. RNA变性凝胶电泳图。 为评估总RNA提取的完整性，可进行RNA变性凝胶电泳。预期结果为一条带有两条明亮条带的弥散信号，分别对应于28S和18S rRNA。其中28S条带的强度应约为18S条带的两倍。
<img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="显示RNA峰（18S和28S）的荧光图，用于核酸定量分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 图3. 生物分析仪检测的RNA样品图谱。 为评估总RNA提取的完整性，可使用Agilent 2100生物分析仪对样品进行分析。应可见两个清晰的峰，分别对应28S和18S rRNA。28S峰应大于18S峰，其峰下面积之比约为2:1。
<img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="核酸吸收图谱，紫外-可见光谱数据，显示在260 nm处有吸收峰。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 图4. cDNA样品的NanoDrop光谱。 使用NanoDrop ND-1000进行分光光度分析，可用于评估cDNA产物的浓度和质量。A260/A280比值应约为1.8。在本实验室，以5 µg总RNA为起始量的cDNA反应通常可获得1–2 µg的cDNA。
表1. cDNA合成步骤2中需加入的RNA/引物混合物组分。
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>体积</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总RNA（最多5 μg）</td>
 <td>10 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 mM dNTP混合物</td>
 <td>1 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oligo(dT)12-18（0.5 μg/μl）</td>
 <td>1 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC处理水</td>
 <td>n μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总体积</td>
 <td>10 μl</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表2. cDNA合成第5步的反应体系。所列体积为单次反应所需量。根据反应总数按比例增加各组分的体积。
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td>体积</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X RT Buffer</td>
 <td>2 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 mM MgCl2</td>
 <td>4 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.1 mM DTT</td>
 <td>2 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAseOUT</td>
 <td>1 μl</td>
 </tr>
</tbody>
</table>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22TRIzol+Reagent+Manual%22">TRIzol Reagent Manual</a>. , (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNEasy+Mini+Handbook%22">RNEasy Mini Handbook</a>. , 4th ed, (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+First-Strand+Synthesis+System+for+RT-PCR%22">SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR</a>. , Version E. (2003).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在整个实验方案中，最需要牢记的是RNA分子的不稳定性。应始终在无RNA酶的实验室区域使用无菌且无RNA酶的实验器材。建议将实验室的某一区域专门用于RNA相关操作，并定期使用去除RNA酶的产品（如RNAse Away）进行喷洒处理。操作RNA样品时必须佩戴手套，并将其置于冰上保存，以防止降解。
本实验方案采用了市售的试剂和试剂盒。此外，市场上还有多种其他试剂和用于总RNA提取的RNA提取试剂盒可供选择。本方案中包含的试剂和试剂盒在本实验室中表现良好， routinely 获得高质量的RNA。
作为替代方案，可进行双链 cDNA 的合成，而非本方案中演示的单链 cDNA 合成。有时需要双链 cDNA，因其具有更高的稳定性。此外，某些实验方案要求以双链 cDNA 产物作为起始材料。然而，如果样品将在本实验室用于后续实验，则单链 cDNA 合成已足够，且成本更低。

<table><tbody><tr><td>糖原（5 mg/ml）</td><td>Ambion</td><td>9510</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>微型离心管用研磨杵</td><td>VWR international</td><td>KT749520-0090</td><td></td></tr><tr><td>相锁凝胶轻型，1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>2302800</td><td></td></tr><tr><td>Tris饱和酚</td><td>Roche Group</td><td>3117944001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>VWR international</td><td>17810-491</td><td></td></tr><tr><td>无RNA酶DNase试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNEasy Mini试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&amp;#174; RT-PCR用第一链cDNA合成系统</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr></tbody></table>

从斑马鱼胚胎中提取rna及用于基因表达分析的cdna合成

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

许多重要且复杂的实验操作需要高质量、完整的RNA作为起始材料。RNA样品的降解或杂质的存在可能导致下游实验应用出现严重问题。因此，采用具有多重保障措施和质量控制步骤的可靠技术，以获得优质样品，显得至关重要。本文详细介绍了一种利用市售化学变性剂从整只斑马鱼胚胎中提取总RNA的方案，并结合商业化RNA提取试剂盒进行后续纯化，以去除残留的DNA和杂质。由于RNA相对不稳定，且极易被RNase降解，大多数实验通常通过将RNA逆转录为更稳定的cDNA来检测基因表达，cDNA是以RNA为模板直接合成的。本文同时详述了利用市售试剂盒将RNA转化为cDNA的操作流程。在整个实验过程中设置了多项质量控制环节，以确保样品未发生降解或污染。本套方案最终获得的cDNA适用于微阵列分析、RT-PCR或长期保存。

关键词：RNA提取，斑马鱼胚胎，总RNA，cDNA合成，RNA纯化，质量控制，RT-PCR，微阵列分析

高质量完整RNA的分离是许多实验室实验方案中的关键步骤。在此，我们展示了从完整的斑马鱼胚胎中提取RNA并合成cDNA，以用于后续多种实验操作，包括基因表达微阵列分析。

从斑马鱼胚胎中提取RNA及用于基因表达分析的cDNA合成

许多重要且复杂的实验室操作需要高质量、完整的RNA作为输入。RNA样品的降解或杂质的存在可能导致……

为了启动RNA提取并获得足够的产量，将50个斑马鱼胚胎转移至微型研磨管中。首先在充分匀浆后，使用三氯试剂（triol reagent）和氯仿提取RNA。随后，利用Qiagen RNEZ小型试剂盒对RNA进行清洗和纯化，以获得高质量且未降解的总RNA，可用于后续实验及长期保存。RNA被合成为更稳定的cDNA产物。cDNA经过纯化以去除原始的RNA模板链。大家好，我是来自普渡大学健康科学系Jennifer Freeman博士实验室的Sam Peterson。今天我们将向您展示如何从完整的斑马鱼胚胎中提取高质量的RNA，并将其转化为cDNA产物。通常，我们使用该实验流程来研究基因表达谱。现在让我们开始吧。在处理 RNA 时，必须在无 RNase 的环境中操作。应采取一些简单的预防措施，例如专设移液器用于 RNA 实验操作，并在开始总 RNA 提取前用 RNase 去除剂喷洒工作区域。在通风橱内开始提取操作，将 50 个斑马鱼胚胎转移至 1.5 毫升微量离心管中。尽可能去除上清液体，并立即加入 250 微升含苯酚的 TRIol 试剂。使用研钵和杵对胚胎进行研磨和匀浆，约20次，直至组织充分破碎。然后加入750 µL三唑试剂，在室温下孵育5分钟，以使核蛋白复合物完全解离。5分钟后，加入0.2 mL氯仿，通过轻轻摇动离心管15秒使其混合，室温孵育2分钟，随后在4°C下以12,000 ×g离心15分钟。混合物将分为下层红色酚-氯仿相、中间相和上层无色水相。上层液体厚度约为0.6毫米，其中含有RNA，将整个上层水相（约0.6毫米）转移至新的微量离心管中，注意勿转移中间相。随后加入0.5毫升异丙醇以沉淀RNA，并混匀。室温静置10分钟，然后在4°C条件下以12,000 G离心10分钟。RNA应形成凝胶状沉淀。小心去除上清液，避免扰动沉淀，加入1毫升75%乙醇，轻轻颠倒混匀，于4°C以7,500 G离心5分钟进行洗涤。离心后，去除乙醇，将管子倒置干燥10分钟。加入100 µL无RNA酶的水重悬沉淀，并在55°C孵育10分钟。频繁用手指涡旋振荡，以促进RNA的水合。现在，RNA 已从胚胎中提取出来，接下来进行 RNA 纯化和 DNase 处理。为了纯化 RNA，首先使用 Rogen RN easy mini 试剂盒。首次使用时，在通风橱中向一份体积的 RPE 缓冲液中加入四份体积的 100% 乙醇。每1毫升RLT缓冲液中加入10微升β-巯基乙醇。然后向样品中加入350微升RLT缓冲液和250微升100%乙醇，用移液器上下吹打数次混匀，将整个样品转移至已装入2毫升收集管的RNeasy离心柱中。室温下以8,000 × g离心1分钟，离心后弃去穿流液，向离心柱中加入700微升RW1缓冲液。再次以 8,000 G 离心一分钟，并弃去流穿液，以从样品中去除 DA。随后使用无 RNA 酶的 DNA 试剂盒对 DNA 进行处理。收到试剂盒后，向 DNA 中加入 550 微升无核酸酶水，轻轻颠倒混匀，将储存液分装为每份 10 微升，于 -20 摄氏度冷冻保存。向10微升DNA的原液中加入70微升RDD缓冲液，轻轻倒置混匀，短暂离心后直接加入R和easy spin柱A中。室温孵育DNA处理物30分钟。然后向离心柱中加入350微升RW1缓冲液，于8,000 G室温离心1分钟，弃去穿流液，再向离心柱中加入500微升RPE缓冲液。室温孵育样品5分钟。再次在室温下以 8,000 G 离心一分钟，弃去流出液，并向离心柱中加入 500 微升 75% 乙醇。在室温下以 8,000 G 重复离心，持续两分钟，离心后弃去流出液，并立即让离心柱干燥五分钟。在室温下以 8,000 G 离心五分钟，以去除任何残留的乙醇痕迹。现在将吸附柱转移至一个新的1.5毫升收集管中，加入10 µL无核酸酶的水，孵育1分钟以洗脱RNA，然后在室温下以10,000 ×g离心1分钟。RNA将存在于流出液中。再用10 µL水重复洗脱一次。按照制造商的说明，使用 NanoDrop ND 1000 分光光度计检测 RNA 的浓度和质量。此外，通过变性琼脂糖凝胶电泳或使用 Agilent 2100 生物分析仪检测 RNA 的完整性。若 RNA 的质量和数量均符合要求，则进入 cDNA 合成步骤。最后，将RNA保存在负80摄氏度，直至可进行cDNA合成。开始cDNA合成时，混合RNA引物的各组分并短暂离心。混合RNA、dNTPs和oligo(dT)。将每种组分加入无菌的 0.5 毫升微量离心管中，总体积为 10 微升。具体体积请参见随附的书面实验方案。然后将样品在 65 摄氏度孵育 5 分钟。立即将样品转移至冰水浴中静置10分钟；在此期间，按照随附的书面实验方案配制总体积为九微升的缓冲液主混合液。冷却后，将缓冲液主混合液与RNA引物混合液轻轻混合，并短暂离心收集。随后，将混合后的样品置于42摄氏度的热循环仪中孵育2分钟。开始逆转录反应时，向离心管中加入一微升 Superscript Two RT 并混匀。在 42 摄氏度下继续孵育一小时。在 70 摄氏度下终止反应 15 分钟。然后将样品冷却至4摄氏度，并转移至冰上的冰浴中。向样品中加入1 µL RNase H，于37摄氏度孵育20分钟。RNase H会降解RNA模板，仅留下单链cDNA产物，cDNA合成至此完成，仅需进行额外的纯化和浓缩步骤。为分离cDNA产物，通过在12,000 ×g离心2分钟，准备一个1.5 mL相位锁定凝胶管。所有凝胶均应位于离心管底部。向相分离胶管中加入81.5 µL经Tris饱和、pH 8.0缓冲的酚，81.5 µL 24:1氯仿-异戊醇，以及待测样品，轻轻翻转混匀数次，于室温下以12,000 ×g离心5分钟。cDNA应位于上层水相中。将上层相（约20微升）转移至一个洁净的1.5毫升离心管中。为沉淀cDNA，加入2微升pH 5.2的3摩尔醋酸钠，轻轻混匀。再加入7微升浓度为5毫克/毫升的糖原，轻轻混匀。然后加入30 µL异丙醇，轻轻混匀，将样品在室温下孵育10分钟。接着在室温下以12,000 ×g离心20分钟。离心后，试管底部会出现少量cDNA沉淀。用移液器小心吸去上清液。加入 500 µL 70% 乙醇洗涤沉淀，通过倒置混匀后，在 12,000 ×g 条件下离心 5 分钟。离心后，用移液器吸去上清液。重复洗涤步骤，加入乙醇后离心并弃去上清液。第二次洗涤后，短暂离心以收集管壁残留的液体。吸除多余的液体，并将沉淀在室温下干燥5分钟。然后加入 20 µL 无核酸酶水以重悬沉淀。将样品置于 55 °C 下 5 分钟。重悬时，CD NA 可在 -20 °C 下保存。最后，使用 NanoDrop ND-1000 分光光度计按照制造商说明书检测 CD NA 产物的数量和质量。从 50 个斑马鱼胚胎中常规提取并纯化 RNA，通常可获得约 15 µg 高质量的总 RNA，通过 NanoDrop ND-1000 分光光度计测定，其 A260/A280 吸光度比值约为 1.9 至 2.0。提取 RNA 的完整性通过变性 RNA 琼脂糖凝胶电泳进行评估。RNA 呈现为弥散条带，其中两条明亮条带分别对应于 18S 和 28S 核糖体 RNA。28 S 条带的强度应约为 18 S 条带的两倍。或者，可使用安捷伦 2100 生物分析仪评估 RNA 完整性。可见对应于 18 S 和 28 S 核糖体 RNA 的两个清晰峰。28S 峰应大于 18S 峰。使用 NanoDrop ND-1000 测定，五微克总 RNA 的反转录通常可产生一至两微克的 cDNA。cDNA 的 260/280 吸光度比值约为 1.8。我们刚刚向您展示了如何从完整的斑马鱼胚胎中分离总RNA，并将该RNA转化为CD NA产物。进行此操作时，重要的是要记住保持无RN ase的环境。就这些。感谢观看，祝您的实验顺利。

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