Name: 引物延伸捕获:从严重退化的DNA来源有针对性的顺序检索 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: 了解引物延伸捕获技术，用于从严重退化的尼安德特人骨骼DNA中靶向检索线粒体基因组序列。该方法可高效富集古DNA，为研究人类进化与种群遗传学提供关键数据支持。

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感谢 M. Meyer 提供的建议；感谢克罗地亚科学与艺术学院和柏林-勃兰登堡科学院提供的后勤与科学支持；感谢马克斯·普朗克学会总统创新基金提供的经费支持。J.M.G. 获得了美国国家科学基金会国际博士后奖学金（OISE-0754461）的支持。序列已存入欧洲生物信息研究所（EBI）核苷酸数据库，登录号分别为：尼安德特人 1（Feldhofer 1）FM865407，尼安德特人 2（Feldhofer 2）FM865408，Sidron 1253 FM865409，Vindija 33.25 FM865410，梅兹梅斯卡亚 1 FM865411

该方法已用于 Briggs 等人在《科学》杂志 325 卷（5938 期）第 318–321 页（2009 年）发表的研究中，详见 <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/325/5938/318">Briggs et al., Science 325 (5938). 318-321 (2009)</a>。
所需试剂：
<ul>
 <li>AmpliTaq Gold DNA 聚合酶</li>
 <li>10x GeneAmp PCR 缓冲液 II</li>
 <li>MgCl2 25 mM</li>
 <li>dNTP 混合液，每种 25 mM</li>
 <li>BSA，10 mg ml-1 水溶液</li>
 <li>分子生物学级水</li>
 <li>EB 缓冲液（随 MinElute PCR 纯化试剂盒提供）；10 mM Tris HCl，pH 8.5</li>
 <li>MinElute PCR 纯化试剂盒</li>
 <li>M-270 链霉亲和素 Dynabeads 磁珠</li>
 <li>2x 结合与洗涤（BW）缓冲液（2 M NaCl，10 mM Tris-Cl，1 mM EDTA，pH 8.0，0.2% Tween 20）</li>
 <li>1x 结合与洗涤（BW）缓冲液（将 2x BindWash 缓冲液用水平衡稀释 2 倍）</li>
 <li>热洗（HW）缓冲液（2.5 mM MgCl，1X Taq Gold 缓冲液，0.1% Tween 20）</li>
</ul>
有关非标准试剂和设备的制造商信息，请参见后面的表格。
1）文库扩增
<ol>
<li>此处的 DNA 模板是根据 (Rohland and Hofreiter, 2007a, 2007b) 和 (Maricic and Pääbo, 2009) 所述方法，从低拷贝数 DNA 来源制备的 454 文库。为扩增整个文库，请配制以下 PCR 反应体系：
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>试剂</td>
 <td>每反应 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>水</td>
 <td>45</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X Gene Amp PCR buffer II</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2 (25 mM)</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA (10 mg / ml)</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTPs (各 25 mM)</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>454 emPCR 正向引物/10 μM</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>454 emPCR 反向引物/10 μM</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>AmpliTaq Gold DNA 聚合酶 (5 U / μl)</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>454 DNA 文库模板</td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总量</td>
 <td>100</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
</li>
<li>在热循环仪中使用以下 PCR 程序进行 14 个循环 的扩增：
<ol>
<li>95°C 12 分钟</li>
<li>95°C 30 秒</li> 
<li>60°C（或所需退火温度）1 分钟</li>
<li>72°C 1 分钟</li>
<li>返回步骤 2（重复 13 次）</li>
<li>72°C 5 分钟</li>
<li>10°C ∞</li>
</ol>
</li>
<li>按照生产商说明书，使用 Qiagen MinElute 离心柱纯化反应产物。用 50 μl EB 缓冲液洗脱。</li>
<li>使用 qPCR (Meyer et al., 2007) 对纯化后的扩增产物以及未扩增文库的等分试样进行定量。若扩增产物浓度超过每微升 1 × 1012 拷贝，则在后续的引物延伸步骤中减少模板用量，以确保加入引物延伸反应的拷贝数不超过 2 × 1012。</li>
</ol>
2）引物延伸
<ol>
<li>根据所需的反应数量配制主混合液。
<table border="0" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>试剂</td>
 <td>每反应 μl 数</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>水</td>
 <td>45</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X Gene Amp PCR buffer II</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2 (25 mM)</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA (10 mg/ml)</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTPs (每种 25 mM)</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>454 emPCR 正向引物/10 μM</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>454 emPCR 反向引物/10 μM</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>AmpliTaq Gold DNA 聚合酶 (5 U/μl)</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>454 DNA 文库模板</td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总计</td>
 <td>100</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
</li>
<li>在热循环仪中运行以下程序，进行 单引物延伸 反应：
<ol>
<li>95°C 12 分钟</li>
<li>60°C（或根据你的 PEC 引物退火温度调整）1 分钟</li>
<li>72°C 5 分钟</li>
<li>72°C 持续保温！ 
关键步骤 延伸反应完成后，将反应体系保持在 72°C。随后在未从加热模块取出反应管前，直接向管中加入 150 μl PBI 或 PB 缓冲液（用于 QIAGEN MinElute 纯化）。此操作至关重要，可防止混合物冷却过程中发生非特异性引物退火及非目标产物的捕获。
</li>
</ol>
</li>
<li>按照生产商说明书，使用 Qiagen MinElute 离心柱纯化反应产物，用 50 μl EB 洗脱。</li>
</ol>
3) 扩增产物捕获
<ol>
<li>通过涡旋振荡重悬 M-270 磁珠的储存液。每个样品取出 25 μl 磁珠悬液。用 500 μl 2×BW 缓冲液洗涤磁珠两次，并将磁珠重悬于每份样品 25 μl 的 2×BW 缓冲液中。</li>
<li>将步骤 2.3 中得到的 25 μl 洗脱液加入到步骤 3.1 中得到的 25 μl 磁珠悬液中。混匀后，在室温下旋转孵育 15 分钟。 
 建议：保留步骤 2.3 中剩余的 5 μl 洗脱液用于 qPCR 定量。 </li>
<li>将全部混合物转移至新的 1.5 ml 离心管中（此举有助于减少非目标文库片段的残留）。使用磁性颗粒收集器（MPC）沉淀并弃去上清液。</li>
<li>用 500 μl 1×BW 缓冲液洗涤 5 次（多次洗涤有助于尽可能去除背景信号）。最后一次洗涤后，短暂离心并彻底去除残留的上清液。</li>
<li>加入 500 μl 1×热洗（HW）缓冲液。在 65 °C（或比 PEC 引物 Tm 高 5 °C）的温控模块中振荡 2 分钟。此步骤后需迅速移除上清液，以尽量减少降温。 （此步骤旨在去除仍与 PEC 引物结合但未在延伸步骤中实际延伸的背景片段）。彻底去除残留的上清液。</li>
<li>将磁珠沉淀重悬于 30 μl EB 缓冲液中。将全部混合物转移至新的 1.5 ml 离心管中（此举有助于减少非目标文库片段的残留）。在热循环仪中 95 °C 孵育 3 分钟以进行洗脱。放入磁性颗粒收集器中，小心分离上清液，注意保留磁珠。</li>
</ol>
4) 捕获产物扩增
<ol>
<li>为所需数量的样本配制PCR预混液。
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>试剂</td>
 <td>每反应微升</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>水</td>
 <td>45</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X Gene Amp PCR 缓冲液 II</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl₂2 (25 mM)</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA（10 mg / ml） </td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTPs（各25 mM）</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>454 emPCR 正向引物/10 μM</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>454 emPCR 反向引物/10 μM</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>AmpliTaq Gold DNA聚合酶（5 U/μl）</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>洗脱的捕获产物 </td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总计</td>
 <td>100</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
</li>
<li>在 Thermo 定量 PCR 仪中使用以下 PCR 程序 14 个循环 扩增：
<ol>
<li>95°C 12分钟</li>
<li>95°C 30秒</li>
<li>60°C（或所需退火温度）1 分钟</li>
<li>72°C 1 分钟</li>
<li>前往 2 (x 13)</li> 
<li>72°C 5分钟</li>
<li>10°C ∞</li>
</ol>
</li>
<li>使用Qiagen MinElute硅胶离心柱，按照制造商说明书纯化反应产物，用50 μl EB缓冲液洗脱。所得产物可直接用于第二轮捕获（从步骤2.1开始），或直接进入454乳液PCR流程进行测序。</li>
</ol>
代表性结果：
初次使用PEC实验方案时，强烈建议首先进行捕获反应，即将少量“阳性对照靶序列”（例如约100 bp的PCR产物，1皮克已足够）与常规推荐量的扩增后454文库模板混合（参见步骤2.1），并使用一条专门针对该阳性对照产物设计的PEC引物进行捕获。若进行此对照反应，可通过针对阳性对照特异性和454接头特异性的两对引物分别进行qPCR，定量分析纯化的引物延伸反应（1.3）、引物延伸产物（2.3）以及洗脱的磁珠捕获产物（3.6）中“对照靶标”与背景信号的含量。通过该方法，可直接评估实验条件下背景去除的效果（“特异性”）以及靶标回收的效率（“灵敏度”）。
一个成功的 PEC 方案通常具有以下特性——
灵敏度（通过整个实验流程中保留的对照目标物的量来测定）： 
洗脱的磁珠捕获产物中对照目标物的总量（3.6）约为纯化的引物延伸反应中总对照目标物的1–20%（2.3）。
背景（通过454 emPCR引物对测定）： 
洗脱珠捕获产物中的总背景量（3.6）不足纯化后的引物延伸反应中总背景量的&lt; 0.01%（2.3）。
如果最终产物中剩余的目标物质少于1%，则引物延伸步骤可能未成功，应进行排查。
如果最终产物中残留的背景物质超过0.01%，则可能洗涤步骤操作不当，需进行排查。

<ol><li>Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Lalueza-Fox, C., Rudan, P., Brajkovic, D., Kucan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+retrieval+and+analysis+of+five+Neandertal+mtDNA+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted retrieval and analysis of five Neandertal mtDNA genomes.</a> Science. 325 (5938), 318-321 (2009).</li>
<li>Rohland, N., Hofreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+optimization+of+ancient+DNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Comparison and optimization of ancient DNA extraction.</a> Biotechniques. 42 (3), 343-352 (2007).</li>
<li>Rohland, N., Hofreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+DNA+extraction+from+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ancient DNA extraction from bones and teeth.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1756-1762 (2007).</li>
<li>Maricic, T., Pääbo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+454+sequencing+library+preparation+from+small+amounts+of+DNA+permits+sequence+determination+of+both+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands.</a> Biotechniques. 46 (1), 51-57 (2009).</li>
<li>Meyer, M., AW, B. riggs, Maricic, T., Hober, B., Hoffner, B., Krause, J., Weihmann, A., Paabo, S., Hofreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+micrograms+to+picograms%3A+quantitative+PCR+reduces+the+material+demands+of+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 36 (1), e5-e5 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

PEC 方法简单、快速、灵敏且特异。因此，我们作者认为该方法在古DNA以外的领域也有多种应用，例如从RNA文库中捕获小RNA片段、检测混合样本中的结构变异，或从宏基因组样本中捕获16S（或其他位点）的多样性。需要指出的一点是，随着多重捕获反应中PEC引物数量的增加，捕获的灵敏度会降低。因此，PEC方法并不适用于非常大范围（例如兆碱基或更大）的目标区域捕获，但非常适合快速捕获来自多个个体的小目标区域甚至单核苷酸多态性（SNP）位点。

<table><tbody><tr><td>GeneAmp PCR buffer II 和 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 中的 AmpliTaq Gold 聚合酶</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8080241</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN MinElute PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>M-270 链霉亲和素磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁性分离器</td><td>Invitrogen</td><td>120.02D</td><td></td></tr></tbody></table>

引物延伸捕获：从高度降解的dna样本中靶向获取序列

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

我们提出一种从严重降解且富含微生物DNA污染的DNA样本中靶向获取特定DNA序列的方法，此类样本常见于古代骨骼。与直接PCR或鸟枪法测序相比，该方法显著减少了样本损耗和测序工作量。我们利用该技术重建了地理分布广泛的五名尼安德特人（Neandertals）的完整线粒体DNA（mtDNA）基因组。晚期尼安德特人的mtDNA遗传多样性约为现代人类的三分之一。结合对mtDNA编码蛋白进化的分析，这些数据表明尼安德特人的长期有效种群规模小于现代人类以及现存的大型类人猿。

我们介绍了一种靶向获取古DNA序列的方法，并利用该方法重建了五名尼安德特人个体的完整线粒体基因组。将这些序列与现代人类进行比较表明，尼安德特人长期具有较低的有效种群规模。

引物延伸捕获：从高度降解的DNA样本中靶向获取序列

我们介绍一种从严重降解且富含微生物DNA污染的DNA样本中靶向获取特定DNA序列的方法，这类样本常见于……

本视频介绍了引物延伸捕获（primer extension capture，PECA）技术，该技术能够从拷贝数极低且高度断裂的DNA样本中靶向获取特定DNA序列。我们已利用该技术对距今超过40,000年的尼安德特人骨骼中的完整线粒体基因组进行测序。该方法还可用于从多个个体中捕获任意小型靶区域或单核苷酸多态性位点。该实验流程的主要步骤包括：对初始DNA文库进行PCR扩增，通过定量PCR对扩增后的文库进行定量，对扩增文库进行靶向初级延伸，利用珠粒捕获初级延伸产物以去除非靶片段，以及对捕获并洗涤后的靶标进行洗脱和测序。您好，我是来自莱比锡马克斯·普朗克进化人类学研究所遗传学系Shanti Payable实验室的Adrian Briggs。今天我们将向您展示一种从高度降解的复杂DNA来源（例如古代骨骼）中分离特定目标DNA序列的方法。我们已使用该方法研究尼安德特人（Homo neanderthalensis）的线粒体遗传多样性。让我们开始。本实验所用的DNA来自距今4万至7万年的尼安德特人骨骼，这些骨骼发现于尼安德特人地理分布范围内的多个遗址。首先，将骨骼在紫外光下照射过夜，以去除表面可能存在的外源性DNA污染。使用精细钻头制备100至500毫克的骨粉。从骨粉中提取DNA，所用方法见Nadine Rockland和Michael Hofreiter于2007年发表的文章《古代DNA提取方法的比较与优化》。随后通过在所有DNA片段末端添加通用接头引物位点，将DNA提取物转化为测序文库。由于从尼安德特人骨骼生成的454文库仅含有极微量的DNA，有时仅有几皮克，因此首先使用与通用文库引物相对应的乳液PCR引物，对原始DNA文库进行PCR扩增。为准备用于文库扩增的PCR反应体系，在PCR管中加入以下试剂：10微升10 X GAMP PCR缓冲液，20微升氯化镁（每次10微升，共两次），2微升BSA，1微升dNTP混合液，各3微升的4.54 MPCR正向引物和反向引物，1微升AmpliTaq Gold DNA聚合酶，25微升文库模板。最后加入45微升PCR级水，使总体积达到100微升。AmpliTaq Gold DNA聚合酶在室温下稳定，因此无需在冰上操作。配制PCR反应后，将PCR管放入热循环仪中，首先在95摄氏度下变性12分钟，随后进行14个循环，每个循环包括95摄氏度30秒、60摄氏度1分钟和72摄氏度1分钟。完成这14个循环后，设置72摄氏度延伸5分钟作为最终步骤，之后可将PCR管长期置于10摄氏度保存，直至PCR扩增完成并准备进行后续操作。随后根据制造商说明书，使用Kyogen MinLu离心柱纯化PCR产物，并用MinLu试剂盒提供的EB缓冲液50微升洗脱柱上的DNA，用于后续的初始延伸及产物捕获。应对未扩增和已扩增文库的等分试样进行定量 PCR，以定量并检测扩增后文库产物的质量。经过14个循环扩增的文库应含有比原始文库多数千倍的DNA。若未达到该水平，则应检查并重复扩增条件。用于从扩增文库中捕获目标序列的初级延伸捕获引物，应像普通PCR引物一样设计，使其与目标区域匹配，理想退火温度为60摄氏度，并与这些目标序列5'端的12个碱基尾序列互补，且在5'端带有生物素残基。最多可将150条PEC引物组合在一起，使用200微摩尔储备液配制单个多重混合物。对于初级延伸反应，在合适的PCR管中配制PCR反应体系：加入5微升10 X GAMP PCR缓冲液、2.5微升氯化镁、1微升BSA、0.5微升dNTP混合物、5微升初级延伸捕获引物混合物、0.5微升Taq Gold DNA聚合酶、2微升经过14个循环扩增的文库DNA，最后加入31微升PCR级水，总体积为50微升。如果扩增的文库模板浓度超过每微升10的12次方拷贝，则应先用EB缓冲液稀释，确保加入反应体系的模板量不超过每微升2×10¹²拷贝。准备好PCR管后，将其放入热循环仪中，并设置为单次反应运行程序：首先在95°C下变性12分钟，接着在60°C下退火1分钟，最后在72°C下进行5分钟的初始延伸。当单个循环结束后，在72摄氏度下保存PCR产物，直至进行下一步操作。为避免引物非特异性结合并直接捕获目标产物，从Kyogen Ute纯化试剂盒中取出150微升PBI或PB缓冲液，加入PCR反应管中，此时反应混合物仍保留在处于72摄氏度的热循环仪中。此操作可使聚合酶失活，同时高温环境可阻止目标引物的非特异性延伸。盖上管盖后短暂涡旋混匀，然后使用台式离心机将液体离心至管底。在此步骤中仅使用 PBI 或 PB 缓冲液，因为其他结合缓冲液（如 Qiagen PM 缓冲液）可能会干扰下游的捕获过程。接下来，将混合物从 PCR 管中取出，并按照制造商说明转移至 Rogen MinLu 离心柱进行纯化，如前所述，使用 MinLu 试剂盒提供的 30 µL EB 缓冲液洗脱柱上的 DNA。为了去除所有未连接至 PEC 引物的片段，需进行基于磁珠的捕获步骤。首先，通过涡旋振荡重悬含有M 270链霉亲和素磁珠的储存液，并取出相当于每份样品25 µL的磁珠量。用500 µL的2倍BW缓冲液将磁珠洗涤两次，然后加入与最初取出的磁珠体积相同的2倍BW缓冲液进行重悬。制备25 µL的该悬浮液。每个样本中加入25 µL纯化后的洗脱DNA至25 µL磁珠悬浮液中，剩余的5 µL保留用于后续定量。使用移液器上下吹打并用移液枪头搅拌，充分混匀DNA与磁珠悬浮液，然后在室温下于台式旋转仪上缓慢旋转孵育15分钟。混合完成后，将全部反应物转移至新的1.5 mL PCR管中。在前一轮孵育旋转过程中，部分非靶标DNA可能已吸附在管壁上。因此，将珠悬浮液转移至新管可避免这些非靶标DNA释放到最终产物中。在热洗脱步骤中，使用磁性粒子收集器使珠子形成沉淀，10至20秒后所有珠子将迁移至管壁一侧，留下澄清的上清液；应移除上清液以洗涤珠子，向管中加入500 µL 1× BW缓冲液，并以低速涡旋振荡约3秒。将离心管保持直立一次，再倒置一次，管壁上不应再有磁珠残留。使用台式离心机将悬液离心1至3秒，时间仅需足够使管壁上的所有液体被甩下即可。将离心管放回磁力架（MPC），静置10至20秒，直至所有磁珠完全聚集于管壁一侧。然后移除上清液。第一次洗涤即完成。在最后一次空白洗涤（BW wash）和上清液去除后，重复此操作共四次。加入500微升1倍浓度的热洗缓冲液。短暂涡旋混匀悬液，并如前所述离心沉淀，然后在65摄氏度的恒温金属浴振荡器上以1000 RPM振荡2分钟，在从恒温金属浴取出后1分钟内短暂离心并去除上清液的残留痕迹。此步骤将去除可能结合到PEC引物上但未在引物延伸步骤中延伸的片段。将沉淀重悬于30微升EB缓冲液中，并将混合液转移至新的1.5毫升PCR管中。将试管置于热循环仪中，在 95 摄氏度孵育 3 分钟。在磁性粒子收集器中离心收集珠子。上清液应于 10 至 20 秒内完全澄清，随后将上清液转移至新的带标签试管中。注意不要转移任何磁珠。保留上清液，其中含有捕获的DNA片段产物。此时磁珠可以弃去。为了扩增捕获产物，按照第二部分的方法配制PCR反应体系，总体积为100微升，并采用相同的PCR扩增程序。再次强调，在完成捕获产物的PCR扩增后，使用Qiagen Ute离心柱进行纯化，操作步骤同第二部分所述，用50微升Eeb缓冲液从离心柱中洗脱DNA，所得产物即可用于高通量测序。我们设计了574对PEC引物，覆盖整个尼安德特人线粒体基因组。我们将这些样本分为四个多重混合物，并对来自欧亚大陆四个遗址的五件距今40,000至70,000年的尼安德特人化石文库进行了两轮连续的初级延伸捕获，每个个体产生170,000至500,000条序列，并将结果比对至线粒体参考序列。我们发现，PEC实验流程极大地富集了线粒体DNA，使每个个体的线粒体DNA实现了完全覆盖，平均测序深度在18至56.3倍之间。基于这些结果，我们能够为每个个体生成高质量的完整线粒体基因组序列。随后，我们将这些序列与全球范围内的现代人类样本以及我们现存的最近亲缘物种——黑猩猩和波诺比猿进行了系统发育比较。结果证实了先前的研究发现：尼安德特人的线粒体DNA与现代人类的线粒体DNA密切相关，但明显不同。此外，尼安德特人序列之间的相互比较揭示出尼安德特人具有极低的遗传多样性，其水平低于当今全球人类的遗传多样性，与现代欧洲人群的遗传多样性水平相似。这些证据，结合对尼安德特人序列中蛋白质进化的分析，表明尼安德特人长期具有较小的种群规模，这与考古学证据一致，提示尼安德特人的种群密度从未达到现代人类的水平。我们刚刚向您展示了如何进行灵长类特异性扩增捕获，以扩增并捕获目标序列，为高通量测序做准备。在执行该实验流程时，重要的是要严格遵循热循环仪的所有温度设定参数，但需注意，不同引物可能具有不同的退火温度，因此可能需要根据您所使用的特定引物调整退火温度，并在所有洗涤步骤中格外小心，尽可能彻底去除液体。因此，感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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用于患者组织的甲基化结合DNA捕获测序

我们描述了一种将流式细胞术与高通量测序相结合的技术，用于鉴定基因组中晚期复制的区域。...

G2-seq：一种基于高通量测序技术鉴定基因组晚期复制区域的方法

本文描述了一种用于检测循环肿瘤DNA（ctDNA）中低频突变的技术——ER-Seq。该方法的独特之处在于采用了双向错误校正、特殊的背景过滤以及高效的分子富集。...

利用下一代测序技术检测循环肿瘤DNA中的稀有突变

下一代测序（NGS）是一种强大的基因组表征工具，但其应用受到该平台较高错误率（约0.5–2.0%）的限制。我们介绍了错误校正测序的方法，可消除NGS的错误率影响，检测到低至0.0001变异等位基因分数的突变。...

利用纠错型DNA和RNA测序进行稀有事件检测

鉴定基因与调控元件之间的物理相互作用具有挑战性，但染色体构象捕获技术为此提供了便利。该4C-seq方案的改进通过减少PCR模板的过度扩增，减轻了PCR偏好性，同时通过增加限制性内切酶消化步骤，提高了测序读段的可比对性。...

利用下一代测序技术对染色体构象捕获环化文库（4C-seq）进行基因调控序列的高通量鉴定

本方法介绍了如何提高从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA样本中获得的测序数据的质量和数量。我们描述了更准确评估FFPE-RNA样本质量的方法、测序文库的制备步骤，以及对FFPE-RNA样本数据进行分析的流程。...

降解FFPE-RNA样本测序及分析的优化

Hi-C 3.0 是一种改进的 Hi-C 实验方案，结合使用甲醛和二琥珀酰亚胺基戊二酸酯交联剂，并采用 DpnII 和 DdeI...

跨尺度染色体构象捕获

该方案提供了使用二甲基硫酸酯对RNA进行修饰以开展突变谱分析实验的操作指导。内容包括 体外 和 体内...

利用二甲基硫酸盐突变谱结合测序技术探究RNA结构 体外 以及在细胞中

CRISPR等技术面临的一个重大障碍是脱靶效应，其可能破坏重要基因。“环化用于 体外...

使用CIRCLE-Seq检测基因编辑脱靶效应

了解引物延伸捕获技术，用于从严重退化的尼安德特人骨骼DNA中靶向检索线粒体基因组序列。该方法可高效富集古DNA，为研究人类进化与种群遗传学提供关键数据支持。

引物延伸捕获：从高度降解的DNA样本中靶向获取序列

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