Name: 病毒融合动力学测量方法在单粒子能级 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: 学习双色荧光测定法在单粒子能级上可视化病毒融合动力学。该方法利用荧光显微镜实时监测半融合和孔形成过程，为病毒进入机制和抗病毒策略研究提供高分辨率工具。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为AI57159（授予S.C.H.）和AI72346（授予A.M.v.O.）。S.C.H. 是霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute）的研究员。

盖玻片功能化
融合实验中使用的平面双层膜由一层水合葡聚糖薄膜支撑。葡聚糖在平面双层膜与玻璃表面之间起到间隔作用，防止膜组分粘附在玻璃表面，同时也为病毒颗粒融合后内容物的释放提供空间。通过环氧硅烷处理对玻璃盖玻片进行功能化修饰，可将葡聚糖化学键合至玻璃表面（Elender，et al. 1996）。
<ol>
<li>将25 mm盖玻片排列在陶瓷染色架中，并将该架放入广口瓶或烧杯内。</li>
<li>向容器中加入10%的实验室级玻璃器皿清洗剂溶液，将容器置于超声波清洗仪中清洗30分钟。</li>
<li>用去离子水冲洗容器及盖玻片架，然后重新注入1 M氢氧化钾溶液。再次将容器放入超声波清洗仪中处理30分钟。</li>
<li>依次使用丙酮和乙醇重复上述清洗步骤。</li>
<li>用清水冲洗盖玻片并干燥。</li>
<li>最后，使用氧气等离子体清洗仪对盖玻片处理3分钟。</li>
<li>该最终清洗步骤可使表面氧化，从而使玻璃在后续的硅烷化步骤中具有均匀的亲水性和反应活性。</li>
<li>配制0.2%的3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷异丙醇溶液，将盖玻片浸入该溶液中5分钟。</li>
<li>弃去硅烷溶液，并用异丙醇多次冲洗盖玻片。</li>
<li>此时盖玻片表面已形成一层硅烷涂层，但需进行固化处理，以使硅烷与玻璃表面形成共价键。将盖玻片置于80°C的烘箱中加热1小时。</li>
<li>在盖玻片固化的同时，称取葡聚糖500，配制30%（w/v）的溶液。预热去离子水有助于溶解。每片盖玻片约使用1 ml该溶液。葡聚糖完全溶解后，将其置于真空干燥器中脱泡。</li>
<li>硅烷化处理后的盖玻片完成固化后，将其从陶瓷架上取下，并平铺于塑料冷冻盒内表面。使用1 ml移液器将约1 ml葡聚糖溶液均匀覆盖于每片盖玻片表面。盖上冷冻盒，静置24–36小时。</li>
<li>用塑料镊子夹持盖玻片，倒去多余的葡聚糖溶液，并将其放回陶瓷架中。用清水多次冲洗盖玻片，然后将其浸泡于水中48小时。可将容器置于旋转摇床上轻轻振荡。</li>
<li>将盖玻片在80°C烘箱中干燥，并保存于真空干燥器中。</li>
</ol>
脂质体的制备
通过将脂质体吸附到葡聚糖功能化的盖玻片上形成支撑脂双层。吸附的脂质体相互融合，直至膜破裂并在表面铺展成平面。
<ol>
<li>本实验所用的典型脂质体配方包含1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）、1-油酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）、胆固醇、牛脑二唾液酸神经节苷脂（GD1a）以及N-((6-(生物素基)氨基)己酰基)-1,2-二十六烷酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺，各组分比例为4:4:2:0.1:5×10-5。所有组分均保存于氯仿或氯仿与甲醇的混合溶液中。</li>
<li>取各组分适量，加入玻璃试管中，配制成总脂量为两微摩尔的混合液。在氩气或氮气流下蒸发溶剂，随后将试管置于真空干燥器中两小时，以彻底去除残留溶剂。</li>
<li>用400微升HNE缓冲液（5 mM HEPES、145 mM NaCl、0.1 mM EDTA）重悬干燥的脂膜。</li>
<li>将悬浮液转移至塑料微量离心管中，先在液氮浴中冷冻，再于温水浴中解冻。重复此冻融循环四次。</li>
<li>将带有100 nm聚碳酸酯膜滤器的脂质体挤出器装配好，将脂质悬浮液挤出25次。挤出后，悬浮液应变得更为透明。</li>
<li>脂质体应在制备当日使用，可于室温下保存至使用前。</li>
</ol>
微流控流动池制备
通过将双面胶带夹在石英载玻片和功能化盖玻片之间，即可制成一种简单的微流控流动池。
<ol>
<li>取一块 20×20×3 mm 的石英载片，使用金刚石钻头在相对的两侧各钻一个直径为 1 mm 的孔。</li>
<li>从双面胶带上裁剪出一个 20 mm 见方的正方形，然后用剃刀刀片在其中心切出一个 15×2 mm 的矩形区域。</li>
<li>撕去胶带一侧的背衬，将胶带粘附到石英载片上，再将另一侧粘附到经过功能化的盖玻片上。</li>
<li>截取两段长度为 20 cm 的聚乙烯管，并将其插入石英载片上的孔中。</li>
<li>使用 5 分钟环氧树脂胶密封流动池。</li>
<li>待胶水固化后，用缓冲液对流动池和管道进行预润洗。</li>
<li>此时可通过将约 80 微升的脂质体悬浮液吸入通道内，在此阶段形成支撑脂双层膜。</li>
</ol>
病毒颗粒标记
<ol>
<li>通常使用H3N2甲型流感病毒（X-31）进行融合实验，但其他流感毒株及其他病毒也已成功应用。</li>
<li>病毒可标记最多两种不同的荧光染料，以检测半融合和孔形成过程。</li>
<li>将磺酰罗丹明B（SRB）溶解于HNE缓冲液中，配制成20 mM的溶液。取20微升染料溶液与10微升病毒悬液混合，在室温下孵育20小时。在此期间，染料将缓慢积累进入病毒颗粒内部。</li>
<li>通过PD-10脱盐柱去除多余的染料。若使用足量的病毒材料，可在柱中观察到有色条带。该条带含有标记的病毒，可在洗脱时收集。</li>
<li>若无可见条带，则收集200微升的洗脱组分，并通过分光光度计在565 nm处测定吸光度，以确定含有标记病毒的组分。病毒总洗脱体积约为0.8 ml。</li>
<li>向已标记SRB的病毒悬液中加入13微升浓度为2 mM的二甲基亚砜（DMF）溶液的十八烷基罗丹明110（Rh110C18），以标记病毒包膜。</li>
<li>将试管固定在实验室旋转仪上搅拌悬液，孵育3小时。</li>
<li>使用PD-10脱盐柱按照前述方法去除过量的Rh110C18，纯化病毒。</li>
</ol>
显微镜配置
实验在配备高数值孔径油浸物镜的荧光显微镜上进行，该物镜适用于全内反射荧光显微镜。使用氩/氪气体激光器的488 nm和568 nm谱线分别激发Rh110C18和SRB标记的病毒。通过二向色镜将绿色和红色荧光发射光分离，并将两束图像独立聚焦到电子倍增CCD相机的两个不同半区，从而实现对每种标记的同步成像。
进行检测
融合实验的执行涉及在流动池内逐步组装生化组分：平面脂双层的组装、标记病毒颗粒的停靠、表面包被荧光素，以及用低pH缓冲液启动反应（图1A）。
<ol>
<li>将流动池安装到显微镜载物台上，并将出口管路连接至设定流速为每分钟 40 微升的注射泵。</li>
<li>通过注入 300 微升 HNE 缓冲液，清除流动通道中多余的脂质体。</li>
<li>调节显微镜焦距，并调整激光功率，使样品表面受到 350 W/cm2 的 488 nm 光照和 70 W/cm2 的 568 nm 光照。若使用 1.45 数值孔径的 60 倍油浸物镜，请将激光强度分别设为 100 微瓦和 20 微瓦。</li>
<li>将标记病毒（稀释 1/100）泵入流动池。随着病毒扩散至流动通道底部表面，病毒颗粒将开始黏附于脂双层中掺入的神经节苷脂上。</li>
<li>当病毒颗粒的附着密度达到合适水平（每视野最多约 1000 个颗粒）时，切换进样管路至含有每毫升 2 微克荧光素标记链霉亲和素的溶液。标记的链霉亲和素将结合脂双层中与生物素偶联的脂分子，最终可观察到微弱的绿色背景荧光。</li>
<li>用 300 微升 HNE 缓冲液冲洗流动通道。</li>
<li>选择成像区域，调节显微镜焦距，并准备 CCD 相机进行时间序列图像采集。将曝光时间设为 100 毫秒，以每秒 10 帧的速率采集图像。</li>
<li>通过注入含 10 mM 柠檬酸钠和 140 mM NaCl 的酸性缓冲液启动融合反应。缓冲液的 pH 应调节至低于待测病毒的临界 pH 值。X-31 病毒在 pH 低于 5.5 时发生融合。</li>
</ol>
代表性结果
图1B展示了双层膜锚定病毒颗粒在融合前和融合过程中的快照。每个衍射极限光斑代表一个单独的病毒颗粒。红色和绿色荧光分别成像到CCD相机的上半部和下半部，从而可以同时观察病毒包膜和内容物标记。通常情况下，绿色通道中的光斑数量约为红色通道的两倍，这反映了内容物染料的标记效率低于包膜标记物。表面结合的荧光素所产生的绿色背景荧光在柠檬酸盐缓冲液到达时消失，由此可确定融合反应的起始时间。半融合事件表现为绿色荧光的突然增强，这是因为病毒包膜中原本被淬灭的Rh110C18通过半融合颈扩散，并在平面膜中被稀释。在发生半融合的颗粒周围可见向外扩展的荧光云状结构，表明脂肪酰基连接的染料在平面膜中自由扩散。融合孔的形成则表现为被包裹在病毒颗粒内部的SRB红色荧光逐渐减弱。融合孔的打开使染料得以释放到平面双层膜下方的水相空间，并离开观察区域。
通过单个颗粒的积分荧光强度绘制出的每个颗粒的荧光强度轨迹，有助于确定半融合和孔形成的发生比例及时间（图1C）。半融合和孔形成事件的时间点被确定为Rh110C18荧光爆发或SRB信号衰减的最大斜率出现的时刻。在成功的实验中，约50%标记有Rh110C18的颗粒产生去猝灭信号，30%标记有SRB的颗粒可提供可用信号。在同时标记两种染料的颗粒中，约10%同时显示出脂质混合和孔形成信号。
图2A-C展示了典型实验中半融合和孔形成滞后时间的分布情况。图2D-F展示了在相同条件下进行的五次实验合并后的事件分布。即使观测次数不多，直方图的形状仍然清晰可辨。由于每次实验均通过检测pH下降时间进行同步，因此可以将多个实验数据合并，从而获得有关速率限制中间步骤的详细信息。
<img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="流感病毒显微镜示意图；荧光染料标记；脂双层相互作用；时间推移。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="figure 1"> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="荧光强度随时间变化图；孔形成、半融合、pH传感器；实验动力学。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="figure 1"> 图1. 实验设计。A) 病毒颗粒用两种荧光染料标记，以监测半融合和融合孔形成的动力学过程。荧光信号由高数值孔径（NA）显微镜物镜收集，并成像至CCD上。B) 单个病毒颗粒融合前（左）和融合过程中（右）的荧光图像。每幅图像的上半部分和下半部分分别对应同一约50 × 100 mm2 支持性脂双层区域的红色和绿色荧光。C) 红色SRB病毒内容物示踪剂（上迹线）、绿色Rh110C18膜染料（中迹线）和荧光素pH传感器（下迹线）的荧光强度提供了pH下降、半融合和完全融合之间精确的时间间隔。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">点击此处</a>查看图1的放大版本。
<img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="半融合和孔形成直方图；频率与时间关系；融合过程分析。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图 2"> 图 2. 荧光标记病毒的融合动力学。pH 下降至发生半融合（A，D）以及孔形成（B，E）之间所经历时间的分布。分布曲线的上升和衰减表明存在多个中间步骤。单个颗粒从半融合到融合孔打开的转变呈指数分布，提示存在单一限速步骤。图 A-C 显示单次实验的结果。图 D-F 汇总了在相同条件下进行的五次独立实验的数据。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg">点击此处</a>查看图 2 的放大版本。

<ol><li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalisation+of+Si%2FSiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li>
<li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li>
</ol>

制备流体和连续支撑脂双层可能具有挑战性。微量的污染物或表面缺陷都会阻碍脂双层的铺展。仔细清洗并沉积一层均匀的葡聚糖至关重要。
长时间成像病毒颗粒可能导致荧光标记发生漂白或失活。此类光损伤在生物成像和单分子研究领域广为人知，通常认为是由激发态荧光分子产生活性氧物种所引起。为尽量减少光损伤，我们通常会降低激发激光功率，并避免在实验开始前进行长时间曝光。采用多种已报道的除氧系统之一将缓冲液中的氧气去除，可能有助于减轻这一问题。
要获取有关瞬态中间态的信息，必须精确同步融合反应。所使用的流速以及进样管路和流动池通道的死体积是可能限制同步性的因素。融合反应通过将中性pH缓冲液置换为酸性pH缓冲液来启动。然而，当酸性缓冲液流经进样管路进入流动池时，两种缓冲液之间的界面会因扩散而混合，并逐渐变得模糊不清。这会在双层膜表面形成pH梯度，导致起始时间的确定变得不清晰。此外，由于融合动力学依赖于质子浓度，实验开始时存在的pH梯度可能会使结果的解释复杂化。在本实验中，融合动力学过程远慢于pH转换时间，因此梯度效应对融合动力学的影响不显著。目前我...

<table><tbody><tr><td>康宁盖玻片，25 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS286525</td><td></td></tr><tr><td>熔融石英载玻片</td><td>Technical Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>染色架</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>(3-环氧丙基)三甲氧基硅烷</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIG5840.1</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖 T-500</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 4006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷脂酰胆碱 (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1-棕榈酰基-2-油酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷脂酰胆碱 (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-((6-(生物素基)氨基)己酰基)-1,2-二十六烷酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷脂&amp;#8211;乙醇胺，三乙基铵盐 (生物素-X DHPE)</td><td>Invitrogen</td><td>B1616</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-荧光素偶联物</td><td>Invitrogen</td><td>S-869</td><td></td></tr><tr><td>牛脑来源的双唾液酸神经节苷脂 GD&lt;sub&gt;1a&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2392</td><td></td></tr><tr><td>微型挤出器</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>0.1 微米聚碳酸酯膜滤器</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>10 mm 排水盘（膜支撑物）</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>230300</td><td></td></tr><tr><td>磺基罗丹明B钠盐</td><td></td><td>S1402</td><td></td></tr><tr><td>十八烷基罗丹明110 (Rh110C18)</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;参见&lt;/em&gt; Floyd &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2008 年发表的合成方案</td></tr><tr><td>PD-10 脱盐柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>尼康荧光显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA 物镜</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr 激光器</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702213</td><td></td></tr></tbody></table>

单颗粒水平病毒融合动力学的测量方法

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

膜融合是包膜病毒进入细胞过程中的关键步骤。传统的融合检测方法通常报告大量融合事件，难以对其中涉及的分子步骤序列进行定量分析。我们已开发出一种 体外 一种双色荧光检测方法，用于监测单个病毒颗粒在近似流体支撑的双层膜上融合的动力学过程。
将流感病毒颗粒与一种绿色亲脂性荧光染料共同孵育以标记其膜结构，同时使用一种红色亲水性荧光染料标记病毒内部。我们在葡聚糖功能化的流动池玻璃表面沉积一层含有神经节苷脂的脂双层，将病毒颗粒孵育在平面脂双层上，并利用CCD相机对包含数百个病毒颗粒的100 × 100 μm2区域进行荧光成像。通过同时成像红色和绿色荧光，我们可以同步监测病毒膜染料（绿色）和病毒内部水相内容物（红色）的行为。
当pH降低至低于融合pH值时，颗粒将与膜发生融合。半融合，即病毒膜的外层小叶与靶膜的外层小叶合并，会表现为颗粒绿色荧光的突然变化。随后，两个剩余的远端小叶进一步融合，形成孔道，病毒颗粒内发射红色荧光的荧光染料将被释放至靶膜下方。该事件将导致单个颗粒红色荧光的减弱。最后，嵌入靶膜中的pH敏感型荧光染料所发出的整合荧光信号，可报告pH下降的确切时间。
从三条荧光-时间轨迹中，现在可以简便地逐个提取每个颗粒的所有重要事件（pH值下降、半融合时的脂质混合、孔形成时的内容物混合）。通过将大量单个颗粒各种转变所经历的时间收集到直方图中，我们可以确定相应中间态的寿命。即使是那些没有直接荧光信号可观测的隐含中间态，也可以直接从这些直方图中显现出来。

我们提出一种 体外 一种双色荧光检测方法，用于可视化单个病毒颗粒与流动靶向双层膜的融合过程。通过使用可差异标记病毒膜及其内部结构的荧光染料对病毒颗粒进行标记，我们能够监测半融合及融合孔形成的动力学过程。

膜融合是包膜病毒进入细胞过程中的关键步骤。传统的融合检测方法通常报告大量融合事件的总体结果……

本实验所用的盖玻片经葡聚糖修饰后，整合至微流控流动池中。随后，每个流动池与脂质体悬浮液共同孵育，脂质体融合后在水合葡聚糖表面形成脂双层。在荧光显微镜下，加入四标记荧光病毒和荧光素标记链霉亲和素，使病毒与脂双层结合。酸性缓冲液的流入会启动病毒与双层膜的融合，同时数码相机记录整个实验过程中荧光信号的变化。大家好，我是 Daniel Floyd，来自哈佛大学生物化学与分子药理学系 Anine Vanian 的实验室。今天我将向大家展示一种在单颗粒水平上可视化病毒融合动力学的方法。我们在实验室中使用此方法研究病毒进入宿主细胞的途径。现在开始操作。首先准备经葡聚糖功能化的盖玻片。第一步是将盖玻片在含有10%洗涤剂、1 mol/L氢氧化钾丙酮以及100%乙醇的溶液中依次进行超声处理，每种溶液中超声30分钟。每次超声之间用去离子水冲洗。最后一次超声处理后，用清水冲洗盖玻片，然后在80°C的培养箱中干燥。接下来，将盖玻片放入氧气等离子体清洗仪中处理三分钟。此步骤可氧化载玻片表面，使玻璃在后续的硅烷化步骤中具有均匀的亲水性和反应活性。然后，将盖玻片浸入新配制的0.2% 3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷（glycidoxypropyl trimethoxysilane）异丙醇溶液中，孵育五分钟。然后用异丙醇多次冲洗盖玻片。将涂有SLAN的盖玻片置于80摄氏度下放置一小时。此固化步骤可使SLAN与玻璃表面发生共价结合。固化后，将盖玻片平放在塑料冷冻盒内部。用约一毫升的右旋糖酐溶液覆盖每张盖玻片的上表面，该溶液为水中配制的30%（质量/体积）右旋糖酐溶液。关闭冻存盒，将盖玻片静置于安静处 24 至 36 小时。次日，用塑料镊子夹住盖玻片，倒掉多余的右旋糖酐，然后将其放回陶瓷架中。用清水冲洗数次，并浸泡于水中 48 小时。可将容器置于台式旋转仪上轻轻振荡，随后在80摄氏度的烘箱中干燥盖玻片，并存放于真空干燥器中，直至准备进行下一步操作。用脂质体混合物包被盖玻片以形成平面双层膜。下一步是在通风橱中制备脂质体以形成脂双层：将溶解于氯仿中的所有脂质加入一支玻璃试管中并混合。脂质体配方包含二唾液酸神经节苷脂（dia ganglia side），可结合病毒颗粒，以及一种生物素化脂质，可结合链霉亲和素偶联的pH指示剂荧光素。接下来，在氩气或氮气气流下蒸发溶剂，并将试管置于真空干燥器中两小时以除去残留溶剂。用400微升HNE缓冲液重悬干燥的脂质膜。然后将悬液转移至一个塑料微量离心管中。在液氮浴中冷冻悬液，再在温水浴中解冻。在冻融循环之后，重复此冻融循环四次。使用配备100纳米膜过滤器的脂质挤出器挤出脂质悬浮液。挤出25次后，悬浮液应变得更为透明。将脂质体在室温下保存，并在制备当天使用。现在脂质材料已准备就绪，接下来准备微流控流动池。首先，取一块 20 × 20 × 3 毫米的石英玻璃片，使用金刚石钻头在相对的两侧各钻一个直径 1 毫米的孔。使用剃刀刀片从双面胶带上切下一块20毫米见方的胶带，然后从其中心切去一段15毫米×2毫米的区域。撕下胶带一侧的背衬，将胶带粘附到载玻片上。将另一侧粘附到已切割成20厘米长的聚乙烯管的功能化盖玻片上，并将其插入石英载玻片的孔中。最后，用五分钟环氧树脂胶密封流动池。将胶水涂抹在石英载玻片的四周，使其与盖玻片牢固粘合。再使用两滴胶水密封管路与石英载玻片之间的连接处。待胶水固化后，用 HNE 缓冲液对流动池和管路进行预处理。接下来制备支撑脂双层：取挤出的脂质体悬浮液，在融合实验前一天将约 80 微升吸入各通道中。开始标记病毒颗粒，以将病毒内部标记为红色。将20微升新配制的硫磺酰胺（SRB）溶液与10微升病毒悬液混合，在室温下孵育20小时。第二天，通过PD-10脱盐柱去除多余的染料，并用800微升HNE缓冲液稀释病毒悬液。柱上应出现明显的有色条带，其中含有标记的病毒。在接下来的洗脱步骤中收集此组分，通过向SRB标记的病毒悬液中加入13微升十八烷基罗丹明10或RH 10 C 18，将病毒包膜标记为绿色。将试管连接到实验室旋转仪上搅拌悬液，并静置三小时。接下来，使用 PD 10 脱盐柱去除过量的 RH one 10 C 18。此时病毒已准备好进行融合实验。利用配备高数值孔径油浸物镜的荧光显微镜进行融合动力学实验。一台阿贡国家实验室的氪离子激光器激发病毒膜及内部的荧光染料。随后，二向色镜将红色和绿色荧光发射信号分离，并将图像分别聚焦到电子倍增CCD（电荷耦合器件）相机的两个独立区域。将盖玻片安装在显微镜载物台上，并将出口管路连接至设定流速为100微升每分钟的注射泵。通过注入 300 微升 HNE 来清除多余的脂质体流道。聚焦显微镜，并调节激光功率，使用 488 纳米光以每平方厘米 350 瓦的强度照射表面以激发红色荧光，同时使用 568 纳米光以每平方厘米 70 瓦的强度激发绿色荧光。现在显微镜已准备就绪，将标记病毒按 1:100 稀释后泵入流动池中。当病毒扩散至流动通道的底面时，颗粒开始停靠。附着在嵌入盖玻片平面双层膜中的DIA神经节一侧。当每视野内停靠的颗粒密度达到数百个时，开始流入浓度为每毫升2微克的溶液。荧光素标记的链霉亲和素（strep streptavidin）是一种对pH敏感的荧光探针，当其与双层膜中生物素偶联的脂质分子结合后，会呈现微弱的绿色背景。用300微升HNE缓冲液冲洗流动通道。此时病毒已结合到位，双层膜表面也已覆盖荧光素，可以开始进行检测。选择成像区域，调节显微镜焦距，并准备CCD相机进行时间序列图像采集。将曝光时间设置为100毫秒，以每秒10帧的速率采集图像。通过灌注酸性柠檬酸钠缓冲液启动病毒膜融合。随着pH值下降，荧光素的荧光减弱，从而精确定位酸化发生的时间。CCD相机在整个检测过程中记录数据，可用于确定半融合及不良形成的时刻，这些均已被CCD相机记录。在pH值下降后，随着病毒膜与平面膜融合、脂质混合，病毒包膜中的绿色染料在平面膜中被稀释，出现绿色荧光的短暂爆发。相比之下，在pH值下降后，随着病毒膜与脂质膜形成孔道，病毒内部的红色染料会通过孔道释放到平面双层膜下方的水相空间并移出视野，导致红色荧光信号衰减；这些动态过程也可通过融合前和融合过程中的荧光快照进行可视化观察。同时，可绘制每个颗粒的荧光强度随时间变化的轨迹，如本示例所示。半融合（hemi fusion）定义为绿色荧光强度变化斜率最陡的时刻，而孔道形成则定义为红色荧光开始衰减的时刻。整合多个实验的数据，以pH值下降的时刻作为t=0，对不同实验的数据进行同步，进而生成半融合和孔道形成延迟时间的直方图，如图所示。我刚刚向您展示了一种在单颗粒水平上测量病毒融合动力学的方法。进行此操作时，请务必使用洁净的盖玻片，以确保形成均匀且具有流动性的双层膜。此外，在进行荧光成像时，应尽量减少光照强度，以最大限度地降低光损伤。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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病毒融合动力学测量方法在单粒子能级

单病毒基因组学（SVG）是一种用于分离和扩增单个病毒颗粒基因组的方法。通过流式细胞术将混合病毒悬液分选到含有琼脂糖的载玻片微孔中，从而捕获单个病毒颗粒，并在后续处理过程中减少基因组剪切。利用多重置换扩增（MDA）实现全基因组扩增，获得适用于测序的基因组材料。...

单病毒基因组学用于单个病毒颗粒的分离与基因组分析

本视频展示了一种用于评估靶向病毒进入宿主细胞及与内体融合特定步骤的抗病毒药物的检测方法。将细胞在低温下孵育，随后用丙型肝炎病毒（HCV）感染。低温条件允许病毒与宿主细胞结合，但通过内吞作用抑制其内化。via...

一种用于评估受试化合物对宿主细胞中病毒进入和融合影响的检测方法

病毒颗粒附着于表面是通过超分辨率荧光成像或原子力显微镜（AFM）进行单病毒颗粒成像的前提条件。本文展示了一种用于实现病毒颗粒在玻璃表面可控黏附的样品制备方法，适用于原子力显微镜和超分辨率荧光成像。...

单病毒颗粒原子力显微镜与超分辨率荧光成像的样品制备

我们介绍一种实验方案，描述了通过流式细胞术半定量检测甲型流感病毒与A549细胞的结合以及病毒颗粒向靶细胞内吞作用的方法。...

通过流式细胞术测定甲型流感病毒在A549细胞中的吸附与内化

沙粒病毒生命周期的第一步是病毒颗粒与宿主细胞的结合。我们报告了一种基于定量（q）RT-PCR...

高灵敏度检测方法用于测量沙粒病毒与细胞的结合

利用与识别表面抗原的抗体偶联的15...

利用流式病毒术分析病毒颗粒与细胞外囊泡的抗原谱

我们介绍一种开源的高内涵分析（HCA）仪器，该仪器利用自动化的荧光寿命成像（FLIM）技术，通过基于荧光共振能量转移（FRET）的检测方法来分析蛋白质相互作用。openFLIM-HCA 仪器的数据采集由基于 µManager 编写的软件控制，数据分析则在 FLIMfit...

利用自动荧光寿命成像显微镜的开源高内涵分析

利用病毒基因组扩增的常规检测方法受限于无法区分具有感染性与非感染性的病毒颗粒。本文旨在提供详细的实验方案，介绍利用适配体结合、动态光散射和透射电子显微镜等替代方法，以辅助区分具有感染性的诺如病毒颗粒。...

替代方法 体外 病毒衣壳结构完整性的测定方法

我们描述了一种基于细胞的检测方法，通过表达绿色荧光蛋白并利用流式细胞术或荧光显微镜进行检测，以报告HIV-1的融合过程。via该方法可用于在无细胞感染系统和细胞间感染系统中测试病毒进入抑制剂（特异性作用于融合步骤）。...

一种高通量Cre-Lox激活的病毒膜融合检测方法用于筛选HIV-1病毒膜融合抑制剂

本文提供了一种利用转染了双向报告质粒（表达tdTomato和eGFP）的HEK293T细胞，通过流式细胞术（FACS）检测BK多瘤病毒转录活性的实验方案。该方法还可用于定量评估新化合物对病毒转录的影响。...

通过流式细胞术测量BK多瘤病毒非编码调控区驱动的转录活性

本文介绍了一种新开发的多重荧光免疫测定法，该方法利用双报告系统流式细胞术，同时检测完整严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）病毒颗粒上的两个独特刺突蛋白表位，这些病毒颗粒已被血管紧张素转换酶2偶联的磁性微球捕获。...

通过多重双报告基因策略对病毒颗粒表面蛋白表位进行分析

学习双色荧光测定法在单粒子能级上可视化病毒融合动力学。该方法利用荧光显微镜实时监测半融合和孔形成过程，为病毒进入机制和抗病毒策略研究提供高分辨率工具。

单颗粒水平病毒融合动力学的测量方法

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