用于组织工程的三维水凝胶细胞包封

包封细胞的逐步过程首先从水凝胶模具及其他材料的准备和灭菌开始，随后将细胞分离为独立的细胞群体，并分装至每组凝胶对应的试管中。接着在细胞存在的情况下进行交联反应，然后进行体外或体内孵育。后续对细胞行为的分析可能包括细胞活力、形态学、增殖和分化等检测。

大家好，我是来自宾夕法尼亚大学生物工程系Jason Burdick博士实验室的Amidio Kahan。今天我们将向您展示一种用于组织工程的三维水凝胶细胞包封实验方法。我们利用该方法研究水凝胶的组成和结构对包封细胞行为的影响。

那么，让我们开始吧。首先，配制光引发剂Irgacure 2959（I 2 959）的0.5%（质量浓度）PBS溶液。混合后，在37摄氏度避光条件下孵育两到三天。

准备就绪后，使用注射器滤器对溶液进行除菌，并在室温下保存。接下来，使用电子表格程序（如 Microsoft Excel）计算所需的聚合物和交联剂用量。以下是经丙烯酸酯反应基团功能化的透明质酸。

同时计算含有功能黏附结构域的肽段的用量，该肽段包含半胱氨酸、精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸。其中半胱氨酸用于与聚合物连接。在确定所需的聚合物交联剂和肽段用量后，称取相应量，并分别置于离心管中。

相应地调整计算电子表格。根据实际获得的聚合物质量，进行凝胶模具的制备。使用剃刀刀片切去 individually wrapped sterile 的尖端部分。

一次性1毫升注射器。确保对用于光刻图案化水凝胶的模具进行平切处理。最后，将注射器模具、EOR管（管盖打开）以及其他必要材料置于生物安全柜内置的杀菌光源下照射30分钟，以完成灭菌。

灭菌完成后，在实验器材灭菌的基础上继续进行细胞制备。在超净台内操作，向用于咪唑型交联的聚合物中加入无菌 TEA，向用于自由基交联的聚合物中加入无菌 PBS。向侧链基团试管中加入相应的缓冲液，并涡旋振荡。

为了使侧链基团通过多肽上的INE基团中的巯基与烷基化透明质酸结合，从而将侧链基团连接到聚合物上，需将该侧链基团加入聚合物溶液中，并用封口膜密封。简要操作如下：涡旋混匀，并在37°C条件下振荡孵育。在准备细胞的同时，当侧链基团正在连接时，用PBS洗涤待包封的细胞，如人源间充质干细胞或HMCs，以进行后续操作。

然后在室温下用胰蛋白酶孵育一分钟，去除胰蛋白酶后，在37摄氏度继续孵育五分钟。接着加入HMSC生长培养基以中和胰蛋白酶，并使细胞从培养板表面脱落。使用血细胞计数板对细胞进行计数。

将计数后的细胞按每组凝胶所需数量分装。对于每组三个、每个50微升、细胞密度为每毫升1000万个细胞的凝胶，将150万个细胞分装至一个独立的锥形管中。由于操作时间限制，每组制备的凝胶数量不应超过四个。

接下来在室温下以500 RCF离心细胞6分钟。在细胞离心过程中，配制用于mical edition交联的聚合反应混合液。将缓冲液加入交联剂中，以达到适当的浓度。

对于光引发的自由基交联，将先前配制的 I 2 9 5 9 溶液加入聚合物溶液中，用量为凝胶总体积的 10%，以获得终浓度为 0.05%（重量）的引发剂。此时，细胞与聚合物混合物已准备好用于水凝胶包封。

首先吸取离心后细胞中的上清液。初次吸取后，等待液体沉降，再次吸取以尽可能去除培养基，但不要扰动细胞沉淀。用聚合物溶液重悬细胞沉淀，以防止产生气泡。

缓慢地将溶液上下吹打约10次，应足以使细胞均匀分布。对于mical型加成反应，使用宽孔径移液枪头将适量交联剂溶液加入聚合物细胞中。混匀。将移液枪调节至所需的单个凝胶体积。

用移液器反复吹打溶液以混匀，并将溶液转移至注射器尖端模具中。迅速完成此步骤，以确保细胞均匀分布，并在培养罩内孵育10至30分钟，进行交联。适用于光引发自由基交联。

将适当体积的溶液分装至注射器尖端模具中。将注射器暴露于紫外光下进行自由基交联，照射条件为365纳米波长，照射时间10分钟。对于ACRL功能化的聚合物，通常采用4毫瓦/平方厘米的紫外光强度。

快速操作以尽量减少细胞在紫外光照射前的沉降。交联后，将凝胶浸入含有培养基的细胞培养板孔中，用于后续孵育和分析。水凝胶的交联也可依次进行。

首先，在凝胶中加入功能化染料甲醇化若明，使其终浓度为 20 纳摩尔。该染料可优先掺入凝胶中自由基交联的区域，从而有助于观察图案化效果。随后开始进行微尺度聚合反应，以生成后续步骤所需的部分理论交联比例。

进行自由基交联时，需要使用 Adobe Photoshop 或 Illustrator 等软件设计的掩膜，并直接打印到透明掩膜上。掩膜的尺寸必须与圆形注射器顶部匹配。使用灭菌镊子将无菌掩膜直接贴附于凝胶表面，并暴露于光照下以实现凝胶的交联。

此处进一步展示了包封后一小时的HA基水凝胶内的HMCs。由于合成的水凝胶通常具有透明性，可利用光学显微镜观察细胞形态。相同细胞在包封后24小时使用荧光活死染色试剂盒检测其活力。

我们使用钙黄绿素M检测活细胞，使用碘化丙啶同源二聚体检测死细胞，观察到细胞存活率高于95%。我们还采用Alamar Blue法测定细胞增殖水平，该方法通过检测细胞对试剂的代谢能力引起的颜色变化来评估增殖情况。细胞染色是在人肾小球系膜细胞（H HMCs）包封于可降解且具有黏附性的透明质酸（HA）基水凝胶中7天后进行的，采用标准的固定和透化步骤。

使用荧光素标记的鬼笔环肽（phin）可观察到细胞内的肌动蛋白，细胞核则用DPI进行标记。通过针对cullin的免疫染色，可在水凝胶基质中可视化黏着斑结构。水凝胶经脱水、石蜡包埋及切片后，按照标准方案进行组织学染色。该水凝胶为通过自由基聚合制备的包裹人骨髓间充质干细胞（HMSC）的透明质酸（HA）水凝胶。

培养一周后，使用苏木精染色细胞核，ASIN 染色结缔组织 A，以及蓝色染料染色糖胺聚糖。实时 PCR 用于定量包封干细胞的分化情况。在扣除背景信号后，通过比较目标基因达到阈值荧光时的循环数与一个组成型表达的内参基因（持家基因）的被动参考信号，确定目标基因的表达水平。以上我们向您展示了如何将细胞包封于三维水凝胶中，并研究细胞在凝胶中的行为。

使用这些操作步骤时，必须确保材料的完全无菌，可通过长期保存无菌缓冲液和试剂，或使用杀菌紫外灯进行灭菌。以上就是全部内容。感谢您的阅读，祝您的实验顺利成功。