Name: 变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（尿素页） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-29T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学习变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，用于分离单链DNA或RNA片段。该方法结合尿素和加热使样品变性，根据分子量实现高效分离，适用于分子生物学研究中的寡核苷酸分析。

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本工作由新加坡学术研究理事会（ARC）[资助编号 90/07] 提供支持。感谢 Radiodurans 提供的支持。

本实验步骤的完整且详细的文本方案可在《分子生物学实验指南》中获取。有关凝胶夹心结构组装及凝胶装置的详细分步说明，可参见 BioRad 网站3。
所需设备： 
 玻璃板（内板和外板） 
 10 cm 电泳槽：10.1 × 7.3 cm（内板），10.1 × 8.2 cm（外板），BioRad 
 20 cm 电泳槽：20 × 20 cm（内板），20 × 22.3 cm（外板），BioRad 
 0.5–1.5 mm 胶梳和垫片 
 凝胶制备架 
 带盖和导线的电泳装置 
 高压电源 
 加热块或水浴锅 
 移液管和移液器辅助装置 
 移液器和移液器吸头 
 凝胶干燥器或扫描仪
试剂与溶液： 
 尿素（超纯） 
 40% 聚丙烯酰胺溶液（29:1） 
 10 × TBE 溶液（Tris-硼酸-EDTA 缓冲液） 
 去离子蒸馏水 
 TEMED 
 30% (w/v) 过硫酸铵溶液 
 0.5 × TBE 溶液 
 甲酰胺 
 EDTA 
 二甲苯腈蓝 
 溴酚蓝 
 甲醇 
 乙醇
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>体积</td>
 <td colspan="3" style="text-align:center;">50 ml</td>
 <td colspan="3" style="text-align:center;">60 ml</td>
 <td colspan="3" style="text-align:center;">10 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>丙烯酰胺浓度</td>
 <td>10%</td>
 <td>12.5%</td>
 <td>15%</td>
 <td>10%</td>
 <td>12.5%</td>
 <td>15%</td>
 <td>10%</td>
 <td>12.5%</td>
 <td>15%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>g 尿素</td>
 <td>24</td>
 <td>24</td>
 <td>24</td>
 <td>28.8</td>
 <td>28.8</td>
 <td>28.8</td>
 <td>4.8</td>
 <td>4.8</td>
 <td>4.8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ml 40% 丙烯酰胺 (29:1)</td>
 <td>12.5</td>
 <td>15.625</td>
 <td>18.75</td>
 <td>15</td>
 <td>18.75</td>
 <td>22.5</td>
 <td>2.5</td>
 <td>3.125</td>
 <td>3.75</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>μl 30% APS</td>
 <td>166</td>
 <td>166</td>
 <td>166</td>
 <td>199.2</td>
 <td>199.2</td>
 <td>199.2</td>
 <td>33</td>
 <td>33</td>
 <td>33</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>μl TEMED</td>
 <td>20</td>
 <td>20</td>
 <td>20</td>
 <td>24</td>
 <td>24</td>
 <td>24</td>
 <td>4</td>
 <td>4</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x TBE</td>
 <td>5</td>
 <td>5</td>
 <td>5</td>
 <td>6</td>
 <td>6</td>
 <td>6</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="10">用去离子蒸馏水定容至相应体积</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1：分离单链寡核苷酸所需不同丙烯酰胺浓度和体积的试剂与溶液
凝胶三明治组装与凝胶制备
<ol>
<li>根据制造商的说明组装凝胶，并将凝胶固定在凝胶制备室中3。使用0.5–1.5 mm厚的隔片。</li>
<li>根据分子生物学中的现行实验方案或表1所列方法，配制适当的聚丙烯酰胺溶液。对于20 cm × 22 cm × 1.5 mm的变性丙烯酰胺凝胶，60 ml凝胶溶液即可；而对于10.1 cm × 8.2 cm × 1 mm的凝胶，则仅需5 ml凝胶溶液。当预期产物/条带大小相差仅几个碱基时，应使用较大的凝胶，因为较长的凝胶可分辨仅相差一个核苷酸的条带。若预期条带之间的差异超过10个核苷酸，则较小的凝胶即可有效分辨这些片段。根据分离需求选择合适的聚丙烯酰胺浓度：聚丙烯酰胺浓度越高，越有利于分辨低分子量的片段。使用超纯尿素，并与所需量的丙烯酰胺混合。加入TBE缓冲液至凝胶混合液中，使最终浓度为0.5–1 × TBE，并用去离子蒸馏水补足体积。将溶液在微波炉中加热20秒，然后轻轻混匀。对于较大体积的凝胶溶液，重复此步骤直至溶液手感微温。</li>
<li>立即使用移液管和自动移液辅助装置将凝胶溶液注入两块玻璃板之间。避免引入气泡。插入梳子，并让凝胶聚合30–60分钟。</li>
</ol>
安装电泳装置并预电泳凝胶
<ol>
<li>将凝胶从制胶室拆下，并根据制造商说明将其组装到电泳装置中3。</li>
<li>用运行缓冲液（0.5–1 × TBE）填充下层缓冲液室，使玻璃板浸入缓冲液中 2–3 cm。用运行缓冲液将上层缓冲液室加至凝胶顶部。</li>
<li>小心移除梳子，并使用移液器和上样枪头用运行缓冲液冲洗加样孔。</li>
<li>安装电泳系统的盖子，并将电缆连接至高压电源。在上样前，需预电泳至少 30 分钟，以使凝胶升温并去除凝胶中残留的尿素。最佳温度应维持在 45–55 °C 之间。避免温度超过 60 °C，否则条带可能弥散或玻璃板可能破裂。预电泳时应选择恒定功率（每块凝胶 15–25 W）。</li>
</ol>
样品制备
<ol>
<li>在此期间，准备您的样品。向样品中加入适量的 2 × 上样缓冲液。该上样缓冲液通常含有 90% 甲酰胺、0.5% EDTA、0.1% 二甲苯青和 0.1% 溴酚蓝。</li>
<li>在将样品上样至凝胶之前，必须通过将样品在 70–90 °C 加热数分钟进行热变性处理。</li>
</ol>
上样并运行凝胶电泳
<ol>
<li>预运行结束后，取下盖子，并按照之前所述方法彻底冲洗加样孔，因为尿素已渗入凝胶孔中。</li>
<li>加样时应小心地从加样孔底部加入样品，避免产生气泡。未加样的孔需加入上样缓冲液，以保持电泳过程中各孔条件一致。</li>
<li>装上盖子，以恒定功率进行电泳，使凝胶温度维持在55 °C，与预运行条件相同。观察指示染料的迁移情况，直至染料前沿到达凝胶底部。电泳时间取决于所用丙烯酰胺的浓度、缓冲液的离子强度以及凝胶厚度，通常持续2至4小时。 
 请密切关注凝胶温度，可使用凝胶温度计在电泳过程中监测温度是否适宜。</li>
</ol>
处理凝胶
<ol>
<li>当染料前沿到达凝胶末端时，将凝胶从下层缓冲液槽中取出。移除凝胶并松开夹子，取下间隔片，小心拆开玻璃板。如有必要，切除含有上样孔的凝胶部分。</li>
<li>将凝胶小心转移至含有凝胶固定液的容器中（固定液为相同浓度的TBE缓冲液，加入5-10%甲醇和乙醇）。将凝胶在固定液中浸泡5-10分钟，并更换缓冲液两次。</li>
<li>凝胶现已准备好进行后续处理，可使用真空凝胶干燥仪干燥或直接进行凝胶扫描。</li>
</ol>

<ol><li>Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+length+determination+of+small+double-+and+single-stranded+DNA+molecules+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlbright%2C+LM+%22Curr+Protoc+Nucleic+Acid+Chem%22">Curr Protoc Nucleic Acid Chem</a>. , (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PROTEAN+II+xi+Cell+and+PROTEAN+II+xi+2-D+Cell+Instruction+Manual%22">PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual</a>. , Biorad. (2001).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

<ol>
<li>条带的清晰度取决于多个因素。为了获得清晰的条带，上样体积应尽可能小，理想情况下为 1-5 μl。然而，最多可上样至 15 μl，仍可保证可接受的分辨率。较小的上样体积可产生更清晰的条带。</li>
<li>条带质量还与凝胶厚度有关。较薄的凝胶（如 0.75 mm）比 1.5 mm 厚的凝胶效果更好。</li>
<li>在加样过程中，若样品未均匀加入凝胶孔中，也可能影响条带形状。在上样缓冲液中加入 10% 甘油有助于加样操作，使样品更易沉入加样孔内。</li>
<li>另一个可能与上样缓冲液相关的问题是，目标产物的迁移位置可能与其中一种上样染料相同。此外，若使用荧光标记，某些染料可能在相似波长处产生荧光信号。若出现此类情况，可通过去除一种或全部染料来解决。此时建议将含染料的样品上样于空加样孔中作为分子量标准。</li>
<li>电泳开始时采用较低电压也有助于获得更清晰的条带，因为样品可更平缓地进入凝胶前缘，避免因高电压导致加样孔塌陷。使用短时间的低浓度丙烯酰胺浓缩胶（4%）也可达到相似的条带增锐效果。</li>
<li>一个常见问题是凝胶“微笑”现象，这是由于电泳过程中凝胶内部热量分布不均所致。若凝胶未被缓冲液完全包围，可根据所用凝胶系统，在玻璃板上附加金属板以促进热...

变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（urea page）

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

尿素PAGE或变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳采用6-8 M尿素，可使DNA或RNA的二级结构发生变性，并基于分子量在聚丙烯酰胺凝胶基质中实现其分离。该方法可用于分离长度在2至500个碱基之间的片段，甚至可分辨仅相差一个核苷酸的长度差异1。样品的迁移行为取决于所选用的丙烯酰胺浓度。较高浓度的聚丙烯酰胺可更好地分辨低分子量片段。在电泳过程中结合使用尿素以及45-55 °C的温度，可实现非结构化DNA或RNA分子的分离。
通常，该方法用于分析或纯化单链 DNA 或 RNA 片段，例如合成或标记的寡核苷酸，或酶切反应的产物。
在本视频文章中，我们展示了如何制备和运行变性尿素聚丙烯酰胺凝胶。除原始方案1,2外，还包括技术提示。

变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离单链DNA或RNA，最大可分离长度达500个核苷酸。尿素与加热共同作用使样品变性，未形成结构的单链根据其分子量在凝胶基质中迁移。

变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（Urea PAGE）

尿素PAGE或变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳采用6-8 M尿素，可使DNA或RNA的二级结构变性，用于其...

通常，这种凝胶用于分离单链 DNA 或 RNA 片段，例如合成或标记的寡核苷酸，或酶切反应的产物。分离范围取决于聚丙烯酰胺浓度，在尿素存在下结合加热使样品变性，单链分子则根据其分子量在凝胶基质中迁移。本视频展示了典型凝胶的灌制、电泳及后续处理过程。大家好，我叫Haki，来自南洋理工大学。在本次演示中，我将向大家展示如何进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用洁净的玻璃板，按照制造商说明组装凝胶夹心结构。将凝胶固定在凝胶制备标准槽中。若大尺寸凝胶容易粘附玻璃板，需对玻璃板进行防粘处理。根据您的分离需求选择凝胶的尺寸和厚度。按照分子生物学的现有方案配制凝胶溶液。选择适合您分离需求的聚丙烯酰胺浓度。较高浓度的丙烯酰胺可更好地分辨低分子量片段。使用 Alta pure UIA 并在烧杯或瓶子中与所需量的聚丙烯酰胺混合。向溶液中加入10倍体积的XTBE缓冲液，并用水补足至所需体积。将溶液在微波炉中加热20秒，然后轻轻混匀，直至所有UIA完全溶解。如有需要，可将溶液保存，以备制备较大体积的凝胶使用。重复微波步骤，直至溶液达到手温。避免过度加热溶液。切勿过热，因为尿素在超过60摄氏度时会开始降解。当溶液变得澄清并冷却至室温时，可通过氨的气味判断是否达到摄氏温度。此时向凝胶溶液中加入PS和tamid，并轻轻混匀。如果凝胶溶液温度过高，凝胶将在移液器内部发生聚合。使用刻度移液管将凝胶注入两块玻璃板之间，同时使用移液器辅助装置。避免引入气泡。小心插入梳子。尽量避免产生气泡，并让凝胶聚合 30 至 60 分钟。从制胶架上取下凝胶，并将其安装到上层缓冲室中。根据制造商的说明书，将凝胶放入下层缓冲室，并用凝胶电泳缓冲液（通常为 0.5 至 1 倍 TBE）填充底部储液槽。与制胶时相同的浓度，用凝胶电泳缓冲液填充上层缓冲液室，直至液面达到玻璃板边缘。在上样之前，必须预先电泳至少30分钟，以使凝胶升温并去除凝胶中残留的尿素。最佳温度应保持在45至55摄氏度之间，与实际电泳时的温度相同。避免温度超过60度，否则条带可能弥散或玻璃板可能破裂。小心移除上层液体，不要扰动边缘，并用缓冲液冲洗加样孔，以去除渗入其中的尿素。使用凝胶加样枪头，上下吹打数次。对于每个胶块，安装凝胶系统的盖子，并将电缆连接至高压电源。预电泳时选择恒定功率模式，每块凝胶约15至20瓦。当电源开启后，出现气泡表明导电良好。在此期间，准备您的样品，因此向样品中加入适量的两倍上样缓冲液。预电泳结束后，取下盖子，并如前所述彻底清洗加样孔，仔细冲洗凝胶孔至关重要，以去除尿素残留物，因为尿素会形成致密层，阻碍样品进入凝胶。就在您面前。通过将样品在至少70摄氏度下孵育数分钟，进行加热处理。从孔底部小心地施加样品。对于某些应用，染料可能会干扰样品，导致条带弥散，或染料自身产生荧光信号。此时，去除一种或全部染料，并上样含有标准染料的缓冲液会更为合适。在空的加样孔中加入分子量标准品，为获得清晰的条带，理想上样量为一至五微升，但也可根据需要上样更高体积，最多可达15微升。样品体积越小，条带越清晰。避免引入气泡，让样品缓慢沉入加样孔，以形成均匀的层。如果使用荧光标记，请用铝箔包裹凝胶系统，避免暴露于光线，以防样品发生光漂白。安装好盖子并接通电源。电泳运行至DIA前沿到达凝胶底部为止。运行时间取决于丙烯酰胺的浓度百分比。您可选择缓冲液的离子强度、凝胶厚度和长度。电泳运行时间可持续一至数小时。通过观察标记物的迁移情况，确定电泳终止时机。使用恒定功率并检查凝胶的温度。在电泳过程中，可使用凝胶温度计监测适宜温度，或在电泳结束时查阅凝胶装置的说明书。关闭电源，取下凝胶装置的盖子。接下来，将凝胶夹心装置从下层缓冲液室中取出。倒掉上层缓冲液室中的缓冲液。用固定液充满一个培养皿。该溶液应含有相同浓度的TB，以及5%至10%的甲醇和乙酸。从装置中取出凝胶夹心结构，松开夹子。移除垫片，并使用刮刀小心地拆开玻璃板。如有必要，将含有胶体部分或下部空胶部分的条带切下，并丢弃无用的胶块，例如含有染料的泳道部分。对于荧光样品，小心地将凝胶从玻璃板上剥离，并转移至盛有凝胶固定液的培养皿中。将凝胶置于溶液中5到10分钟，并更换两次缓冲液。根据具体应用，轻轻摇动培养皿以洗去凝胶中的尿素，或将凝胶放入染色液中。凝胶的质量还取决于凝胶的厚度。较薄的凝胶（如 0.75 毫米）比 1.5 毫米厚的凝胶效果更好，但操作难度更高。条带的清晰度取决于多个因素。在电泳开始时使用较低电压，有助于获得更清晰的条带，并使样品平滑进入凝胶前缘，从而避免因高电压导致凝胶加样孔塌陷。使用较短的低浓度丙烯酰胺浓缩胶也可达到同样的条带锐化效果，加入10%甘油也有助于上样时样品顺利沉入加样孔。可更方便地向空加样孔中加入上样缓冲液，以维持电泳过程中各孔条件一致。当凝胶处于固定液中时，可根据所使用的标签或染料类型，使用真空凝胶干燥仪干燥凝胶以进行后续成像，或直接对凝胶进行扫描。此U型页面适用于分析或分离单链DNA或RNA样品。凝胶可在室温下保存。因此，用纸巾包裹凝胶，并用水或运行缓冲液浸泡。将包裹好且湿润的凝胶放入密封袋中，于48小时内使用。常见的问题之一是凝胶边缘上翘（gel smiling）。这是由于凝胶中热量分布不均所致。如果凝胶未被缓冲液完全包围，可通过附加一块金属板来提高凝胶的质量。你好，我是 Hi Kasam。我来自南洋理工大学。我向您演示了如何进行变性聚合酶链式反应。下次再见。

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科研

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Biology

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