Name: 特定细胞群的净化荧光激活细胞分选（FACS） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-10T18:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: 学习使用荧光激活细胞分选（FACS）技术从脾细胞中分离B细胞和CD4 T细胞的方法。该方案展示高纯度细胞群的获取流程，适用于免疫学和细胞生物学研究。

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我们感谢 Bill Cashdollar 博士在使用流式细胞术核心设施方面提供的支持。

<ol><li>开始操作前，需准备以下物品：
<ol style="list-style-type:lower-roman;">
 <li>冰</li>
 <li>用于染色细胞的 15 ml 锥形管，以及用于单色对照染色的 12 × 75 mm 流式管</li>
 <li>染色缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS）+ 3% 胎牛血清（FCS）</li>
 <li>移液器</li>
 <li>Fc 阻断剂（如需要）及染色用抗体。抗体需经滴定以确定最佳染色浓度</li>
 <li>补偿微珠</li>
 <li>悬浮缓冲液：Hank's 平衡盐溶液（HBSS）+ 25 mM HEPES + 3% FCS</li>
 <li>台盼蓝和血细胞计数板</li>
 <li>细胞筛（40 μm 尼龙）</li>
 <li>收集管：可使用两种类型的收集管 a) 12 × 75 mm 聚苯乙烯管（内含 300 μl FCS 和 25 mM HEPES）或 b) 15 ml 锥形管（内含 1 ml FCS + 25 mM HEPES）。任何富含高浓度血清的培养基均可用于收集分选后的细胞</li>
</ol></li>
<li>将起始细胞群体制备成单细胞悬液</li>
<li>可选步骤：通过补体耗竭或磁珠分选等批量纯化方法富集目标细胞群体。富集步骤的主要优势在于可缩短分选时间</li>
<li>用染色缓冲液洗涤细胞一次</li>
<li>弃去上清液，将细胞重悬于染色缓冲液中，浓度最高可达 50 × 106，以实现高效染色</li>
<li>可选步骤：对于表达高水平 FcR 的细胞，使用适当的阻断方法封闭受体。常用方法为在冰上使用可结合 FcγR 的单克隆抗体孵育 10–15 分钟。此类抗体可从商业途径获得</li>
<li>加入适当浓度的单克隆抗体（mAb）以标记目标细胞群体，在避光冰浴中孵育 20–30 分钟，随后用染色缓冲液洗涤两次。可选步骤：可加入活体染料（如碘化丙啶）进行染色以区分死细胞（5）。若进行多色染色，需设置单色对照。我们使用 BD CompBeads，按照制造商说明书制备单色对照</li>
<li>若未使用直接偶联抗体，则使用适当的二抗或链霉亲和素偶联物重复步骤 7</li>
<li>洗涤后，将细胞重悬于培养基中，并使用台盼蓝等活体染料测定细胞浓度</li>
<li>将细胞浓度调整至 15–20 × 106/ml。对于易形成细胞团簇、可能在分选过程中堵塞仪器的细胞群体，需通过滤网过滤</li>
<li>设置并优化细胞分选仪。流式细胞仪的设置因制造商而异，需由经过适当培训的人员操作。 一般建议如下：
<ol style="list-style-type:lower-roman;">
 <li>根据待分选细胞类型选择合适的喷嘴</li>
 <li>如需无菌分选，应对仪器进行灭菌处理</li>
 <li>使用微珠进行仪器质控，以确认激光正常工作且分选准确</li>
 <li>安装所需的收集装置并设置侧流</li>
 <li>查看仪器的激光器和检测器配置，以确定可使用的荧光标记（我们的 BD FACS Aria 配备三根激光器，最多可检测九种颜色）</li>
 <li>确定细胞分选仪上将使用的荧光标记后，即可进行补偿（如下所述）</li>
</ol></li>
<li>使用阴性对照样本和单阳性对照进行补偿。补偿是必要的，用于消除两个检测器之间的光谱重叠。需注意的是，补偿并非完全可靠，其效果会受到某些标记物染色亮度以及低自发荧光细胞荧光强度的影响，可能导致弱阳性与阴性群体之间分辨率不佳。 
 为获得最佳结果，实验设计应将高亮度荧光染料用于表达水平较低或染色模式未知的标记物；而对于在细胞群体间具有良好分离度且高表达的标记物，应使用由红色或紫色激光激发的二聚体荧光染料。
<ol style="list-style-type:lower-roman;">
 <li>可使用补偿微珠进行补偿，这些微珠为聚苯乙烯微粒，偶联了特异性识别小鼠、大鼠或大鼠/仓鼠 Ig 轻链（Kappa）的抗体。微珠易于染色，信号强，可方便地制备与实验样本相同荧光素的单染对照</li>
 <li>建立一个模板，包含一个双变量图以显示前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC），以及每个将使用的荧光染料对应的直方图</li>
 <li>运行阴性对照管，调节前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），使目标细胞群体位于量程范围内</li>
 <li>调节荧光 PMT 设置，使阴性群体或自发荧光位于直方图最左侧区域</li>
 <li>记录阴性对照管的数据</li>
 <li>运行单阳性对照管，并记录每管数据</li>
 <li>在直方图上阳性部分绘制区间门，另在阴性部分绘制另一区间门</li>
 <li>手动补偿通过调节阳性群体的中位数（在对数尺度上，中位数比均值更能准确反映集中趋势），使其等于阴性群体的中位数。实验中使用的每种荧光标记均需进行此操作</li>
 <li>为调节中位数，需升高或降低光谱重叠值，直至各荧光参数的中位数尽可能接近</li>
 <li>也可使用分析软件自动进行补偿。自动补偿利用补偿对照的记录数据，计算实验中所有荧光染料的代数矩阵，并用这些值减去非主色渗入主色检测器的信号贡献</li>
</ol></li>
<li>记录待分选的实验样本，并使用设门工具和子集分析方法定义目标细胞群体。
<ol style="list-style-type:lower-roman;">
 <li>建立实验模板，包含一个显示 FSC 与 SSC 的散点图，并使用设门工具（多边形、矩形、区间或象限）圈定目标细胞群体。散点图反映细胞的物理特性，不同细胞类型具有不同的散射特征</li>
 <li>确定荧光设门策略的最佳方法是使用“减去一荧光”（FMO）对照。FMO 对照管中包含实验所用的所有试剂，唯独缺少目标试剂。FMO 有助于区分弱阳性染色群体与宽泛的阴性群体</li>
 <li>利用 FMO 管记录的数据，确定实验管中设门的位置</li>
</ol></li>
<li>确定设门后，可选择这些门进行分选至外部收集管中。根据仪器配置，一次最多可同时分选四个门（或细胞群体）</li>
<li>在 4 °C 下运行实验样本管，开启偏转板，开始分选。可将 5 × 105 – 1.5 × 106 个细胞分选至 12 × 75 mm 管中，或将 1.5 × 106 – 4.5 × 106 个细胞分选至 15 ml 锥形管中</li>
<li>获得所需数量的细胞后，手动停止分选</li>
<li>进行分选后分析，以确定分选细胞群体的纯度</li>
</ol>
代表性结果
我们在此展示了小鼠脾脏 B 细胞和 CD4 T 细胞分选的结果（图 1）。脾细胞经 PE Texas Red 标记的抗小鼠 B220 抗体和 FITC 标记的抗小鼠 TCR 抗体染色&beta; 以及Alexa Fluor 700标记的抗小鼠CD4抗体以鉴定B细胞（B220+TCR&beta;-) 和 CD4 T 细胞（CD4+TCR&beta;+）。分选使用 BD FACS Aria 仪器进行。分选后 B 细胞纯度为 &gt;97%，且CD4 T细胞纯度为 &gt;98%.
<img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig1.jpg" alt="图1" /> 图1. FACS 分选后脾脏 B 细胞和 CD4 T 细胞的纯度。 小鼠脾细胞使用抗小鼠 B220、TCRβ 和 CD4 抗体进行染色。B 细胞的 FACS 分选通过 BD FACS Aria 仪器，圈选 B220+TCRβ- 细胞进行（图1A，左图，右下象限）。分选后进行分析以确定 B 细胞的纯度（图1A，右图）。x 轴显示 B220 染色，y 轴显示 TCRβ 染色。CD4 T 细胞的 FACS 分选使用相同的流式细胞仪，圈选 TCRβ+CD4+ 细胞进行（图1B，左图，右上象限）。分选后进行分析以确定 CD4 T 细胞的纯度（图1B，右图）。x 轴显示 TCRβ 染色，y 轴显示 CD4 染色。各象限中的阳性细胞百分比均已标出。

<ol><li>Herzenberg, L. A., De Rosa, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+and+the+FACS%3A+complementary+tools+for+immunobiology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies and the FACS: complementary tools for immunobiology and medicine.</a> Immunol Today. 21, 383-390 (2000).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGivan%2C+AL+%22Flow+cytometry+first+principles%22">Flow cytometry first principles</a>. , Wiley-Liss. New York. 273-273 (2001).</li>
<li>Hewitt, Z., Forsyth, N. R., Waterfall, M., Wojtacha, D., Thomson, A. J., McWhir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+single+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells.</a> Cloning Stem Cells. 8, 225-234 (2006).</li>
<li>Walker, A., Parkhill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomics.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 176-177 (2008).</li>
<li>Sorensen, T. U., Gram, G. J., Nielsen, S. D., Hansen, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safe+sorting+of+GFP-transduced+live+cells+for+subsequent+culture+using+a+modified+FACS+vantage%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Safe sorting of GFP-transduced live cells for subsequent culture using a modified FACS vantage.</a> Cytometry. 37, 284-290 (1999).</li>
<li>Diamond, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDiamond%2C+RA+%22In+living+color%3A+Protocols+in+flow+cytometry+and+cell+sorting%22">In living color: Protocols in flow cytometry and cell sorting</a>. DeMaggio, S. , Springer. Berlin. 800-800 (2000).</li>
<li>Karabinus, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+sorting+of+human+sperm%3A+MicroSort+clinical+trial+update%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric sorting of human sperm: MicroSort clinical trial update.</a> Theriogenology. 71, 74-79 (2009).</li>
<li>Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seventeen-colour+flow+cytometry%3A+unravelling+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+flow+cytometry+data%3A+a+guide+for+the+perplexed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7, 681-685 (2006).</li>
<li>Tung, J. W., Heydari, K., Tirouvanziam, R., Sahaf, B., Parks, D. R., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+flow+cytometry%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Modern flow cytometry: a practical approach.</a> Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).</li>
</ol>

FACS 是一种高度精密的技术，用于纯化目标细胞群体，可获得极高纯度（95–100%）的分选细胞。因此，该技术在需要高纯度细胞的实验中尤为重要（例如微阵列分析）。当需要根据表面标志物的弱表达水平来纯化细胞群体，或需要分离表达同一表面标志物但表达水平不同的两种或多种细胞群体时，FACS 相较于其他可用的纯化方法具有显著优势。例如，根据 CD21 和 CD23 的表达水平差异，分离边缘区 B 细胞（B220+CD21hiCD23int/low）和滤泡性 B 细胞（B220+CD21int/lowCD23hi）。FACS 的另一个日益广泛的应用是单细胞分选，可用于对单个细胞进行分析（3, 4）。FACS 还常用于分选表达遗传编码荧光蛋白的细胞，例如绿色荧光蛋白标记的蛋白（5）。若进行无菌分选，则分选后的细胞可用于培养。然而，细胞活力和得率在分选过程中可能受到影响。通过采用适合细胞类型的最适分选温度，并在收集管装满后立即进行处理，可提高细胞活力。通过使用聚丙烯收集管、将分选细胞收集于富含血清的培养基中、间歇性翻转收集管、将收集管维持在最适温度，以及对分选细胞以约 10 分钟的离心时间进行离心，可提高细胞回收率（http://cyto.mednet.ucla.edu/Protocol.htm）。
超高速分选仪的发展拓展了流式分选在临床环境中的应用可能性。FACS 的潜在临床应用包括从人血中纯化血液干细胞用于治疗目的、癌症治疗中的应用、羊膜穿刺术的替代、人类精子的分选以及早期疾病检测（6, 7）。
对于多色染色，抗体选择是一个关键步骤，荧光染料的选择需根据每种特定仪器的检测系统而定。多家公司生产细胞分选仪，其激光配置根据用户需求而有所不同。因此，在未确认兼容性的情况下，不能直接使用已发表研究中所用的完全相同的抗体。为了优化抗体选择，应考虑所检测蛋白的表达水平。通常，应使用亮度最高的荧光染料标记抗体来染色低表达的表面标志物，而高表达的表面标志物则可使用较暗的荧光染料进行染色（8）。此外，应尽可能选择其发射光谱重叠最小的抗体。在多色染色中，几乎很难选择完全无光谱重叠的荧光染料，此时需要进行补偿校正。
补偿是必要的数学方法，用于消除不同荧光染料发射光谱之间可被检测器检测到的荧光重叠。换句话说，需将一种荧光染料产生的重叠荧光信号从另一种荧光染料的发射光谱中扣除。补偿计算需要未染色对照以及每种用于多色染色的荧光染料各自的单阳性对照（9, 10）。补偿可通过细胞或微珠进行。微珠易于染色，信号强，并可简便地制备与实验样本含有相同荧光素的单染对照。当目标细胞表面蛋白表达水平较低，或初始细胞群体中目标细胞数量有限时，使用补偿微珠尤为有利。
选定抗体后，应通过滴定分析优化其活性。如果流式细胞仪配备高功率激光器，这一步骤尤为重要。使用非最佳浓度的染色抗体可能导致目标细胞群与总细胞群之间分离效果不佳。抗体浓度过高会增加非特异性抗原染色的风险。因此，抗体滴定可帮助选择出既能使阳性细胞群获得最大荧光强度，又能将背景染色降至最低的抗体浓度（8）。
荧光激活细胞分选（FACS）现已成为分离细胞亚群的标准技术。只要能够制备单细胞悬液，并有相应的抗体可用于鉴定目标细胞群体，该技术便可用于分离任何类型的细胞。当需要获得高纯度细胞群体时，FACS 是首选方法。

通过荧光激活细胞分选（facs）纯化特定细胞群体

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

实验和临床研究通常需要高度纯化的细胞群体。流式细胞荧光分选（FACS）是一种用于纯化已知表型细胞群体的首选技术。其他批量纯化方法包括平板黏附法（panning）、补体耗竭法和磁珠分离法。然而，FACS 相较于其他现有方法具有多项优势。当需要极高纯度的目标细胞群体、目标细胞群体表达极低水平的鉴定标志物，或需要根据标志物表达密度差异进行细胞分选时，FACS 是首选方法。此外，FACS 是目前唯一可用于基于细胞内染色或胞内蛋白表达（如基因修饰的荧光蛋白标记物）进行细胞分离的纯化技术。FACS 可根据细胞的大小、颗粒度和荧光特性实现单个细胞的纯化。为了纯化目标细胞，首先需使用荧光标记的单克隆抗体（mAb）对细胞进行染色，这些抗体可识别目标细胞群体表面的特异性标志物（1）。未染色细胞的阴性筛选也是可行的。FACS 纯化需要配备分选功能的流式细胞仪及相应的软件支持。在 FACS 过程中，悬浮细胞以液滴流的形式通过激光束，每个液滴通常包含单个细胞。荧光检测系统根据预先设定的细胞荧光参数识别目标细胞。仪器对含有目标细胞的液滴施加电荷，随后通过静电偏转系统将带电液滴引导至相应的收集管中（2）。染色及分选的成功在很大程度上取决于鉴定标志物的选择以及单克隆抗体的选用。分选参数可根据对纯度和得率的要求进行调整。尽管 FACS 需要专用设备和专业人员培训，但它仍是获得高度纯化细胞群体的首选方法。

对于需要对细胞群体进行生物学和化学分析的许多科学研究而言，细胞必须具有高纯度。荧光激活细胞分选（FACS）是获取高纯度细胞群体的优越方法。

通过荧光激活细胞分选（FACS）纯化特定细胞群体

实验和临床研究通常需要高纯度的细胞群体。FACS 是分离已知……的细胞群体的首选技术。

您好，我是 Hope Campbell，来自威斯康星州血中心血液研究所的流式细胞术专家。您好，我是 STR Baso，Bonnie Dieter 博士实验室的研究生。我也在威斯康星州血中心血液研究所工作。今天我们将进行使用荧光激活细胞分选技术来分离细胞的操作。我们在实验室中使用该技术来研究淋巴细胞和髓系细胞群体的功能。让我们开始吧。在此实验中，将从小鼠脾细胞中纯化B细胞和CD4+ T细胞。起始靶细胞数量应根据所需细胞数量以及使用该方法时分选仪的回收率进行计算。B细胞和CD4+ T细胞的典型回收率为85%至90%。起始脾细胞群体中，B细胞约占60%至70%，T细胞约占20%至30%。因此，如果起始细胞数为一亿个，则在开始分选前可获得5000万至6000万个B细胞以及2000万至3000万个T细胞。实验所需溶液与试剂应置于冰上。这些溶液包括含3%胎牛血清的磷酸盐缓冲液、以Hank's平衡盐溶液（HBSS）配制的含3%胎牛血清的25毫摩尔HEPES悬浮缓冲液、以胎牛血清配制的25毫摩尔HEPES-B溶液、染色抗体以及补偿微珠。本方案还需要以下耗材和试剂：15 毫升锥形管、12 × 75 毫米聚苯乙烯或聚丙烯流式管。此外，还应提前准备好尼龙细胞滤网、台盼蓝和血细胞计数板以及分选收集管。向流式管中加入300微升的he's FCS溶液，或向15毫升锥形管中加入1毫升的HEPs FFC S溶液。这些溶液应在收集过程开始前置于冰上。首先制备所需细胞群体的单细胞悬液。若使用本实验步骤分离的细胞将进行培养，则整个细胞制备过程应在组织培养超净台中进行。采用无菌技术，加入预冷的染色缓冲液洗涤细胞一次，并通过反复倒置试管数次使细胞重悬。然后在4°C条件下，以约250 × g离心细胞7至8分钟。洗涤条件可能因细胞类型和浓度而异。对于细胞，用10毫升染色缓冲液洗涤最多200 × 10⁶个细胞。小心地吸去上清液，确保细胞沉淀保持完整。然后将细胞重悬于预冷的染色缓冲液中，浓度最高为每100微升含50 × 10⁶个细胞。通过轻弹管壁或轻轻涡旋振荡使细胞沉淀充分重悬。然后将0.25至1×10⁶个细胞转移至一个新的12×75毫米的聚苯乙烯或聚丙烯流式管中，置于冰上。将此管留作后续使用的未染色对照样本。向第一管中加入一抗抗体，使细胞悬液达到所需的终浓度。此处使用PE-Texas Red标记的抗B220抗体对B细胞进行染色，同时使用ZI标记的抗TCRβ抗体和/或700标记的抗CD4抗体对T细胞进行染色，通过轻弹管底或轻微涡旋混匀。涡旋后将细胞置于冰上，在避光条件下孵育20至30分钟。孵育结束后，通过重悬洗涤标记的细胞，将其悬浮于10 mL预冷的悬浮缓冲液中，并按前述方法离心。小心弃去上清液后，重复此步骤再次洗涤细胞一次。最后，将细胞重悬于预冷的悬浮缓冲液中。如果一抗未直接偶联荧光染料，则向细胞悬液中加入标记的二抗或偶联染料的链霉亲和素（strep AVID），再次于冰上避光孵育20至30分钟。孵育结束后，用预冷的悬浮缓冲液洗涤细胞两次。将细胞重悬于预冷的悬浮缓冲液后，使用台盼蓝等活体染料和血细胞计数板测定细胞浓度和活力。通过添加悬浮缓冲液将细胞浓度调整至每毫升10至20×10⁶个细胞，以避免因分离过程中死亡细胞形成的团块堵塞分选仪器。实验步骤与染色。在开始分选方案之前，立即通过滴滤筛网过滤细胞。筛网的孔径应根据细胞类型选择，对于大多数细胞，使用孔径为 40 µm 的筛网。根据体积，将过滤后的细胞收集到一个15升的锥形管或12 × 75毫米的流式管中。在设置细胞分选仪进行分选操作时，将细胞置于冰上。如果使用BD补偿微珠作为单色阳性对照，则需为实验中使用的每种荧光染料各准备一管对照样本，并额外准备一管未染色的阴性对照管。充分涡旋振荡磁珠悬液后，将阴性与阳性磁珠悬液分别各取一滴，加入到每种颜色及阴性对照所用的100微升悬浮缓冲液中。接着，向每个阳性对照管中加入1微升标记抗体。本实验中，使用PE Texas'Red B二20抗体制备一个试管。一份使用fit ETCR beta抗体，另一份使用lor 700 CD四抗体，通过轻轻弹击管底混匀，在室温避光条件下孵育15至30分钟。用两毫升染色缓冲液洗涤磁珠一次，以200 ×g离心10分钟。用抽吸法去除上清液，将磁珠沉淀重悬于200至500微升染色缓冲液中。流式细胞仪的缓冲液设置因制造商而异，应仅由经过适当培训的人员操作。此处的细胞分选步骤将使用 BD defects aria 完成。分选前，应根据待分选的细胞类型选择合适的喷嘴。可选的分选孔径尺寸为 70 微米、100 微米和 130 微米。喷嘴尺寸应至少为待分选细胞大小的三倍；对于淋巴细胞，选择 70 微米的喷嘴。可使用仪器的无菌分选选项进行无菌细胞分选。使用此选项时，应根据制造商的说明，用70%乙醇对整个鞘液管路进行去污染处理。务必更换鞘液过滤器，并将PBS替换为无菌PBS。流式细胞仪准备就绪后，将预冷的收集管（内含大量FCS）放入相应的收集装置中。现有的收集装置最多可容纳两个15毫升的锥形管、四个12毫米×75毫米的试管或四个微量离心管。收集少于1.5×10⁶个细胞时使用12毫米×75毫米试管，收集1.5×10⁶至4.5×10⁶个细胞时使用15毫升锥形管。将合适的收集装置放入分选收集室中。对于多色分选，将侧流引导至已安装的收集装置。细胞仪需首先进行校准，以校正检测器之间的光谱重叠。此处所示示例说明了 fit E 与 PE 发射光谱之间的重叠。深色阴影区域所示的这种重叠称为溢出（spillover）。在此情况下，PE 的溢出信号会被检测到 fit E 通道中，而 fit E 的溢出信号则会被检测到 PE 通道中。必须校正这种溢出，以消除某一荧光通道在另一通道中的残余荧光信号。对溢出进行校正的过程称为补偿，可用来进行手动补偿。使用流式细胞术软件设置一个模板，该模板包含一个双变量图用于显示前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），以及为将要使用的每种荧光染料各设置一个直方图。建立这些图谱的方法因软件而异。将阴性对照管放入流式细胞仪的上样口，并在样本运行时开始采集数据。调节FSC和SSC，使目标细胞群位于量程范围内。然后调整荧光PMT设置，使阴性细胞群或自发荧光位于直方图最左侧区域。记录阴性对照管。将阴性对照管从流式细胞仪进样口取出，并替换为第一根阳性对照样品管。现在开始采集。对每个阳性对照管重复此过程，并记录每个管的数据。针对每个阳性对照，在直方图上记录的事件周围绘制一个区间门控或方框。然后在直方图的阴性区域绘制另一个区间门。进行手动补偿时，需考虑实验中使用的每种荧光素，通过调整阳性群体的中位值，使其与阴性群体的中位值相等。为调整中位值，应调节光谱重叠值，将其调高或调低，直至每种荧光参数的中位值尽可能接近匹配。根据阳性对照和阴性对照样本确定的设置，通过确定实验样本的门控设置，准备分选程序。将待分选的细胞管放入流式细胞仪的上样口，以每秒9,000至10,000个事件的速度开始采集数据。选择点图以显示前向散射光与侧向散射光的关系。前向散射是细胞大小的一般性指标，显示在x轴上，而侧向散射是细胞颗粒度的指标，显示在y轴上。现在圈选目标细胞群体。确定门控范围后，检查流式细胞仪上样口的温度是否已设置为4°C。然后将实验样本管放入上样孔中。按下分选选项并开始采集，收集管应在装满后立即置于冰上。持续分选，直至收集到目标数量的细胞，或直至样本管排空为止。然后再次选择分选按钮以停止分选，并从上样口取出样本。接着，将收集管直接放置在流式细胞仪的上样口，采集 500 至 1000 个事件。使用与 T 细胞分选相同的设置，分选后纯度从 21% 提高至 99%；对于 B 细胞，分选前起始 B 细胞群体为 5%，分选后提升至 98%。我们刚刚向您展示了如何通过流式细胞术从单核细胞中纯化B细胞和T细胞群体。请记住，只要能够制备单细胞悬液并拥有合适的抗体，流式细胞术即可用于纯化任何细胞群体。此外，带有荧光标记的基因工程细胞无需使用抗体即可轻松实现纯化。此外，请务必为实验设置适当的对照，始终检查流式细胞仪的激光配置，确保使用正确的荧光染料，并设置合适的圈门，使其准确围绕目标细胞群。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

特定细胞群的净化荧光激活细胞分选（FACS）

本文展示了一种从植物材料中分离特定细胞类型的实验方法。该技术利用在特定细胞类型中表达荧光蛋白的转基因标记品系，结合细胞解离和荧光激活细胞分选技术进行细胞分离。此外，本文还建立了一种生长体系，便于在细胞分选前对Arabidopsis...

植物原生质体的荧光激活细胞分选

癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过促进细胞增殖、血管生成和炎症的信号通路，促进肿瘤的发生、生长和进展。本文介绍一种利用细胞分选技术，以PDGFRα作为表面标志物，从新鲜的小鼠和人类组织中分离出纯化的正常成纤维细胞和CAFs群体的方法。...

通过荧光激活细胞分选（FACS）从新鲜组织中分离正常成纤维细胞和癌相关成纤维细胞

本实验方案的目的是利用荧光激活细胞分选（FACS）技术分选出特定类型的神经细胞，以便后续分析细胞类型特异性的基因表达、表观遗传标记和/或蛋白质表达。...

利用荧光激活细胞分选技术分析大鼠脑组织中特定细胞类型的基因表达

成纤维细胞的行为涉及一系列临床疾病实体，但由于其内在的异质性，这些行为仍缺乏充分表征。传统的成纤维细胞研究依赖于体外（in vitro）操作，掩盖了其在体（in...

通过FACS分离小鼠皮肤成纤维细胞

本方案描述了去硫代生物素、链霉亲和素和APTES系统的可定制化表面功能化方法，以分离特定的目标细胞类型。此外，本文还涵盖了该方法的应用、优化及验证过程。...

一种通过玻璃表面功能化实现靶向细胞分离的方法

淋巴细胞是适应性免疫应答中的主要效应细胞。本文介绍一种淋巴细胞纯化方案，用于研究目标分子在淋巴细胞活化过程中的生理功能。 体外 和...

小鼠淋巴细胞的分离与活化

我们报道了一种利用荧光激活细胞分选技术从易患狼疮小鼠的骨髓中高纯度分离浆细胞样树突状细胞（pDC）的方案，用于pDC的功能研究。...

利用荧光激活细胞分选法从鼠骨髓中纯化浆细胞样树突状细胞

数百万人患有导致不可逆失明的视网膜退行性疾病。这些疾病的一个共同特征是视网膜神经节细胞（RGCs）的丧失。本详细实验方案描述了通过流式细胞术结合阳性与阴性筛选方法分离原代小鼠RGCs的技术。...

通过流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）

珊瑚能够形成生物多样性丰富的生态系统，对人类和海洋生物都具有重要意义。然而，目前我们对许多珊瑚细胞的全部潜能和功能仍缺乏充分理解。本文介绍了一种用于分离、标记和分选石珊瑚细胞群体的实验方案。...

利用荧光激活细胞分选技术分离石珊瑚细胞群体

在此，我们介绍一种用于表征巨核细胞分化的免疫表型分析策略，并展示该策略如何利用荧光激活细胞分选仪对处于不同发育阶段的巨核细胞进行分选。该方法可应用于人类原代组织，也可用于体外培养生成的巨核细胞 体外.

从人类原代来源或分化样本中对人巨核细胞进行免疫表型分析和细胞分选 体外 来自造血祖细胞

学习使用荧光激活细胞分选（FACS）技术从脾细胞中分离B细胞和CD4 T细胞的方法。该方案展示高纯度细胞群的获取流程，适用于免疫学和细胞生物学研究。

通过荧光激活细胞分选（FACS）纯化特定细胞群体

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