特定细胞群的净化荧光激活细胞分选（FACS）
2010年7月10日
许多科学研究需要的细胞群的生物和化学分析，细胞必须在高纯度的状态。荧光激活细胞分选（FACS）是一种高级的方法，在其中获得纯的细胞群。
您好，我是威斯康星州血液中心血液研究所流式细胞术专家的 Hope Campbell。大家好，我是 STR Baso，Bonnie Dieter 博士实验室的研究生。我也在威斯康星州血液中心的血液研究所工作。
今天，我们将进行一个程序，使用荧光激活细胞分选来分离细胞。我们在实验室中使用该程序来研究淋巴细胞和骨髓细胞群的功能。让我们开始吧。
在这个程序中，B 和 CD 将从小鼠细胞中纯化四个 T 细胞。应根据所需的细胞数和使用该方法的机器的回收率来计算目标细胞的起始数量。B 细胞和 CD 4 T 细胞的典型恢复率为 85% 至 90%起始 SP 细胞群约为 60% 至 70% B 细胞和 20% 至 30% T 细胞。
因此，如果您从 100 乘以 10 到 6 个细胞开始，您将能够在开始事实之前恢复 50 到 6000 万个 B 细胞和 20 到 3000 万个 T 细胞。该方案所需的溶液和试剂应置于冰上。这些包括由磷酸盐缓冲盐水和 3% 胎牛血清组成的染色缓冲液，悬浮缓冲液由在 Hank 平衡盐溶液中制备的 25 毫摩尔 HEP 组成，或含有 3% 胎牛血清 A 的 HBSS、在胎牛血清中制备的 25 毫摩尔 Hep B 溶液、染色抗体和补偿珠。
该方案还需要以下耗材和试剂。15 毫升锥形管、12 x 75 毫米聚苯乙烯或聚丙烯流流管。还应提前准备尼龙细胞过滤器 trien blue 和血细胞计数器分选收集管以执行此作。
在 300 微升 HE's FCS 溶液流管中，或将 1 毫升 HEPs FFC S 溶液流向 15 毫升锥形管中。这些应放在冰上，直到收集过程开始。首先生成所需细胞群的单细胞悬液。
如果分离出细胞，则使用此程序进行培养。整个细胞制备应在组织培养罩中进行。使用无菌技术洗涤细胞一次，加入冰冷染色缓冲液，然后倒置试管数次，使细胞悬浮。
然后将细胞在约 250 GS 4 摄氏度下离心 7 到 8 分钟。洗涤条件可能因细胞类型和浓度而异。对于细胞，用 10 毫升染色缓冲液洗涤 6 个细胞 10 次，最多 200 次。
通过抽吸小心地去除上清液，使细胞沉淀保持完整。然后将细胞重悬于冰冷的染色缓冲液中，浓度高达 10 倍/100 μL 的 10 倍至 6 倍。通过轻弹或轻轻涡旋试管来重悬细胞沉淀。
然后将 6 个细胞中的 0.25 到 10 倍转移到冰上新的 12 x 75 毫米聚苯乙烯或聚丙烯流管中。并将其放在一边，稍后用作第一管的未染色对照样品，向细胞悬液中加入一抗以达到所需的最终浓度。这里，PE Texas 的红色偶联抗 B 两种 20 抗体用于对 B 细胞进行染色，而 ZI 偶联的抗 TCR R β andor 700 偶联抗 CD 四种抗体用于对通过轻弹管底或光照混合的 T 细胞进行染色。
涡旋，然后将细胞置于冰上并在黑暗中孵育 20 至 30 分钟。孵育后，用 Resus 洗涤标记的细胞，小心去除上清液后，像以前一样将它们悬浮在 10 毫升冰冷的悬浮液、缓冲液和离心中。重复此步骤以第二次洗涤细胞。
最后，将细胞重悬于冰冷的悬浮缓冲液中。如果一抗未直接与氟 4 偶联，则将标记的二抗或 strep AVID 偶联到细胞悬液中，然后再次将细胞在黑暗中的冰上孵育 20 至 30 分钟。用冰冷的悬浮缓冲液洗涤细胞两次。
复苏后，将细胞悬浮在冰冷的悬浮缓冲液中。使用重要染料（如 trian blue 和 hemo cytometer）确定细胞浓度和活力。通过添加悬浮缓冲液，将细胞浓度调整为每毫升 10 至 20 倍 10 至第 6 个细胞，以避免在分离过程中可能死亡的细胞簇堵塞传真机。
作和染色。在开始分选方案之前，立即通过滴滤器过滤细胞。应根据细胞类型选择过滤器的孔径：对于细胞，使用孔径为 40 微米的过滤器。
根据体积，将过滤后的细胞收集在 15 L 锥形管或 12 x 75 mm 流管中。并将细胞放在冰上，同时设置细胞仪进行分选程序。如果使用 BD comp 珠子作为单色阳性对照，请为检测中使用的每种颜色准备一个对照管和一个未染色的阴性对照管。
彻底涡旋后，对于使用的每种颜色和阴性对照，将微珠悬浮液添加 1 个，将阴性和阳性微珠悬浮液滴入 100 微升悬浮缓冲液中。接下来，向每个阳性对照管中加入 1 μL 标记抗体。在本实验中，使用 PE Texas'Red B 制备了一根管，其中两种抗体为 20
。一种使用 fit ETCR β 抗体，另一种使用 lor 700 CD 四种抗体，通过轻弹试管底部混合，并在室温下避光孵育 15 至 30 分钟。用 2 mL 染色剂洗涤磁珠一次，缓冲并以 200 Gs 离心 10 分钟。通过抽吸去除上清液，并在 200 至 500 μL 染色中重悬微珠沉淀。
流式细胞仪的缓冲液设置因制造商而异，只能由经过适当培训的人员进行。这里的细胞分选程序将使用 BD 缺陷 aria 进行。在分选之前，请根据要分选的单元类型选择合适的喷嘴。
事实 aria 的可用尺寸为 70 微米、100 微米和 130 微米。喷嘴尺寸应至少是要对淋巴细胞进行分选的细胞大小的三倍，选择 70 微米喷嘴。可以使用仪器的无菌分选选项进行无菌细胞分选。
使用此选项，根据制造商的说明，用 70% 乙醇对整个鞘管路径进行净化。请务必更换鞘膜过滤器，并将 PBS 替换为无菌 PBS。细胞仪准备就绪后，将含有堆 FCS 的预冷收集管放入适当的收集装置中。
可用的收集装置最多可容纳两支 15 mL 锥形管。4 根 12 x 75 毫米的管子或 4 根微型管。使用 12 x 75 毫米的试管收集小于 1.5 乘以 10 至第六个细胞的样品，使用 15 毫升锥形管收集 1.5 乘以 10 至 6 至 4.5 乘以 10 至第六个细胞。
将适当的收集装置放入分选收集室中。将侧流引导到已安装的收集设备中进行多色排序。首先校准细胞仪以解决检测器之间的光谱重叠。
此处显示的示例说明了拟合 E 和 pe 的发射光谱之间的重叠。深色阴影区域中显示的这种重叠称为溢出。这里，PE 溢出将在拟合 E 通道中检测到，拟合 e 溢出将在 PE 通道中检测到。
必须校正这种溢出，以消除另一个通道中 1 层 4 层的残余荧光。校正溢出的过程称为补偿，用于执行手动补偿。使用细胞术软件设置一个模板，该模板包括一个双变量图，用于显示前向散射 FSC 和侧向散射 SSC，以及将要使用的每个通量的一个直方图。
设置这些图的方法因软件而异。将阴性对照 com 管放入细胞仪的加载端口，并在样品运行时开始采集数据。调整 FSC 和 SSC 以将感兴趣的群体置于比例上。
然后调整荧光 PMT 设置，将阴性群体或自发荧光放在直方图的最左侧部分。记录阴性对照管。从细胞仪加载端口取出阴性对照管，并用第一个阳性对照 com 管替换。
现在开始收购。对每个阳性对照管重复此过程，记录每个管的数据。对于每个阳性对照，在直方图上记录的事件周围绘制一个区间门或框。
然后在直方图的负部分绘制另一个区间门。进行手动补偿时，通过调整正值的中位数直到等于负值的中位数，来考虑实验中使用的每个荧光。要调整中位数，请调整光谱重叠值，调高或调低，直到每个荧光参数的中位数尽可能紧密匹配。
使用用阳性和阴性对照样品建立的设置，通过确定实验样品的步态设置来准备分选程序。将要分选的细胞管放入细胞仪加载端口，以每秒 9 到 10， 000 个事件的速度开始采集。选择点图以显示前向散射与侧向散射。
前向散射是像元大小的通用指标，位于 x 轴上，而侧向散射是像元粒度的指标，位于 Y 轴上。现在对感兴趣的 population 进行门控。确定门后，检查以确保细胞仪上样端口的温度设置为 4 摄氏度。
然后将实验样品管放入加载端口。按下排序选项并开始采集收集管，当它们装满时，应将其放在冰上。继续分选，直到收集到所需数量的细胞或直到样品管为空。
然后通过再次选择排序按钮停止排序，并从加载端口中删除样品。接下来，将收集管直接放在细胞仪的加载端口上，并采集 500 至 1000 个事件。使用用于 T 细胞分选的相同设置，分选程序将纯度从 21% 提高到 99%对于 B 细胞，分选后 5% 的起始 B 细胞群增加到 98%。
因此，我们刚刚向您展示了如何通过传真从细胞中纯化 b 细胞和 t 细胞群。请记住，如果可以生成单细胞悬液并且有合适的抗体可用，则可以使用事实来纯化任何细胞群。此外，带有荧光标记物的细胞在基因上堆积，无需使用抗体即可轻松纯化。
此外，请始终记住为您的实验使用适当的对照，并始终检查您的流式细胞术激光器配置，以确保您使用的是正确的荧光染料，并确保使用适当的门，以便它们正确地围绕您的细胞群。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本文讨论了使用荧光活化细胞分选（FACS）分离细胞的过程，这是获得纯净细胞群的关键方法。该程序对于研究淋巴细胞和髓系细胞功能至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 流式细胞术
- 免疫学
背景
- 细胞群的高纯度对于准确的生物学分析是必要的。
- FACS是一种广泛使用的细胞分离技术。
- 该程序涉及特定的试剂和谨慎的样品处理。
- 了解细胞类型及其功能在研究中至关重要。
研究目的
- 展示分离B和CD4 T细胞的FACS程序。
- 为该领域的研究人员提供详细的协议。
- 强调细胞纯度在科学研究中的重要性。
使用的方法
- 细胞悬液的制备和抗体染色。
- 离心和洗涤细胞以确保纯度。
- 使用流式细胞术根据荧光对细胞进行分选。
- 加入控制以获得准确的结果。
主要结果
- 成功分离出高恢复率的B和CD4 T细胞。
- 展示有效的染色和分选技术。
- 通过详细的程序步骤验证协议。
结论
- FACS是获得纯净细胞群的有效方法。
- 适当的技术和准备对于成功的结果至关重要。
- 该协议可以帮助研究人员进行各种生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enables biopharma R&D to isolate highly purified cell populations critical for target validation and mechanistic de-risking. The technique supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative, reproducible outputs for functional assays. Its ability to sort based on intracellular markers and low-abundance surface phenotypes addresses key challenges in phenotypic screening and translational biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through isolation of phenotypically defined cell subsets for functional analysis.
- Operational Value: Provides high-purity inputs that reduce biological noise in downstream assays, improving target de-risking.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating reliable data on target engagement and pathway modulation in primary cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers purified cell populations as validated biological systems for assay standardization and compound screening.
- Operational Value: Ensures reproducibility and scalability of screening platforms through consistent input material quality.
- Technical Value: Enables preparation of disease-relevant systems using intracellular staining or low-density markers not accessible via bulk methods.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by supplying mechanistically defined cell types for efficacy and safety studies.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative, sortable readouts aligned with translational biomarkers.
- Strategic Value: Enables mechanistic de-risking by isolating cells based on intracellular protein expression, such as genetically modified fluorescent reporters.
Pipeline & Workflow Integration
FACS functions as a reusable capability bridging early discovery to lead identification and preclinical workflows, particularly when high purity or intracellular targeting is required.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating specific lymphocyte and myeloid subsets for functional interrogation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, high-yield cell purification with recovery rates of 85–90% for B and CD4 T cells.
- Analytics: Provides quantitative measurements of size, granularity, and fluorescence intensity, enabling precise gating and comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via isolation of cells based on intracellular staining, supporting biomarker-aligned model systems.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, standardized platform applicable across multiple projects and cell types when appropriate antibodies and instrumentation are available.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, and reduction of mechanistic ambiguity through precise phenotypic isolation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of cell purification across R&D sites.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via high-fidelity functional data.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions grounded in purified, functionally validated cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, antibody selection, and compensation setup for accurate spectral separation.
- Dependent on flow cytometer with sorting capacity, appropriate nozzle size (e.g., 70 μm for lymphocytes), and sterile sorting capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of staining panels, gating strategies, and control usage (e.g., compensation beads, unstained controls).
- Requires adaptation across model systems based on cell size, marker density, and susceptibility to stress during sorting.
- Practical limitations include cell viability stress, clogging risk from aggregates, and the need for single-cell suspension preparation.
