Name: 大鼠晶状体上皮细胞外植体的制备及文化学习终末分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: 学习大鼠晶状体上皮细胞外植体的制备与培养方法，利用FGF-2诱导终末分化，并通过免疫荧光显微镜分析基因表达与信号通路。该技术为研究晶状体发育及相关疾病提供了可靠的实验模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

晶状体上皮外植体的制备方法借鉴自John McAvoy博士实验室建立的技术9。本研究由国家眼科研究所院内研究计划（项目编号：Z01-EY000238-22）资助

第1部分：晶状体的摘除
材料与试剂：
<ol>
<li>显微解剖剪，弯曲，钝头（例如：RS-5983，Roboz Surgical Instrument Co., Inc, Gaithersburg, MD）；显微解剖镊，弯头（例如 Roboz #RS5137）。</li>
<li>悬浮培养基：含0.1%牛血清白蛋白、100单位/毫升青霉素、100μg/ml链霉素、2.5 μg/ml两性霉素B的199培养基。试剂可从Invitrogen（Carlsbad, CA）获取。</li>
</ol>
步骤：
<ol>
<li>根据美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院（National Institutes of Health）提供的指南，处死出生后2-4天的新生大鼠。</li>
<li>用手术剪剪除眼睑。用弯头镊子轻轻从眼眶两侧相对挤压，使眼球向外突出。用剪刀在眼球后部做一小切口。通过用镊子挤压切口对侧的眼球壁，可使晶状体及少量附着的玻璃体从破裂处挤出，从而可用弯头镊子夹取晶状体。操作时应注意避免破坏晶状体囊膜。</li>
<li>用弯头镊子将晶状体转移至含有5 ml温热无菌悬浮培养基的60 mm塑料培养皿中。</li>
</ol>
第2部分：外植体的显微解剖
材料与试剂：
<ol>
<li>微型解剖镊，尖端宽度0.1 mm（例如 Roboz RS-4976）。我们选用杜莫斯特合金（Dumostar alloy），因其尖端具有良好的柔韧性，但其他钢合金也可接受。不建议使用尖端薄于0.1 mm的镊子，因其在此操作过程中易发生断裂或弯曲。</li>
<li>悬浮培养基（见第1部分）</li>
<li>未添加补充物的Ham’s F12培养基或Medium 199（Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯伯格）</li>
</ol>
实验步骤：
<ol>
<li>以下步骤应在洁净、无气流的环境中进行，使用无菌解剖器械和无菌培养基。</li>
<li>在体视解剖显微镜下，用0.1 mm尖头镊子清除晶状体表面附着的组织，并将其转移至第二个含有5 ml无菌悬浮培养基的60 mm培养皿中（此步骤有助于减少污染）。随后，用镊子将所需数量的晶状体转移至一个含有5 ml无菌未添加物培养基的35 mm培养皿中。（我们通常在此步骤中使用Ham’s F12培养基（Invitrogen），因为其染料浓度较低，便于解剖操作；但Medium 199也可接受。此步骤无需添加抗生素或其他成分。）最多可在该规格培养皿中央制备12个组织块。然而，即使制备较少数量的组织块，也应使用35 mm培养皿，因为在更小的培养皿中难以操作解剖工具。将盛有剩余晶状体的培养皿转移至37°C组织培养孵育箱中，待后续使用。</li>
<li>确定晶状体的后侧。可通过多种方式识别：1）后侧比前侧更圆，前侧略扁平；2）新生大鼠晶状体在解剖过程中冷却至室温时会形成冷性白内障。若白内障尚未完全充满晶状体，则后侧为距离混浊区域最远的一侧。若混浊已充满晶状体，可将培养皿在37°C下温育数分钟以逆转白内障。当重新冷却时，白内障首先形成的一侧即为后侧。3）后侧可能可见晶状体血管膜（tunica vasculosa lentis）的残余结构。4）后侧可能可见晶状体后缝。正确识别后侧至关重要，因为晶状体囊膜的切口将在此处打开。若在前侧切开晶状体，会导致上皮层撕裂。</li>
<li>确定后侧后，将其朝上翻转，并用左手镊子夹住晶状体（适用于右利手操作者）。然后用右手镊子夹住后囊膜，使其产生一个小褶皱。</li>
<li>在用右手镊子固定后囊膜的同时，用左手镊子夹住囊膜褶皱，将两把镊子向相反方向拉动，从而在囊膜上制造一个小撕裂口。</li>
<li>用镊子夹住回缩的囊膜边缘，先在一侧向下拉动，并用镊子将其压入培养皿的塑料表面，再在另一侧重复此操作。围绕晶状体赤道部反复进行数次，直至囊膜在多个点牢固附着于培养皿底部。用左手镊子固定囊膜，同时用右手镊子轻轻摇动纤维团块，以破坏晶状体赤道部纤维细胞与上皮细胞之间的连接。然后将纤维团块推离，使其从仍附着于培养皿底部的囊膜/上皮层上滚落。对培养皿中的所有晶状体重复此过程。移除并丢弃纤维团块（或将其冷冻保存，作为其他研究中晶状体蛋白的来源）。</li>
</ol>
第3部分：中枢外植体的显微解剖与培养
材料与试剂：
<ol>
<li>无菌一次性手术刀，#15 刀片，（Cincinnati Surgical Co. Cincinnati, OH）</li>
<li>含钙和镁的无菌磷酸盐缓冲液（Invitrogen, Carlsbad, CA）</li>
<li>培养基：含有 100 ng/ml FGF-2 的悬浮培养基（Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO）</li>
</ol>
步骤：
<ol>
<li>使用无菌手术刀切除周边上皮（PE），该区域含有处于早期分化阶段的细胞（图 1A），保留一个边长约 2.0 mm 的中央方形区域，该区域仅由中央上皮细胞（CE）组成（图 1B）。</li>
<li>将含有中央外植体的培养皿转移至生物安全柜中。用含钙和镁的无菌 PBS 洗涤 3 次，再用 1 ml 新鲜、已平衡（37°C，5% CO2）的悬浮培养基洗涤 1 次。这些洗涤步骤可显著降低污染风险。</li>
<li>加入 2 mL 诱导分化培养基1，并将外植体置于 37°C、5% CO2 的湿化组织培养孵育箱中。培养时间可根据所研究的参数短至数小时，或长至两到三周。培养基应每两到三天更换一次。</li>
</ol>
第4部分：收获外植体以分析与分化相关的事件
1. 收集外植体用于蛋白质或RNA分析 
	材料：
	<ol>
 	<li>显微解剖镊</li>
	<li>SDS裂解缓冲液或RNA-later</li>
	</ol>
	实验步骤：
	<ol>
		<li>孵育期结束后，移除培养基。</li>
		<li>使用体视解剖显微镜，轻轻松动每个外植体的边缘。</li>
		<li>用镊子提起每个外植体，并转移至含有约100μl SDS裂解缓冲液（用于蛋白质分析）或RNA-later（用于RNA分析）的离心管中。将镊子尖端在溶液中轻轻搅动，以确保外植体已脱离镊子。</li>
	</ol>
2. 用于免疫荧光的外植体收获
材料与试剂：
	<ol>
		<li>含钙和镁的磷酸盐缓冲液（Invitrogen，Carlsbad，CA）</li>
		<li>不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（Invitrogen，Carlsbad，CA）</li>
		<li>4% 多聚甲醛（Boston Bioproducts，Worcester，MA）</li>
		<li>显微解剖镊子</li>
		<li>疏水性标记笔</li>
		<li>玻璃显微镜载玻片</li>
		<li>含0.25% Triton X-100的磷酸盐缓冲液</li>
	</ol>
	实验步骤：
	<ol>
	<li>用含有钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）短暂冲洗组织块。</li>
	<li>加入4%多聚甲醛，在室温下固定组织30分钟。</li>
	<li>移除固定液，更换为磷酸盐缓冲液。固定后的组织块会略微变硬，便于将其提起并转移至玻片上进行免疫染色。</li>
	<li>在玻片上滴加少量不含钙和镁的PBS，以帮助定位组织并防止卷曲。使用显微解剖镊子将组织块提起，并将其置入玻片上的液滴中。在不接触组织块的情况下，用滤纸小心吸去液体，使组织块在玻片上展平，然后在室温下空气中干燥3至5分钟。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="荧光显微镜膜结构、横截面示意图、细胞研究比较" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1 A. 外周上皮表达分化特异性蛋白。所示的组织块在显微解剖后立即进行N-钙黏蛋白免疫染色。在外周上皮的一条细胞带中可见表达，表明该区域的细胞已开始分化。B. 可将外周上皮修剪去除，以清除表达N-钙黏蛋白及其他分化特异性蛋白的细胞。红色环形代表表达N-钙黏蛋白的细胞所在位置，而灰色轮廓的小方块代表图1A中所示的上皮象限。通过四次手术刀切割可去除外周上皮，留下一个仅包含尚未开始分化细胞的中央方块。

<ol><li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li>
<li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li>
<li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+major+intrinsic+protein+%28MIP%29%2Faquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li>
<li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+%28ERK1%2F2%29+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li>
<li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li>
<li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6%2C+c-Maf%2C+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li>
<li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li>
</ol>

大鼠晶状体外植体系统已被多家实验室成功用于研究晶状体上皮细胞向晶状体纤维终末分化的过程21,3,4,5。当暴露于100 ng/ml的FGF-2时，外植体在数分钟内即开始出现信号通路的变化6，形态学改变和基因表达变化则在随后的数天内依次出现3,4,5。若注意防止污染，培养物可保持活力达2-3周。
本方案中所述的中央外植体特别适用于研究与分化相关的事件序列，因为在外植体中，在添加 FGF-2 之前几乎不含或完全不含表达分化标志物的细胞1,5。随后，细胞会以群体同步分化，从而可追踪与分化相关的信号转导和转录事件的时间进程。因此，将外植体培养不同时间长度，可提供关于事件序列的精确时间信息。可在培养基中加入特异性抑制剂，以鉴定相关信号通路。外植体可用于通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析蛋白质表达，或通过 RT-PCR 分析特定 mRNA 的表达。每个外植体的蛋白产量为 20–50 μg，RNA 产量约为 200–600 ng/外植体，具体产量取决于培养时间的长短。我们通常发现，每培养皿使用 5–6 个外植体即可为多项检测提供足够的蛋白或 RNA。外植体提取的 RNA 还可用于制备 cDNA，进而通过基因芯片分析评估基因表达，从而识别可能对分化至关重要的新基因。外植体也可进行转染。尽管转染效率通常较低，但足以用于报告基因的检测4;7;8。对外植体进行免疫荧光显微镜观察，可确定目的蛋白的亚细胞定位，是对生化方法的有力补充。因此，大鼠晶状体外植体的制备与培养为研究哺乳动物晶状体终末分化提供了一个强大的体系，可与体内技术（如转基因小鼠和基因敲除小鼠的构建）相互补充。

大鼠晶状体上皮外植体的制备与培养用于终末分化研究

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

晶状体前表面由单层上皮细胞覆盖，这些细胞在睫状体下方的环形区域增殖。分裂后，这些细胞向后迁移，视网膜扩散的成纤维细胞生长因子（FGF）诱导其分化为一排排伸长的晶状体纤维细胞，后者构成了晶状体的主体部分。在体外，可通过将晶状体前上皮中央区域的组织外植体置于含FGF-2的培养环境中，诱导晶状体上皮细胞向晶状体纤维细胞分化。外植体取自新生大鼠晶状体：首先将晶状体从眼球中取出，用解剖镊夹住晶状体后部的囊膜，轻轻撕开后囊膜，并将其压入组织培养皿的塑料底部。随后用手术刀去除外植体的周边区域，将中央区域置于含100 ng/ml FGF-2的培养条件下培养，培养时间可持续2至3周，具体时长取决于研究参数。由于培养中外植体的上皮细胞在数天至数周内近似同步地分化，因此可利用分子生物学、生物化学及药理学技术测定信号传导和基因表达的时间进程。免疫荧光显微镜技术是这些方法的有力补充，因其可显示目的蛋白的亚细胞定位，并揭示信号通路实验干预后的生理效应。

在含有 FGF-2 的培养条件下，大鼠晶状体上皮中央区域的外植体可同步分化。对这类培养物进行免疫荧光显微镜观察，可提供有关终末分化过程中基因表达和信号事件的新信息。

晶状体前表面由单层上皮细胞覆盖，这些细胞在睫状体下方的环形区域增殖。

该操作首先取出两到四日龄大鼠的晶状体，并清除其上附着的任何组织。确定晶状体的后侧面，在囊膜上制造一个小的撕裂口。然后将囊膜向下剥离并压入培养皿底部。此操作需围绕整个晶状体重复进行。通过左右摇动将晶状体纤维组织移除。切除周边的上皮组织，然后进行培养。最后，将它们转移至试管中进行生化分析，或置于玻片上进行显微镜观察。大家好，我是美国国立卫生研究院国家眼科研究所分子与发育生物学实验室的Peggy Lanka。大家好，我是Al Tu，同样来自国家眼科研究所分子与发育生物学实验室。我是来自NEI同一实验室的Chung Ga。今天我们将向您展示一种从新生大鼠中分离并培养晶状体上皮细胞的实验方法。我们将演示如何去除上皮细胞的周边区域，该区域含有处于早期分化阶段的细胞。然后，我们将向您展示如何通过将剩余的中央晶状体上皮细胞暴露于成纤维细胞生长因子（FGF）中，诱导其分化形成晶状体纤维。我们在实验室中采用此方法研究终末分化过程中相关事件的时间调控。在向培养基中添加FGF后的不同时间点，采集EXPLAN样本。然后，我们通过蛋白质印迹法分析蛋白质表达，通过逆转录-聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）或微阵列分析RNA表达，并对眼晶状体进行免疫染色以确定目标蛋白质的亚细胞定位。现在，我们开始从新生大鼠中分离晶状体。首先，使用显微解剖剪在已处死的2至4日龄大鼠眼球上做一小段后部切口，同时按压对侧，从而将晶状体取出。使用尖端为0.1毫米的镊子将晶状体转移至含有5毫升温热无菌悬浮培养基的60毫米塑料培养皿中。清除晶状体上附着的组织，然后将其转移至第二个含有5毫升无菌悬浮培养基的60毫米培养皿中。这有助于减少镊子带来的污染。将所需数量的晶状体转移至含有两毫升无菌未补充培养基的35毫米培养皿中。在此规格培养皿的中央最多可制备12个X explant。任何多余的晶状体可暂存于之前准备的第二个60毫米培养皿中，并置于37摄氏度的组织培养孵育箱内，最多可保存一小时，待后续用于制备X explant。现在辨认晶状体的后侧面。我可以判断这两个晶状体是前侧朝上的。我将把晶状体侧立起来，以便您能从上方观察，此时可以看到中心区域的冷性白内障，即中央的不透明区域。距离不透明中心最远的一侧为后侧。因此，我将其翻转至后侧。在后侧，还可以看到这些条纹状结构，它们是脉络膜血管炎的残留痕迹。这是一种位于晶状体周边部的血管模式，同时也标记了晶状体的后表面。正确。准确识别至关重要，因为此处将进行囊膜切开。若在晶状体前表面进行切开，会导致上皮层撕裂。识别后侧的方法有多种。首先，后侧比前侧更圆，而前侧略扁平。其次，新生大鼠晶状体在解剖过程中冷却至室温时会形成冷白内障。如果冷白内障尚未完全充满晶状体，则后侧为距离混浊区域最远的一侧。如果混浊已充满晶状体，将培养皿加热至37摄氏度数分钟即可逆转该现象。当冷却时白内障重新形成，可据此识别后侧。第三，血管膜残余物可能在后侧可见。最后，后部缝合线也可能在后侧显现。确定后侧后，将其朝上翻转，并用左手镊子支撑晶状体。然后用右手镊子夹住后囊膜并形成一个小褶皱，同时用右手镊子固定后囊膜，用左手镊子抓住囊膜褶皱，将两把镊子向相反方向拉动，使囊膜产生一个小裂口。在用镊子夹住回缩囊膜边缘时，先在一侧将其向下牵拉，然后在另一侧重复操作，并用镊子将其压入培养皿的塑料表面。重复此操作数次，沿晶状体赤道部移动一周，直至囊膜牢固地附着于培养板上。在多个位置，用左手镊子固定囊膜，用右手镊子轻轻摇动纤维团块，以破坏晶状体赤道部纤维细胞与上皮细胞之间的连接。现在轻轻将纤维团从仍附着在培养皿底部的囊膜上卷起并分离。对培养皿中的所有晶状体重复此操作。纤维团可丢弃，也可冷冻保存，作为其他研究中通过显微解剖分离完整上皮外植体获取晶状体蛋白的来源。让我们观察中央角膜上皮组织的显微解剖与培养。使用无菌手术刀切除周边上皮组织，该区域含有处于早期分化阶段的细胞，保留一个中央区域，呈边长约两毫米的方形，由中央角膜上皮细胞构成。仅将含有中心外植体的培养皿转移至生物安全柜中。用无菌 PBS 清洗茄子三次，再用一毫升新鲜平衡悬浮培养基清洗一次。接着，加入两毫升培养基以诱导分化，并将外植体置于湿润的组织培养孵育箱中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养。培养时间可能短至数小时，也可能长达两到三周，具体取决于所研究的参数。应每隔两到三天更换一次培养基，并进行显微解剖和图灵完备操作。现在开始收获外植体用于分析。孵育结束后，使用显微解剖镊子移除培养基。轻轻松动每个外植体的边缘。用镊子夹住每个外植体，转移至含有约 100 µL SDS 裂解缓冲液（用于蛋白质分析）或 RNA later（用于 RNA 分析）的离心管中，轻轻搅动镊子尖端，确保外植体完全脱离镊子并进入溶液。外植体现在可用于蛋白质或RNA的分析，外植体也可通过免疫荧光进行分析。首先，用PBS短暂冲洗外植体。加入4%多聚甲醛固定组织，作用30分钟。在室温下，移除固定液并用 PBS 替代。固定后的外植体会变得略微僵硬，便于将其提起并转移至玻片上进行免疫染色。在玻片上滴加少量不含钙和镁的 PBS，以帮助定位组织并防止卷曲。使用显微解剖镊子将外植体提起，并将其放入玻片上的液滴中，注意不要触碰外植体。然后小心地用滤纸条吸去多余液体，并将外植体在玻片上展平。将组织在室温下空气中干燥三到五分钟。此时植入物已准备好进行免疫荧光分析。图中显示的是一个显微切割的完整上皮外植体示例，已对NCO进行免疫染色，NCO是细胞的一种标志物。在分化的早期阶段，只有上皮周边区域的细胞对该蛋白呈阳性染色，而中央区域则被切除。如本方案所述，保留的周边上皮组织形成一个中央去核区，其中几乎不含或完全不含表达“and coherent”的细胞。通过蛋白质印迹（western blotting）检测中央和周边上皮组织中的“and coherent”表达水平，同时对GA.DH进行蛋白质印迹分析，以确认各蛋白样品上样量均一。通过将中央外植体在不同时间段进行培养，可以确定与分化相关事件的时间进程。将中央外植体在含有或不含100 纳克/毫升 FGF 的培养基中分别培养 2、5、24 和 48 小时。在指定时间点收集 X 外植体，并转移至 SDS 样品缓冲液中，用于蛋白质印迹分析。结果显示，在培养 24 至 48 小时后，目标蛋白的表达被有效诱导。通过 GA DH 的蛋白质印迹检测证实，各蛋白样品的上样量均一致。在无或含有100纳克/毫升FGF的条件下培养四天后，对中枢外植体进行免疫染色显示，经FGF处理的外植体中N-钙黏蛋白免疫荧光显著增强。免疫荧光还显示N-钙黏蛋白在细胞间边界处的亚细胞定位。我们刚刚向您展示了如何培养晶状体上皮细胞以研究其分化过程。该系统的主要优势在于细胞能够同步分化，这使得确定事件发生的顺序成为可能。此外，我们可以在培养基中添加特定的生长因子或抑制剂，以激活或阻断特定的信号通路。进行该操作时，重要的是要注意防止污染，应在洁净的环境中进行解剖并使用无菌培养基，且在培养前需彻底观察外植体。以上就是全部内容。感谢观看。祝您的实验顺利。再见。再见。

preparation-culture-rat-lens-epithelial-explants-for-studying

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

大鼠晶状体上皮细胞外植体的制备及文化学习终末分化

由干细胞衍生的视网膜色素上皮（RPE）细胞可用于多种应用，包括针对视网膜变性的细胞治疗、疾病建模以及药物研究。本文介绍一种简单且可重复地从干细胞分化获得RPE细胞的实验方案。...

高效诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞

血管生成涉及多种细胞和多系统的相互作用，需要在生理相关的环境中进行研究。本研究的目的是展示大鼠肠系膜培养模型在血管生成过程中对完整的微血管网络进行延时比较的能力。...

一个 离体 延时成像培养大鼠肠系膜微血管网络的方法

我们描述了一种构建视网膜组织的方法，该组织由人多能干细胞分化而来的视网膜色素上皮细胞组成，并将其培养于人羊膜上，进而制备用于动物模型移植的移植物。...

由人胚胎干细胞衍生的适用于移植的视网膜色素上皮组织的构建

我们提出一种体外模型，用于评估嗅鞘施万细胞（OEG）在神经损伤后的神经再生能力。该模型基于将成年视网膜神经节细胞（RGN）的轴突切断后，与OEG单层细胞共培养，并通过分析RGN轴突及胞体-树突标志物，进而研究轴突再生情况。...

轴突切断的大鼠视网膜神经节细胞与嗅鞘施万细胞共培养，作为成年神经元轴突再生的体外模型

该方案描述了小鼠器官型外植体的制备方法 神经视网膜，与视网膜色素上皮（RPE）共同培养于R16定义培养基中，该培养基不含血清和抗生素。与传统方法相比，该方法操作相对简便、成本较低且耗时较少。 体内...

长期无血清培养具有完整视网膜色素上皮的小鼠视网膜组织外植体

本研究旨在开发一种新型的人类类器官视网膜培养（HORC）模型，以防止在移植体操作过程中破坏视网膜的完整性。该目标通过将视网膜与其上方的玻璃体以及下方的视网膜色素 上皮-脉络膜（RPE-脉络膜）和巩膜共同培养来实现。...

一种新型人类类器官视网膜培养技术的表征

本方案最初由 Fernandez-Godino 等人于 2016 年报道1，描述了一种高效分离和培养小鼠 RPE 细胞的方法，这些细胞在 Transwell 培养板上一周内即可形成具有功能性和极性的 RPE 单层。该操作过程约需 3...

高效分离与原代培养小鼠视网膜色素上皮细胞

本方案介绍并描述了从成年小鼠获取的视网膜外植体的分离、解剖、培养和染色步骤。该方法作为一种离体（ex...

成年小鼠视网膜外植体作为 离体 研究视网膜神经血管疾病的模型

本手稿概述了一种详细的视频实验方案，用于原代晶状体上皮细胞（LECs）的培养，旨在提高实验可重复性，并促进白内障及后囊膜混浊（PCO）相关研究。本文提供了晶状体解剖、LECs分离与鉴定的分步操作指南，尤其为该领域的新手研究人员提供了有价值的参考。...

优化小鼠原代晶状体上皮细胞培养：胰蛋白酶消化的综合指南

我们通过角膜上皮刮除联合角膜缝线的方法建立了一种大鼠严重角膜炎症模型。该研究评估了角膜炎症模式、上皮细胞增殖以及炎症条件下角膜缘干细胞的变化。...

基于角膜上皮刮除联合角膜缝线建立大鼠重度角膜炎模型

本方案详细描述了小鼠眼晶状体上皮细胞与纤维细胞大量组织的分离步骤，随后进行RNA提取及qPCR分析。该方法可实现晶状体不同细胞区室的分离，从而更深入地分析上皮细胞与已分化的纤维细胞在转录组及生物学过程中的差异。...

从小鼠眼晶状体上皮和纤维细胞团块中分离RNA

学习大鼠晶状体上皮细胞外植体的制备与培养方法，利用FGF-2诱导终末分化，并通过免疫荧光显微镜分析基因表达与信号通路。该技术为研究晶状体发育及相关疾病提供了可靠的实验模型。

大鼠晶状体上皮外植体的制备与培养用于终末分化研究

探索更多视频