Name: 一个定量评估的酵母使用电喷雾质谱法Lipidome (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-21T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学习使用电喷雾质谱法对酵母脂质组进行定量分析的方法。该方法通过氯仿-甲醇提取和玻璃珠裂解细胞，实现高灵敏度、高分辨率的脂质鉴定与定量，适用于研究不同生长条件下酵母脂质代谢变化。

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我们感谢 Alain Tessier 提供的宝贵建议、讨论和专业技术支持。我们感谢康考迪亚大学质谱在生物应用中心提供的卓越服务。本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR）和加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）资助的支持。V.I.T. 是 CIHR 新晋研究员，以及康考迪亚大学基因组学、细胞生物学与衰老研究讲席。

材料与方法
<ol>
	<li>酵母菌株及培养条件 
		野生型菌株 BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) 在 YEPD 富集培养基（1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖）中培养。细胞在 30°C 下于锥形瓶中以 200 rpm 振荡培养，培养瓶体积与培养基体积之比为 5:1。</li>
	<li>用于脂质提取的酵母细胞储存 
		<ol>
 	<li>通过在 3000 × g 离心 5 分钟收集 50 ml 培养物中的细胞。</li>
			<li>用预冷的水洗涤两次。
				<ol style=" list-style-type:lower-alpha;">
					<li>将沉淀重悬于 25 ml 冰冷水中</li>
					<li>在离心机中以 3000 × g 离心 5 分钟收集细胞沉淀</li>
				</ol></li>
			<li>将沉淀重悬并转移至离心管中</li>
			<li>以 16,000 × g 离心 2 分钟收集沉淀，弃去上清液后于 -80°C 冻存&nbsp;备用。（我们使用放置在 -80°C 冰箱中的异丙醇烧杯，也可使用液氮）</li></ol></li>
	<li>试剂 
		生物技术级氯仿和甲醇购自 Sigma-Aldrich。游离脂肪酸和三酰甘油购自 Larodan（Malmo，瑞典）。各种磷脂——包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸和心磷脂——购自 Avanti Polar Lipid（Alabaster，AL，美国）。带聚四氟乙烯衬里盖的高速玻璃离心管购自 Fisher。</li>
</ol>
脂质提取
这是对 Bligh 和 Dyer 所描述方案的改进8所有提取脂质的操作均应使用玻璃移液管或注射器；塑料制品若接触氯仿会产生较强的背景信号。氯仿-甲醇-水的体积比为1:2:0.8，具体体积无需精确，只要保持该比例即可。2在步骤3中为O，氯仿-MeOH-H的比例为2:2:1.82在第7步中，O是保守的。
<ol>
<li>将冻存的细胞重悬于 1.6 ml 冰冷的蒸馏 H2O 中。</li>
<li>将 1.6 ml 细胞悬液转移至高速玻璃离心管中。</li>
<li>向细胞悬液中加入 6 ml 氯仿与甲醇（1:2）混合液以及 0.8 ml 玻璃珠。</li>
<li>用涡旋振荡器将含玻璃珠的细胞悬液振荡两次，每次 1 分钟。</li>
<li>加入 2 ml 氯仿，轻轻混匀。</li>
<li>室温孵育 5 分钟，期间偶尔混匀。</li>
<li>加入 2 ml 蒸馏 H2O，轻轻混匀。</li>
<li>室温孵育 5 分钟，期间偶尔混匀。</li>
<li>在室温下以 3000 × g 离心 5 分钟。</li>
<li>将全部液相转移至新的高速玻璃离心管中。</li>
<li>向第 9 步得到的细胞沉淀中加入 3.2 ml 氯仿。</li>
<li>涡旋振荡两次，每次 1 分钟。</li>
<li>在室温下以 3000 × g 离心 5 分钟。</li>
<li>将上清液加入第 10 步所得的液相中。</li>
<li>在室温下以 3000 × g 离心 5 分钟。</li>
<li>弃去上层（水相），将下层（有机相）转移至新的高速玻璃离心管中。</li>
<li>在室温下以 3000 × g 离心 5 分钟。</li>
<li>将全部上清液转移至玻璃样品瓶中，并在氮气下吹干。</li>
<li>用 500 μl 氯仿溶解脂质薄膜，并于 -20°C 保存。</li>
</ol>
质谱法分析脂质
应按照表1预先配制氯仿中的脂质标准品储备混合液，以及含有0.1%（v/v）氢氧化铵的甲醇-氯仿（1:1）储备溶液。
<ol><li>注射前，将10 μl样品与表1提供的脂质标准混合物10 μl混合，溶于200 μl的氯仿:甲醇（1:1）溶液中，其中含0.1% NH4OH。
<ul><li>可根据需要调整标准品与样品的比例。</li></ul></li>
<li>使用配备纳米电喷雾离子源的Micromass Q-TOF 2质谱仪，以1 μl/min的流速分离脂质。
<ul><li>具体仪器参数因设备而异。表2列出了配备纳米电喷雾离子源的Micromass Q-ToF 2质谱仪（Waters, Milford, MA, USA）的设置参数。尽管我们利用了Q-TOF型质谱仪的高分辨率优势，但该类型仪器并非必需。</li></ul></li>
<li>采集质谱数据后，对谱图进行平滑处理、背景扣除和峰中心校正，然后将峰列表导出至Excel。随后将每类脂质的峰强度归一化至其对应的内标。根据具体应用需求，可能还需进行进一步的后期处理，如去同位素峰和去卷积。</li></ol>
表1. 内标脂质、其在标准混合物中的浓度以及用于分析的质谱模式。
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>脂质类别</td>
 <td>标准链组成</td>
 <td>标准物质质量</td>
 <td>浓度 (μg/ml)</td>
 <td>质谱模式</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>磷脂酸</td>
 <td>14:0/14:0</td>
 <td>591.40</td>
 <td>100</td>
 <td>负离子模式</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>磷脂酰乙醇胺</td>
 <td>14:0/14:0</td>
 <td>634.45</td>
 <td>200</td>
 <td>负离子模式</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>磷脂酰肌醇</td>
 <td>不适用</td>
 <td>不适用</td>
 <td>不适用</td>
 <td>负离子模式</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>磷脂酰丝氨酸</td>
 <td>14:0/14:0</td>
 <td>622.37</td>
 <td>40</td>
 <td>负离子模式</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>心磷脂</td>
 <td>4×14:0</td>
 <td>619.92</td>
 <td>100</td>
 <td>负离子模式</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>游离脂肪酸</td>
 <td>19:0</td>
 <td>297.28</td>
 <td>100</td>
 <td>负离子模式</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>磷脂酰胆碱</td>
 <td>14:0/14:0</td>
 <td>650.48</td>
 <td>100</td>
 <td>正离子模式</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>三酰甘油</td>
 <td>13:0/13:0/13:0</td>
 <td>698.63</td>
 <td>200</td>
 <td>正离子模式</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表2. 配备纳米电喷雾源的Micromass Q-ToF 2（Waters，美国马萨诸塞州米尔福德）仪器设置。
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>&nbsp; </td>
 <td>流速</td>
 <td>锥孔电压</td>
 <td>毛细管电压</td>
 <td>碰撞气体</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>正离子模式</td>
 <td>1μl/min</td>
 <td>-28 v</td>
 <td>3.0 kv</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>负离子模式</td>
 <td>1μl/min</td>
 <td>30 v</td>
 <td>-3.2 kv</td>
 <td>10</td>
 </tr>
</tbody>
</table>

<ol><li>Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+lipokine%2C+a+lipid+hormone+linking+adipose+tissue+to+systemic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism.</a> Cell. 134, 933-944 (2008).</li>
<li>Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+defines+the+interactome+of+the+major+ADP%2FATP+carrier+protein+of+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane.</a> J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).</li>
<li>Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signal+from+inside+the+peroxisome+initiates+its+division+by+promoting+the+remodeling+of+the+peroxisomal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).</li>
<li>Russell, S. J., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of ageing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).</li>
<li>Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+storage+and+degradation+of+neutral+lipids+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).</li>
<li>Br&uuml, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &amp, F. T., Lehmann, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+biological+membrane+lipids+at+the+low+picomole+level+by+nano-electrospray+ionization+tandem+mass+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).</li>
<li>Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+%28ESI-MS%2FMS%29+analysis+of+the+lipid+molecular+species+composition+of+yeast+subcellular+membranes+reveals+acyl+chain-based+sorting%2Fremodeling+of+distinct+molecular+species+en+route+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
</ol>

该方法利用 readily available 且 inexpensive 的材料，可对酵母脂质组进行快速定量分析。该方法能够鉴定出酵母细胞中大多数脂质种类，但二酰基甘油、麦角固醇及其酯类除外；不过，若将氢氧化铵替换为氢氧化锂，则也可鉴定这些脂质。所述方法可实现低至 μg/ml 浓度的脂质鉴定与定量，浓度线性范围跨越 2 至 3 个数量级（具体取决于脂质种类）。尽管目前 commercially available 的磷脂酰肌醇标准品尚不可得，但可利用其他磷脂类标准品对这种磷脂的不同分子形式进行评估。

利用电喷雾电离质谱法对酵母脂质组进行定量分析

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

脂质是生物大分子的主要类别之一，在膜动力学、能量储存和信号传导中发挥着重要作用1-4. 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，一种基因组已注释、脂质组极为简单且可进行遗传和生化操作的单细胞真核生物，是研究多细胞真核生物中各类脂质分子生物学功能的宝贵模型2,3,5.S. cerevisiae具有10大类脂质，其碳链长度主要为16或18个碳原子，且通常不含或含有一个不饱和键6,7. 用于脂质鉴定与定量的现有方法——例如高效液相色谱法、薄层色谱法、荧光显微镜技术，以及气相色谱联用质谱法（MS）——虽然已较为成熟，但存在灵敏度低、难以充分分离脂质的不同分子形式、分析前需对脂质进行衍生化处理，或耗时较长等局限性。本文详细描述了我们采用全扫描电喷雾电离质谱法（survey-scan ESI/MS）来鉴定和定量酵母细胞中全部脂质组的实验方法，以克服上述固有缺陷。该方法无需对从酵母细胞中提取的复杂脂质混合物进行色谱分离，从而显著加快数据采集过程。本方法可在低至 g/ml 的浓度下实现脂质的鉴定与定量，已成功应用于完整酵母细胞及其纯化细胞器的脂质组分析。采用该脂质分析方法时，从完整酵母细胞中提取脂质需时两到三小时。在配备纳米电喷雾离子源的Q-TOF质谱仪上，每份提取并干燥后的脂质样品仅需五到十分钟即可完成检测。

我们介绍一种新的定量脂质组学方法，利用全扫描电喷雾电离质谱法（ESI/MS）鉴定酵母中的多种脂质种类。该方法在分辨各类脂质分子形式的能力、灵敏度和检测速度方面均优于目前可用的脂质鉴定与定量方法。

脂质是生物大分子的主要类别之一，在膜动力学、能量储存和信号传导中发挥重要作用1-4。出芽酵母……

本方案可快速分析酵母脂质的主要组分。首先收获并清洗酵母细胞，将清洗后的细胞置于体积比为1:2的氯仿-甲醇混合液中，并使用玻璃珠进行裂解。加入氯仿和水以分离两相。收集有机相，干燥后将脂质薄膜溶解于氯仿中，储存备用，用于质谱分析。提取的脂质用氯仿和甲醇稀释，加入氢氧化铵及一系列内标混合物。现在可将脂质溶液直接注入质谱仪中。大家好，我是来自康考迪亚大学生物学系Vladimir Teco实验室的Simon Bork。今天我将向大家展示一种利用质谱法对酵母脂质进行定量分析的方法。我们在实验室中采用此方法研究酵母在不同生长条件下脂质的变化。现在开始操作。首先，将先前制备的冷冻酵母菌团块重悬于1.6毫升冰上预冷的蒸馏水中，然后将1.6毫升细胞悬液转移至高速玻璃离心管中。请注意，在整个操作过程中，所有对提取脂质的处理均需使用玻璃移液管或注射器。由于塑料制品接触氯仿后会产生较强的背景信号，因此脂质提取应先向细胞悬液中加入6毫升氯仿-甲醇混合液（体积比为1:2）以及0.8毫升在离心管中量取的玻璃珠。只要保持氯仿、甲醇和悬浮于水中的酵母体积比为1:2:0.8，具体体积无需精确。充分涡旋振荡。将细胞悬液与玻璃珠混合，每次一分钟，共两次；随后加入两毫升氯仿，轻轻混匀，于室温孵育五分钟，期间偶尔混匀。五分钟后，加入两毫升蒸馏水，轻轻混匀，再次于室温孵育五分钟，期间偶尔混匀。此处同样，维持氯仿、甲醇和水的体积比为2:2:1.8比特定体积更为重要。第二次孵育完成后，在室温下以3000 × g离心5分钟，收集第一次提取的所有上清液至一个新的高速玻璃离心管中，并向剩余的细胞沉淀中加入3.2毫升氯仿，进行第二次脂质提取。加入氯仿后，将细胞沉淀涡旋振荡两次，每次一分钟。然后在室温下以3000 ×g离心五分钟，将第二次提取的上清液加入第一次提取后收集的上清液中。接着将合并的上清液再次离心五分钟。在室温下以3000 G离心后，提取的脂质现溶解于下层有机相中。弃去上层水相，将下层有机相转移至新的高速玻璃离心管中。为在质谱仪检测时获得更清晰的谱图，需在室温下以3000 G将有机相再次离心5分钟，并将全部上清液转移至玻璃样品瓶中。在氮气下干燥溶解的脂质，将干燥的脂质薄膜溶于500微升氯仿中，并在负20摄氏度下保存，直至准备通过质谱分析样品。首先，按照随附书面方案中表一列出的成分，在氯仿中配制脂质的标准混合液。每种脂质代表一个不同的类别。该溶液可在注射提取的脂质进入质谱仪之前，于零下20摄氏度保存以备后续使用。将10微升样品与10微升脂质标准混合物混合。请注意，标准品与样品的比例可根据需要进行调整。使用配备纳米电喷雾离子源（流速为每分钟1微升）的微流质谱Q-to-F质谱仪分离样品和标准脂质混合物。相关参数设置详见随附书面方案中的表2。尽管使用高分辨率的Q-to-F质谱仪具有优势，但并非必需条件。质谱仪的具体仪器参数会有所不同。数据采集后，对质谱图进行平滑处理、扣除背景，并对峰进行居中校正。最后，将峰列表导出至 Excel。然后将每种脂质玻璃的峰强以其内标物进行归一化。根据具体应用，可能需要进行进一步的后处理，例如去同位素和解卷积。该方法可实现对酵母脂质组主要组分的快速深入测定。在此，我们突出显示了一种脂质，该脂质已进行去同位素卷积处理，并归一化至其内标物。我们刚刚向您展示了如何分离酵母脂质，以及如何利用电喷雾电离质谱法测定酵母脂质。在执行该实验流程时，需注意避免使用塑料器皿，并确保样品浓度处于检测的线性范围之内。该方法具有较强的灵活性，许多体积参数均可根据需要进行调整。此提取方案也适用于其他脂质分析方法，例如薄层色谱法和多维质谱法。以上即为全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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