引物延伸捕获：从高度降解的DNA样本中靶向获取序列

本视频介绍了引物延伸捕获（primer extension capture，PECA）技术，该技术能够从拷贝数极低且高度断裂的DNA样本中靶向获取特定DNA序列。我们已利用该技术对距今超过40,000年的尼安德特人骨骼中的完整线粒体基因组进行测序。该方法还可用于从多个个体中捕获任意小型靶区域或单核苷酸多态性位点。该实验流程的主要步骤包括：对初始DNA文库进行PCR扩增，通过定量PCR对扩增后的文库进行定量，对扩增文库进行靶向初级延伸，利用珠粒捕获初级延伸产物以去除非靶片段，以及对捕获并洗涤后的靶标进行洗脱和测序。

您好，我是来自莱比锡马克斯·普朗克进化人类学研究所遗传学系Shanti Payable实验室的Adrian Briggs。今天我们将向您展示一种从高度降解的复杂DNA来源（例如古代骨骼）中分离特定目标DNA序列的方法。我们已使用该方法研究尼安德特人（Homo neanderthalensis）的线粒体遗传多样性。

让我们开始。本实验所用的DNA来自距今4万至7万年的尼安德特人骨骼，这些骨骼发现于尼安德特人地理分布范围内的多个遗址。首先，将骨骼在紫外光下照射过夜，以去除表面可能存在的外源性DNA污染。

使用精细钻头制备100至500毫克的骨粉。从骨粉中提取DNA，所用方法见Nadine Rockland和Michael Hofreiter于2007年发表的文章《古代DNA提取方法的比较与优化》。随后通过在所有DNA片段末端添加通用接头引物位点，将DNA提取物转化为测序文库。由于从尼安德特人骨骼生成的454文库仅含有极微量的DNA，有时仅有几皮克，因此首先使用与通用文库引物相对应的乳液PCR引物，对原始DNA文库进行PCR扩增。

为准备用于文库扩增的PCR反应体系，在PCR管中加入以下试剂：10微升10 X GAMP PCR缓冲液，20微升氯化镁（每次10微升，共两次），2微升BSA，1微升dNTP混合液，各3微升的4.54 MPCR正向引物和反向引物，1微升AmpliTaq Gold DNA聚合酶，25微升文库模板。最后加入45微升PCR级水，使总体积达到100微升。AmpliTaq Gold DNA聚合酶在室温下稳定，因此无需在冰上操作。

配制PCR反应后，将PCR管放入热循环仪中，首先在95摄氏度下变性12分钟，随后进行14个循环，每个循环包括95摄氏度30秒、60摄氏度1分钟和72摄氏度1分钟。完成这14个循环后，设置72摄氏度延伸5分钟作为最终步骤，之后可将PCR管长期置于10摄氏度保存，直至PCR扩增完成并准备进行后续操作。随后根据制造商说明书，使用Kyogen MinLu离心柱纯化PCR产物，并用MinLu试剂盒提供的EB缓冲液50微升洗脱柱上的DNA，用于后续的初始延伸及产物捕获。

应对未扩增和已扩增文库的等分试样进行定量 PCR，以定量并检测扩增后文库产物的质量。经过14个循环扩增的文库应含有比原始文库多数千倍的DNA。若未达到该水平，则应检查并重复扩增条件。

用于从扩增文库中捕获目标序列的初级延伸捕获引物，应像普通PCR引物一样设计，使其与目标区域匹配，理想退火温度为60摄氏度，并与这些目标序列5'端的12个碱基尾序列互补，且在5'端带有生物素残基。最多可将150条PEC引物组合在一起，使用200微摩尔储备液配制单个多重混合物。对于初级延伸反应，在合适的PCR管中配制PCR反应体系：加入5微升10 X GAMP PCR缓冲液、2.5微升氯化镁、1微升BSA、0.5微升dNTP混合物、5微升初级延伸捕获引物混合物、0.5微升Taq Gold DNA聚合酶、2微升经过14个循环扩增的文库DNA，最后加入31微升PCR级水，总体积为50微升。

如果扩增的文库模板浓度超过每微升10的12次方拷贝，则应先用EB缓冲液稀释，确保加入反应体系的模板量不超过每微升2×10¹²拷贝。准备好PCR管后，将其放入热循环仪中，并设置为单次反应运行程序：首先在95°C下变性12分钟，接着在60°C下退火1分钟，最后在72°C下进行5分钟的初始延伸。

当单个循环结束后，在72摄氏度下保存PCR产物，直至进行下一步操作。为避免引物非特异性结合并直接捕获目标产物，从Kyogen Ute纯化试剂盒中取出150微升PBI或PB缓冲液，加入PCR反应管中，此时反应混合物仍保留在处于72摄氏度的热循环仪中。此操作可使聚合酶失活，同时高温环境可阻止目标引物的非特异性延伸。盖上管盖后短暂涡旋混匀，然后使用台式离心机将液体离心至管底。

在此步骤中仅使用 PBI 或 PB 缓冲液，因为其他结合缓冲液（如 Qiagen PM 缓冲液）可能会干扰下游的捕获过程。接下来，将混合物从 PCR 管中取出，并按照制造商说明转移至 Rogen MinLu 离心柱进行纯化，如前所述，使用 MinLu 试剂盒提供的 30 µL EB 缓冲液洗脱柱上的 DNA。为了去除所有未连接至 PEC 引物的片段，需进行基于磁珠的捕获步骤。

首先，通过涡旋振荡重悬含有M 270链霉亲和素磁珠的储存液，并取出相当于每份样品25 µL的磁珠量。用500 µL的2倍BW缓冲液将磁珠洗涤两次，然后加入与最初取出的磁珠体积相同的2倍BW缓冲液进行重悬。制备25 µL的该悬浮液。

每个样本中加入25 µL纯化后的洗脱DNA至25 µL磁珠悬浮液中，剩余的5 µL保留用于后续定量。使用移液器上下吹打并用移液枪头搅拌，充分混匀DNA与磁珠悬浮液，然后在室温下于台式旋转仪上缓慢旋转孵育15分钟。混合完成后，将全部反应物转移至新的1.5 mL PCR管中。

在前一轮孵育旋转过程中，部分非靶标DNA可能已吸附在管壁上。因此，将珠悬浮液转移至新管可避免这些非靶标DNA释放到最终产物中。在热洗脱步骤中，使用磁性粒子收集器使珠子形成沉淀，10至20秒后所有珠子将迁移至管壁一侧，留下澄清的上清液；应移除上清液以洗涤珠子，向管中加入500 µL 1× BW缓冲液，并以低速涡旋振荡约3秒。

将离心管保持直立一次，再倒置一次，管壁上不应再有磁珠残留。使用台式离心机将悬液离心1至3秒，时间仅需足够使管壁上的所有液体被甩下即可。将离心管放回磁力架（MPC），静置10至20秒，直至所有磁珠完全聚集于管壁一侧。

然后移除上清液。第一次洗涤即完成。在最后一次空白洗涤（BW wash）和上清液去除后，重复此操作共四次。

加入500微升1倍浓度的热洗缓冲液。短暂涡旋混匀悬液，并如前所述离心沉淀，然后在65摄氏度的恒温金属浴振荡器上以1000 RPM振荡2分钟，在从恒温金属浴取出后1分钟内短暂离心并去除上清液的残留痕迹。此步骤将去除可能结合到PEC引物上但未在引物延伸步骤中延伸的片段。将沉淀重悬于30微升EB缓冲液中，并将混合液转移至新的1.5毫升PCR管中。

将试管置于热循环仪中，在 95 摄氏度孵育 3 分钟。在磁性粒子收集器中离心收集珠子。上清液应于 10 至 20 秒内完全澄清，随后将上清液转移至新的带标签试管中。

注意不要转移任何磁珠。保留上清液，其中含有捕获的DNA片段产物。此时磁珠可以弃去。

为了扩增捕获产物，按照第二部分的方法配制PCR反应体系，总体积为100微升，并采用相同的PCR扩增程序。再次强调，在完成捕获产物的PCR扩增后，使用Qiagen Ute离心柱进行纯化，操作步骤同第二部分所述，用50微升Eeb缓冲液从离心柱中洗脱DNA，所得产物即可用于高通量测序。我们设计了574对PEC引物，覆盖整个尼安德特人线粒体基因组。

我们将这些样本分为四个多重混合物，并对来自欧亚大陆四个遗址的五件距今40,000至70,000年的尼安德特人化石文库进行了两轮连续的初级延伸捕获，每个个体产生170,000至500,000条序列，并将结果比对至线粒体参考序列。我们发现，PEC实验流程极大地富集了线粒体DNA，使每个个体的线粒体DNA实现了完全覆盖，平均测序深度在18至56.3倍之间。基于这些结果，我们能够为每个个体生成高质量的完整线粒体基因组序列。

随后，我们将这些序列与全球范围内的现代人类样本以及我们现存的最近亲缘物种——黑猩猩和波诺比猿进行了系统发育比较。结果证实了先前的研究发现：尼安德特人的线粒体DNA与现代人类的线粒体DNA密切相关，但明显不同。此外，尼安德特人序列之间的相互比较揭示出尼安德特人具有极低的遗传多样性，其水平低于当今全球人类的遗传多样性，与现代欧洲人群的遗传多样性水平相似。

这些证据，结合对尼安德特人序列中蛋白质进化的分析，表明尼安德特人长期具有较小的种群规模，这与考古学证据一致，提示尼安德特人的种群密度从未达到现代人类的水平。我们刚刚向您展示了如何进行灵长类特异性扩增捕获，以扩增并捕获目标序列，为高通量测序做准备。在执行该实验流程时，重要的是要严格遵循热循环仪的所有温度设定参数，但需注意，不同引物可能具有不同的退火温度，因此可能需要根据您所使用的特定引物调整退火温度，并在所有洗涤步骤中格外小心，尽可能彻底去除液体。

因此，感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。