组织工程细胞在三维凝胶封装
October 26th, 2009
我们目前合成水凝胶内的细胞的三维（3D）封装的协议。封装过程概述了交联（迈克尔型除了和光发起的自由基机制）两种常用的方法，以及评估封装细胞行为的一些技巧。
封装细胞的逐步过程从水凝胶模具和其他材料的制备和灭菌开始，然后将细胞分离成单个群体，放入每个凝胶组的试管中。然后在细胞存在下进行 ation，然后进行体外或体内孵育期。细胞行为的下游分析可能包括活力、形态、增殖和分化测试。
您好，来自宾夕法尼亚大学生物工程系 Jason Burdick 博士实验室的 Amidio Kahan。今天，我们将向您展示用于组织工程的 3D 水凝胶细胞包埋程序。我们使用该程序来研究水凝胶组成和结构对包膜细胞行为的影响。
那么让我们开始吧。要开始此程序，请在 PBS 中准备 0.5% 重量的光引发剂空气固化 2 9 5 9 或 I 2 9 5 9 溶液。混合并在 37 摄氏度的黑暗中孵育 2 到 3 天。
准备好后，使用针式过滤器对溶液进行消毒并将其储存在室温下。接下来，使用 Microsoft Excel 等电子表格程序计算所需的聚合物和交联剂的量。这是用丙烯酸酯反应性基团功能化的透明质酸。
还要计算含有氨基酸胱氨酸、精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸的功能性粘附结构域的 penant 肽的量。胱氨酸用于拴系到聚合物上。现在已经确定了所需数量的聚合物交联剂和压制剂，将它们称量并分别放入 einor 管中。
相应地调整计算电子表格。对于获得的聚合物的实际质量，继续准备凝胶模具。使用剃须刀片切掉单独包装的无菌物的尖端。
1 毫升一次性注射器。确保为用于照片模型到凝胶的模具进行平面切割。最后，将注射器模具 EOR 管置于生物安全柜内置的杀菌光源下 30 分钟，对打开盖子的注射器模具 EOR 管和任何其他必要材料进行消毒。
灭菌完成后，在实验设备灭菌后继续制备细胞。在通风橱中工作，将无菌 TEA 添加到用于 mical 型交联的聚合物中，并将无菌 PBS 添加到用于自由基交联的聚合物中。将匹配的缓冲液添加到悬垂部分管和涡旋中。
为了溶解悬垂部分通过肽上 INE 基团的硫醇与烷基化透明质酸结合，以将悬垂部分连接到聚合物上，将其添加到聚合物溶液中并用 param 密封。简而言之，涡旋并在 37 摄氏度下孵育并混合。在制备细胞时，当悬垂部分附着时，通过用 PBS 洗涤来准备要封装的细胞 tryis、人间充质干细胞或 HMC。
然后在室温下与胰蛋白酶孵育 1 分钟，取出胰蛋白酶，在 37 度下再孵育 5 分钟。然后添加 HMSC 生长培养基以中和胰蛋白酶并从板表面释放细胞。用血细胞计数器计数细胞。
将计数的细胞分成包含每组凝胶适当数量的部分。对于一组密度为 1000 万个细胞/毫升的 3 块 50 μL 凝胶，将 150 万个细胞分离到一个单独的锥形管中。由于时间原因，每组凝胶制备的凝胶不要超过四块。
接下来，将细胞在 500 RCF 下离心 6 分钟。在室温下，当细胞旋转时，准备用于医学版交联的聚合混合物。向交联剂中加入缓冲液以达到适当的浓度。
对于光引发的自由基交联，将先前制备的 I 2 9 5 9 溶液加入聚合物溶液中。在凝胶总体积的 10% 处，最终引发剂浓度为 0.05% 重量。现在，细胞和聚合混合物已准备好封装在水凝胶中。
首先从离心细胞中吸出 snat。在初次抽吸后等待液体沉淀，然后重新抽吸以去除尽可能多的培养基，而不会破坏细胞沉淀 Resus。用聚合物溶液悬浮细胞沉淀以防止气泡。
缓慢上下移液约 10 次，这应该足以使细胞均匀分布。对于微粒型加成反应，使用宽口移液器吸头向聚合物池中加入适当体积的交联剂溶液。混合。将移液器设置为所需的单个凝胶体积。
上下移液管溶液以均质化，并将 Eloqua 放入注射器尖端模具中。快速执行该步骤以确保细胞均匀分布，并在培养罩中孵育 10 至 30 分钟以进行交联。对于光引发自由基交联。
将适当的体积分装到注射器尖端模具中。将注射器暴露在紫外线下，以便在 365 纳米下暴露 10 分钟进行自由基交联。每平方厘米 4 毫瓦的紫外线通常用于 ACRL 功能化聚合物。
快速执行该步骤，以尽量减少紫外线照射前的细胞沉降。交联后，将凝胶浸入含有培养基的组织培养板的孔中进行孵育和分析。水凝胶的交联也可以按顺序进行。
首先，在凝胶中加入功能化染料甲胎瘤胃至终浓度为 20 纳摩尔。染料有助于可视化图案，因为它优先掺入凝胶的自由交联区域。然后从 mic 型聚合反应开始，产生以下理论交联的一小部分。
自由基交联需要使用在 Adobe Photoshop 或 Illustrator 等程序中设计并直接打印到透明蒙版上的蒙版。面罩尺寸必须与圆形注射器顶部相匹配。使用消毒过的镊子将无菌面罩直接涂在凝胶表面，并暴露在光线下以交联凝胶。
这里进一步显示了封装后 1 小时基于 HA 的水凝胶中的 HMC。由于合成的水凝胶通常是透明的，因此可以使用光学显微镜观察细胞的形态学。使用荧光活死染色试剂盒在封装后 24 小时观察相同细胞的活力。
我们使用钙 M 检测活细胞，使用动脉粥样斑块同源二聚体检测死细胞，观察到活力大于 95%。我们还使用 alamar blue 测定来确定细胞增殖水平，该水平是通过细胞代谢测定试剂导致颜色变化的程度来测量的。在封装后 7 天，在可降解和粘附性 HA 基水凝胶中，并使用标准固定和渗透程序对 H HMC 进行细胞染色。
使用荧光素标记的 phin 和用 dpi 抑制的细胞核可见细胞作用子。针对 cullin 的免疫染色用于观察水凝胶基质内的粘着斑。使用自由基聚合 HMSC 封装的 HA 水凝胶的标准方案对水凝胶进行脱水、石蜡包埋和切片后进行组织学染色。
培养一周后，用标记细胞核的血红素和标记结缔组织 A 的 ASIN 和糖胺聚糖的蓝色染色剂进行染色。实时。PCR 用于定量封装干细胞的分化 减去背景后，目标基因的表达水平由达到阈值荧光的循环数与被动参考信号（组成型活性管家基因）的比较来确定。我们刚刚向您展示了如何将细胞封装在 3D 水凝胶中，并研究细胞在凝胶中的行为。
使用这些程序时，重要的是要确保材料完全无菌，无论是长期保持无菌缓冲溶液和试剂，还是使用杀菌紫外线灯进行消毒。就是这样。感谢您的洗涤，祝您的实验好运。
概述
本文介绍了在合成水凝胶中3D封装细胞的协议，详细说明了交联和评估细胞行为的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物工程
- 组织工程
背景
- 3D细胞封装对于组织工程应用至关重要。
- 水凝胶为细胞生长和分化提供了支持性环境。
- 不同的交联方法可能影响细胞行为。
- 了解这些方法可以增强组织工程策略。
研究目的
- 概述在水凝胶中封装细胞的程序。
- 比较不同的交联技术。
- 评估在各种条件下封装细胞的行为。
使用的方法
- 水凝胶模具的制备和灭菌。
- 细胞群体的分离和准备。
- 使用Michael型加成和光引发自由基机制交联。
- 细胞活力、形态、增殖和分化的下游分析。
主要结果
- 成功地在水凝胶中封装了细胞。
- 不同的交联方法影响了细胞行为。
- 评估了封装细胞的活力和形态。
- 显示水凝胶的组成和结构影响结果。
结论
- 建立的协议可用于各种组织工程应用。
- 了解交联效应对于优化细胞行为至关重要。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上增强组织工程技术。
常见问题
Executive Industry Relevance
3D hydrogel encapsulation enables physiologically relevant cell culture models that improve predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. By mimicking native tissue microenvironments, this approach supports more translatable assessments of stem cell behavior, differentiation, and response to bioactive cues. It addresses a key discovery-stage challenge: reducing biological ambiguity when evaluating therapeutic candidates in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a tissue-like 3D context that better reflects in vivo conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation by allowing observation of cellular phenotype, viability, and differentiation under controlled matrix properties.
- Predictive Value: Improves confidence in lead identification by linking hydrogel composition to stem cell behavior and lineage specification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for preparing validated biological systems suitable for downstream compound screening.
- Operational Value: Enables quantitative readouts such as proliferation (via Alamar Blue), viability (live/dead staining), and morphology, supporting assay reproducibility.
- Platform Utility: Compatible with multiple crosslinking mechanisms (Michael-type addition, free radical) and polymer types (e.g., hyaluronic acid, PEG), allowing assay adaptation across target classes.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains biological relevance from discovery through preclinical validation by preserving stem cell multipotency and differentiation capacity in degradable, adhesive hydrogels.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of cellular behavior over time (e.g., one-week culture) to inform go/no-go decisions based on matrix-mediated effects on proliferation and lineage commitment.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development through immunostaining of focal adhesions (e.g., vinculin) and histological analysis of glycosaminoglycan deposition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for modalities requiring assessment of cell-matrix interactions and differentiation potential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled study of how hydrogel structure influences stem cell fate and mechanotransduction.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible 3D cultures with quantifiable outputs for viability, proliferation, and morphological analysis.
- Analytics: Generates measurable readouts including gene expression (via qPCR), protein localization (immunostaining), and metabolic activity, facilitating comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work through degradation-adaptive hydrogels and extracellular matrix-like cues that model tissue remodeling.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, modular capability applicable across multiple projects in regenerative medicine, disease modeling, and mechanistic screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in stem cell responses to biomaterial cues.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined sterilization, crosslinking, and cell encapsulation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing earlier, more physiologically relevant functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on their performance in tissue-mimetic environments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique, hydrogel chemistry, and stem cell culture.
- Depends on access to UV light sources for photoinitiated crosslinking and standard tissue culture equipment.
- Necessitates cross-team standardization of hydrogel formulation and cell preparation protocols.
- Involves adaptation considerations when transferring across different stem cell types or polymer backbones.
- Includes practical limitations such as gel settling timing constraints and the need for rapid processing to ensure uniform crosslinking.
