一个定量评估的酵母使用电喷雾质谱法Lipidome

该协议允许人们快速分析酵母脂质的主要成分。它从收获和洗涤酵母细胞开始。将洗涤后的细胞置于 1 至 2 氯仿、甲醇混合物中，并用玻璃珠裂解。

添加氯仿和水可分离两相。收集有机相，干燥，然后将脂质膜溶解在氯仿中，以便在质谱分析前储存。将提取的脂质用氯仿和甲醇与氢氧化铵稀释，并加入内标混合物。

脂质溶液现在可以直接注入质谱仪中。大家好，我是来自康考迪亚大学生物系 Vladimir Teco 实验室的 Simon Bork。今天，我将向您展示一种使用质谱法定量酵母脂质的方法。

我们在实验室中使用该程序来研究不同生长条件下酵母脂质的变化。那么让我们开始吧。要开始此过程，将先前制备的冷冻酵母沉淀悬浮在 1.6 毫升冰、冷蒸馏水中，并将 1.6 毫升细胞悬液转移到高速玻璃离心管中。

请注意，在整个过程中，所有提取脂质的作均使用玻璃移液器或注射器完成。由于塑料会产生较大的背景信号，因此如果它们与氯仿接触，则通过以 1 比 2 的比例加入 6 毫升氯仿甲醇混合物和 0.8 毫升在精英管中测量的玻璃珠到细胞悬液中来开始脂质提取。只要保持悬浮在水中的氯仿、甲醇和酵母的 1 比 2 比 0.8 的比例，确切的体积并不重要。旋涡。

细胞悬液和玻璃珠混合 2 次，每次 1 分钟，继续加入 2 毫升氯仿并轻轻混合，然后在室温下孵育 5 分钟，偶尔混合。孵育 5 分钟后，加入 2 毫升蒸馏水并轻轻混合。然后，在室温下孵育 5 分钟，偶尔混合。

在这里，对于氯仿、甲醇和水保持 2 比 2 比 1.8 的比例，而不是特定体积，更为重要。第二次孵化完成后。在室温下以 3000 Gs 离心 5 分钟，将第一次提取的所有上清液收集到新的高速玻璃离心管中，并向剩余的细胞沉淀中加入 3.2 mL氯仿，进行第二次脂质提取。

用添加的氯仿涡旋细胞沉淀两次，每次 1 分钟。然后在室温下以 3000 Gs 离心 5 分钟，将第二次提取的上清液添加到第一次提取后收集的上清液中。接下来，将收集的上清液离心 5 分钟。

在室温下 3000 Gs 时，提取的脂质现在溶解在较低的有机相中。弃去上层水相，将下层相转移到新的高速玻璃离心管中。为了在质谱离心机上产生更清晰的光谱，有机相在室温下以 3000 Gs 反应 5 分钟，然后将整个上清液转移到玻璃样品瓶中。

在氮气下干燥溶解的脂质，将干燥的脂质膜溶解在 500 微升氯仿中，并在零下 20 摄氏度下储存，直到准备好通过质谱分析样品。首先在氯仿中制备脂质的标准混合物，如随附的书面方案中的表 1 所示。每种脂质代表不同的类别。

该溶液可以储存在零下 20 摄氏度，以备后在将提取的脂质注入质谱仪之前使用。将 10 μL 样品与 10 μL 脂质标准混合物混合。请注意，标准品与样品的比率可以根据需要更改。

使用微量 Q 到 F 2 质谱仪分离样品和标准脂质混合物，该质谱仪配备以每分钟 1 微升的流速运行的纳离子电喷雾源。这些设置在随附的书面协议的表 2 中详细说明。尽管使用 Q 到 F 质谱仪的高分辨率是有利的，但这不是强制性要求。

确切的仪器参数因质谱仪而异。数据采集后，对质谱进行平滑处理，减去背景，使峰居中。最后，将峰列表导出到 excel。

然后将每个脂质玻璃的峰归一化为内标。根据应用的不同，可能需要执行进一步的后处理，例如 de isotope 和 deconvolution。该方法允许快速深入测定酵母脂质的主要成分。

在这里，我们重点介绍了一种脂质，它已被 de isotope de convoluted 并归一化为其内标。我们刚刚向您展示了如何分离酵母脂质，以及如何使用电显示电离质谱法测定酵母脂质。执行此程序时，请务必记住避免使用塑料，并将样品保持在线性浓度范围内。

这种方法非常灵活，并且在许多卷中可以根据需要进行更改。该萃取方案也适用于其他脂质分析方法，例如薄层色谱和多维质谱。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。