一个定量评估的酵母使用电喷雾质谱法Lipidome

本方案可快速分析酵母脂质的主要组分。首先收获并清洗酵母细胞，将清洗后的细胞置于体积比为1:2的氯仿-甲醇混合液中，并使用玻璃珠进行裂解。

加入氯仿和水以分离两相。收集有机相，干燥后将脂质薄膜溶解于氯仿中，储存备用，用于质谱分析。提取的脂质用氯仿和甲醇稀释，加入氢氧化铵及一系列内标混合物。

现在可将脂质溶液直接注入质谱仪中。大家好，我是来自康考迪亚大学生物学系Vladimir Teco实验室的Simon Bork。今天我将向大家展示一种利用质谱法对酵母脂质进行定量分析的方法。

我们在实验室中采用此方法研究酵母在不同生长条件下脂质的变化。现在开始操作。首先，将先前制备的冷冻酵母菌团块重悬于1.6毫升冰上预冷的蒸馏水中，然后将1.6毫升细胞悬液转移至高速玻璃离心管中。

请注意，在整个操作过程中，所有对提取脂质的处理均需使用玻璃移液管或注射器。由于塑料制品接触氯仿后会产生较强的背景信号，因此脂质提取应先向细胞悬液中加入6毫升氯仿-甲醇混合液（体积比为1:2）以及0.8毫升在离心管中量取的玻璃珠。只要保持氯仿、甲醇和悬浮于水中的酵母体积比为1:2:0.8，具体体积无需精确。充分涡旋振荡。

将细胞悬液与玻璃珠混合，每次一分钟，共两次；随后加入两毫升氯仿，轻轻混匀，于室温孵育五分钟，期间偶尔混匀。五分钟后，加入两毫升蒸馏水，轻轻混匀，再次于室温孵育五分钟，期间偶尔混匀。

此处同样，维持氯仿、甲醇和水的体积比为2:2:1.8比特定体积更为重要。第二次孵育完成后，在室温下以3000 × g离心5分钟，收集第一次提取的所有上清液至一个新的高速玻璃离心管中，并向剩余的细胞沉淀中加入3.2毫升氯仿，进行第二次脂质提取。

加入氯仿后，将细胞沉淀涡旋振荡两次，每次一分钟。然后在室温下以3000 ×g离心五分钟，将第二次提取的上清液加入第一次提取后收集的上清液中。接着将合并的上清液再次离心五分钟。

在室温下以3000 G离心后，提取的脂质现溶解于下层有机相中。弃去上层水相，将下层有机相转移至新的高速玻璃离心管中。为在质谱仪检测时获得更清晰的谱图，需在室温下以3000 G将有机相再次离心5分钟，并将全部上清液转移至玻璃样品瓶中。

在氮气下干燥溶解的脂质，将干燥的脂质薄膜溶于500微升氯仿中，并在负20摄氏度下保存，直至准备通过质谱分析样品。首先，按照随附书面方案中表一列出的成分，在氯仿中配制脂质的标准混合液。每种脂质代表一个不同的类别。

该溶液可在注射提取的脂质进入质谱仪之前，于零下20摄氏度保存以备后续使用。将10微升样品与10微升脂质标准混合物混合。请注意，标准品与样品的比例可根据需要进行调整。

使用配备纳米电喷雾离子源（流速为每分钟1微升）的微流质谱Q-to-F质谱仪分离样品和标准脂质混合物。相关参数设置详见随附书面方案中的表2。尽管使用高分辨率的Q-to-F质谱仪具有优势，但并非必需条件。

质谱仪的具体仪器参数会有所不同。数据采集后，对质谱图进行平滑处理、扣除背景，并对峰进行居中校正。最后，将峰列表导出至 Excel。

然后将每种脂质玻璃的峰强以其内标物进行归一化。根据具体应用，可能需要进行进一步的后处理，例如去同位素和解卷积。该方法可实现对酵母脂质组主要组分的快速深入测定。

在此，我们突出显示了一种脂质，该脂质已进行去同位素卷积处理，并归一化至其内标物。我们刚刚向您展示了如何分离酵母脂质，以及如何利用电喷雾电离质谱法测定酵母脂质。在执行该实验流程时，需注意避免使用塑料器皿，并确保样品浓度处于检测的线性范围之内。

该方法具有较强的灵活性，许多体积参数均可根据需要进行调整。此提取方案也适用于其他脂质分析方法，例如薄层色谱法和多维质谱法。以上即为全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利成功。