Name: 在幼虫的监测心脏功能果蝇生理研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-16T17:02:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学习在果蝇幼虫中监测心脏功能的方法，包括完整和解剖制备技术，用于评估离子通道功能和起搏器活动。该视频演示了心脏记录、电场电位测量及药理学操作，为心脏生理学研究提供可靠的实验方案。

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由生物学系 G. Ribble 研究员项目、肯塔基大学青年研究人员与本科生教育-eUreKa! 办公室（肯塔基大学）提供的资助。

引言
昆虫和脊椎动物心脏功能的细胞机制惊人地相似。Drosophila melanogaster 被用于研究导致其他动物（包括人类）疾病状态的基因突变（Bier 和 Bodmer，2004；Peron 等，2009）。目前，多种疾病正在这一易于操作的遗传生物体中被诱导产生（Dowse 等，1995；Johnson 等，1998；Ganetzky，2000；Bier 和 Bodmer，2004；Ocorr 等，2007a, b），并寄望于未来能够测试基因治疗以恢复其正常功能。此外，Drosophila 也是研究细胞水平生理功能的良好模型。
许多以往关于 果蝇 心脏研究已聚焦于胚胎发育的相关方面（Azpiazu 和 Frasch 1993，Bodmer 1993，Bodmer 等. 1990)。少数研究关注了预蛹期、蛹期或成虫期的生理功能（Ashton 等，2001；He 和 Adler，2001；Molina 和 Cripps，2001；Ponzielli 等，2002；Sláma 和 Farkaš，2005；Wessells 和 Bodmer，2004）。然而，蛹期伴随着变态过程、激素变化以及多种生物源性胺类物质的波动。此外，心脏本身也在经历结构上的转变，这在研究心肌细胞生理学时可能使变量控制变得困难（Dulcis 等. 2005；Johnson 等. 2002；Miller，1997；Papaefthimiou 和 Theophilidis，2001）。已知心脏在幼虫阶段具有自律性，可轻易取出或保留 原位 在限定生理盐水灌流以减少循环激素或肽类等混杂变量的情况下（Dowse 等. 1995；Johnson 等. 1997；Dasari 和 Cooper，2006；Feng 等2004）。幼虫心脏的肌源性特性与哺乳动物心脏相似，均具有起搏细胞，可驱动心脏其余部分将液体以有效方式泵送至器官进行灌注。其变时性和变力性 果蝇 幼虫心脏具有研究价值，因其可作为快速检验哺乳动物心脏功能基本原理和病理效应的手段，同时有助于建立细胞生理学的比较模型，例如起搏细胞的离子调控。
幼虫心脏对生物源性胺类和肽类极为敏感，这些物质在血淋巴中的含量会因食物来源或动物自身的生理状态而变化（Dasari 和 Cooper，2006；Johnson et al. 1997, 2000；Nichols et al. 1999；Zornik et al. 1999）。研究内源性或外源性化合物如何从机制上影响心脏功能具有重要意义。如果我们能更深入地理解昆虫的生理学与药理学，就有可能开发出对其他生物影响更小的新型杀虫剂。
迄今为止，尚未描述神经递质和心脏调节因子在幼虫中的细胞作用机制，因为对参与并调控幼虫心脏起搏活动的离子电流和通道类型的了解仍不充分。据我们所知，目前尚无报道记录黑腹果蝇（Drosophila）幼虫心肌细胞的胞外或胞内电生理信号以评估离子电流，进而阐明调节因子的作用机制。
在本报告中，我们介绍了多种记录幼虫心脏心率及生理特性的方法。
方法
完整的幼虫：
<ol>
<li>一种观察完整跳动的幼体心脏的良好方法是直接使用显微镜；然而，幼体必须保持足够静止，以便计数收缩次数。我们开发了监测自由活动幼体以及固定幼体心率的方法。根据具体的研究问题，其中一种方法可能比另一种更为合适。</li>
<li>这些方法可用于长期跟踪个体，但需注意避免脱水。这些方法也可用于评估通过饮食引入的药理学试剂，或用于检测突变品系在发育过程中不同时间点的变化，以及热休克基因诱导后的效应。</li>
<li>我们称之为“蚁群农场”的第一种无约束方法。该技术由两块玻璃板组成，其间由一层幼虫食物隔开。幼虫可在单一焦平面内被观察。该技术也曾用于监测幼虫的昼夜运动电活动（Cooper and Cooper, 2004）。该方法具体为：使用两块载玻片（75 × 25 mm；J. Melvin Freed 品牌），通过一层薄薄的幼虫食物（例如湿润的玉米粉——Lewis, 1960 方法的改良版）将玻片间隔开，间距较窄（1 至 1.5 mm），使幼虫可在单一焦平面内被清晰观察。常用于凝胶电泳板的间隔条（mini gel Bio-Rad；Life Science Research, Hercules, CA 94547, USA）效果良好，因其可购得不同厚度规格，适用于一龄、二龄或三龄幼虫的蚁群农场实验。另一种选择是使用特定厚度的固体塑料片，将其挖空一定区域作为幼虫爬行空间。</li>
<li>为防止幼虫从玻璃双层培养皿的边缘爬出，可使用适当厚度的塑料片进行阻隔。将平台轻微倾斜至20至45度，可使幼虫大部分时间保持头部朝下，尾部带有气孔的部分则位于食物表面之上或食物层中的气道内。</li>
<li>这种“蚂蚁农场技术”还可实现对厚度均匀的食物进行单平面内的视频成像。在此配置下，幼虫通常不会在食物中广泛爬行，而是局限于二维平面内取食并缓慢移动。通过显微镜载物台下方的镜子投射白光，可根据需要调整光线位置，以获得心脏或伴随心脏收缩而运动的两条气管的最佳对比度。使用一台显微镜（可调变倍范围0.67至4.5；World Precision Instrument；型号501379），配备2X基础物镜和0.5X管镜物镜，以获得足够的空间分辨率和放大倍数，覆盖1 cm × 0.5 cm的矩形区域。通过三目镜接口连接固定式摄像头（Mintron, MTV；World Precision Instrument）。环境温度维持在 20°C.
 <img src="/files/ftp_upload/1596/1596fig1.jpg" alt="Histological specimen diagram, displaying nerve tissue with labeled trachea and spine annotations." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 1"> 图1。 完整标本的背侧视图 3rd 龄幼虫。通过观察心脏牵拉气管附着点引起的气管运动来测定心率。</li>
<li>为监测自由活动的动物，可在动物头部滴加少量稀释的食物混合液。操作应在玻璃培养皿中进行，以便透射光穿过幼虫，从而观察心脏管。可使用上述相同的显微镜装置观察心跳并记录搏动次数。 </li>
<li>另一种方法是使用双面胶带将幼虫固定在载玻片的某一位置，使幼虫腹面与胶带接触（Baker 等., 1999)。然而，若在喂养幼虫时胶带受潮，则此方法效果不佳。为防止胶带受潮，可在幼虫基部及胶带边缘处涂抹凡士林（用细针注射）。采用此方法可长时间喂养幼虫，无需在幼虫移动于培养皿上时反复将其驱赶至焦平面。若需释放幼虫，可将胶带润湿，其对动物的黏附性即会丧失。</li>
</ol>
如果不需要将幼虫释放用于后续实验，可以采用永久性固定方法，即用胶水将幼虫粘附在玻璃载片上。使用强力胶法时，幼虫仍可进食，并可在保持粘附于盖玻片的同时被覆盖于湿润溶液中。操作步骤如下：
<ol>
<li>取一个干净的载玻片，并在其一端放置盖玻片。</li>
<li>在盖玻片的一个角落处滴一小点超级胶水。</li>
<li>找到你的 Drosophila 幼虫，并将其从试管中取出。</li>
<li>将幼虫放入培养皿中，用少量水冲洗以去除多余的培养基。</li>
<li>用小块纸巾或吸水纸的角落吸去残留的食物。</li>
<li>用镊子轻轻夹起幼虫，将其放置在载玻片上与盖玻片相对的另一端。</li>
<li>将载玻片置于显微镜下，调节物镜对准幼虫。幼虫应腹面朝下、背面朝上。你可以通过以下特征区分幼虫的两侧：其背部具有两条“赛车条纹”状的气管；而腹面则有微弱的横向沟纹，并分布着极细的黑色刚毛。</li>
<li>如果幼虫方向不正确，可用镊子轻轻将其翻转至正确朝向。</li>
<li>使用一套专用于胶水操作的新镊子，从盖玻片末端的胶滴中蘸取少量胶水，并将其涂抹在另一端的角落处。胶水量应极微，仅需覆盖镊子尖端即可。同时，务必擦拭干净镊子末端，防止其被胶水粘合。</li>
<li>在显微镜下再次检查，确保幼虫仍处于正确位置。若其已翻转，请参考步骤八进行调整。</li>
<li>现在，使用处理幼虫的镊子轻轻夹起幼虫，将其平稳地放置在新涂抹的胶水上。确保黑色的口钩靠近或位于盖玻片边缘，且口钩或褐色的气门均不与胶水接触。</li>
<li>小心地向下轻压幼虫，使其展平。</li>
<li>当幼虫固定到位后，即可施加需要测试的物质。</li>
<li>建议使用注射器吸取待测物质，并将其少量滴加至幼虫头部附近，供其摄入。</li>
<li>最后，可通过在一分钟内计数气门搏动次数来观察心率。</li>
</ol>
原位：解剖并计数心率：
将制备的标本沿腹侧中线纵向切开并展平固定。制备皿由一侧粘附有磁条（Best Buys零售店）的载玻片（VWR）构成。磁条中央有一个孔，便于透过透射光观察标本。解剖针（Fine Scientific Tools，WA）被弯曲后粘在回形针上。回形针可在磁条上灵活移动，用于固定剖开的标本。此类记录皿此前已报道用于固定从医用水蛭腹神经索分离的神经节（Muller et al., 1981）。
<ol>
 <li>将完整的三龄幼虫放置在解剖板上。将幼虫翻转至腹面朝上，直至通过体壁不再可见气管。</li>
 <li>在完整的幼虫两侧插入四枚解剖针。两枚针插入口钩两侧，另两枚针插入气门两侧。</li>
 <li>加入生理盐水，从头部附近的固定针处稍远位置开始做一横向切口，然后沿身体纵轴继续向后做水平切开。</li>
 <li>在接近真正的心脏前一小段距离处停止切割。围绕真正的心脏周围以及气门侧方进行环切。</li>
 <li>抬起一侧背部的解剖针，将其钩住体壁下方。利用该针打开体腔并撑开，对剩余的解剖针重复此操作。</li>
 <li>小心移除内脏组织，注意不要损伤气管或心脏。需注意某些结构与心脏相连，若强行移除可能造成损伤，包括多个脂肪体和脑组织。若在移除内脏时观察到心脏被拉伸，应立即停止对该结构的去除操作。</li>
</ol>
心脏现已暴露，可进行实验条件处理。
<img src="/files/ftp_upload/1596/1596fig2.jpg" alt="Dissection diagram showing arterial system; labeled aorta (Ao), trachea (Tr), spleen (Sp)." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 2"> 图2. 腹侧解剖一只3rd 龄期以直接观察心脏。解剖后将动物背侧固定，可在中枢神经系统完整或不完整的情况下直接向心脏施加化合物。小箭头指示心脏与主动脉分离的位置，用于横断背血管研究（见下文）。Tr，气管；Sp，气门；H，心脏；AO，主动脉。
该解剖技术已用于直接评估药物对黑腹果蝇（Drosophila）幼虫心脏的作用（Gu 和 Singh，1995）。解剖时间为 3–6 分钟。解剖后，将标本置于 HL3 生理盐水中孵育 3–5 分钟，使其充分松弛。
HL3 生理盐水被严格控制在 pH 7.2，因为高 pH 会减慢心率，而低 pH 会加快心率（Badre et al., 2005）。Gu 和 Singh（1995）在心脏药理学分析中使用了 pH 7.0 的生理盐水，并证明了组织活性的维持。在这些实验过程中，通过反复使用 21 号针头将生理盐水注入烧杯中以搅动溶液，使盐水持续保持通气状态。
可通过直接观察或使用VHS录像带或数码相机记录图像，随后在屏幕上回放以量化心率。此前已有文献描述过光电二极管法（Dasari和Cooper，2006）。
热激处理：
<ol>
 <li>解剖幼虫。</li>
 <li>将解剖后的样本置于盖玻片上。</li>
 <li>加热水浴槽。</li>
 <li>通过将温度探针漂浮在盖玻片上，检测水浴槽内的温度。</li>
 <li>当温度达到理想值后，将样本连同盖玻片放入水浴槽中。</li>
 <li>使样本在水浴中保持所需时间，完成后取出。</li>
</ol>
可根据实验需求使用相应的热脉冲和温度。
电刺激心脏以起搏：
<ol>
<li>使用注射器插入并密封尖端开口，将室温（21°C）果蝇生理盐水（HL3）吸入聚焦电极（直径约20微米）中。将电极安装至操纵器上，并确认导线已浸入电极内的盐水中，同时确保刺激器处于关闭状态。</li>
<li>将一只Drosophila三龄幼虫的心脏解剖样本置于解剖显微镜下并固定。将接地导线放入样本的盐溶液中，注意避免与固定针及样本容器壁接触。</li>
<li>使用操纵器将电极尖端定位至心脏顶部，根据需要调节显微镜焦距。最佳操作方式是在移动电极尖端向下时，以电极为焦点进行对焦。</li>
<li>当观察判断电极尖端已到位后，开启刺激器（型号 S9 Grass Instruments，Quincy, Massachusetts, USA），设置频率为2 Hz，脉冲持续时间为0.5至1 ms，电压调至最低档位。延迟时间应设定在12至14之间。</li>
<li>在观察心脏节律的同时，将刺激频率调整至约3 Hz，并缓慢增加电压，直至观察到的心脏节律与刺激器产生的节律同步。通常情况下，离体果蝇心脏的自发搏动频率约为2 Hz；因此当刺激节律高于其固有频率时，心脏将表现为比正常更快的搏动。电压不应超过约20 V，因高电压可能导致细胞损伤，从而使样本失效。一般情况下，根据电极与心脏之间的距离及接触密封情况，可在2至8 V范围内实现有效刺激。</li>
<li>若已达到最大电压但仍无反应，可尝试反转电极极性。若仍无效，则应移动探针，以在心脏上建立更佳的接触连接。</li>
<li>一旦建立起由刺激驱动的节律，即可通过调节频率和脉冲持续时间来操控该节律。需注意的是，频率超过4 Hz时可能引起心脏强直收缩（强直性痉挛）。在建立所需节律后，可加入不同类型的醇类或药理学试剂，观察其对缝隙连接的影响。当缝隙连接被阻断时，电流无法传导，传播的节律将停止。
 
<img src="/files/ftp_upload/1596/1596fig3.jpg" alt="用于样本分析的光学显微镜装置；显微镜、透镜、聚焦照明、可视化系统。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
<img border="0" src="/files/ftp_upload/1596/1596fig4tmb.jpg" alt="果蝇解剖图示，含固定针及靠近心脏管的电极；用于电生理实验的装置。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4">
请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1596/1596fig4.jpg">点击此处</a>查看该图的放大版本。
</li>
</ol>
测量场电位：
<ol>
 <li>玻璃电极由 Kimax 玻璃制成（外径：1.5 mm）。将玻璃管拉制并火焰抛光，以制备内径在 10 至 20 μm 范围内的记录尖端。</li>
 <li>电极腔内充满灌流液。放大器及连接至计算机的记录系统与下文细胞内记录所用系统相同。</li>
 <li>将“大斑片”记录电极（Stühmer et al., 1983）的腔体直接置于心脏的某一区域上方。心肌纤维的自发起搏会产生场电位，可通过该聚焦电极进行监测。</li>
 <li>需小心操作，轻柔地将电极腔体逐个区域缓慢下放并提起，以完成对心脏各区域的监测。电位通过大斑片电极进行记录。</li>
</ol>
可直接计数心率并监测电活动事件。在记录这些电位的同时改变灌流液，也可用于评估灌流液对场电位的影响。
测量细胞内电位：
为了监测心肌细胞的跨膜电位，需用充满3 M KCl的尖锐细胞内电极（电阻为20至30 mOhm）刺入心脏的某一区域。可使用标准的细胞内记录前置放大器和放大器；但我们采用了Molecular Devices（美国加利福尼亚州森尼韦尔，Axonclamp 2B型号）放大器和1 X LU前置放大器。研究表明，心脏的尾端较为坚固，且起搏细胞主要位于此区域，因为大多数情况下心脏收缩由此区域启动（Badre et al., 2005；Dasari 和 Cooper，2006；Dasari et al., 2007）。

<ol><li>Ashton, K., Wagoner, A. P., Carrillo, R., Gibson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+for+the+monoamine-related+traits+heart+rate+and+headless+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci for the monoamine-related traits heart rate and headless behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157, 283-294 (2001).</li>
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<li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+tinman+is+required+for+specification+of+the+heart+and+visceral+muscles+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila.</a> Development. 118, 719-729 (1993).</li>
<li>Bodmer, R., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+homeobox-containing+gene%2C+msh-2%2C+is+transiently+expressed+early+during+mesoderm+formation+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new homeobox-containing gene, msh-2, is transiently expressed early during mesoderm formation of Drosophila.</a> Development. 110, 661-669 (1990).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;解剖工具：精细 #5 镊子和精细剪刀（均购自 Fine Science Tools (USA), Inc.，地址：373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;解剖显微镜，配备变焦功能，用于解剖操作及心率计数。心脏局灶刺激时也需使用该设备。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;细胞外和细胞内记录使用配备直立物镜（4× 和 20×）的复合显微镜。&lt;br/&gt;标准细胞内放大器和 A/D 数据采集板，用于计算机在线记录。电信号通过 &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/pl3504#overview&quot; target=&quot;_blank">PowerLab/4s 接口&lt;/a&gt;（ADInstruments，澳大利亚）进行在线记录。我们使用 ADInstruments 公司提供的标准 &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/&quot; target=&quot;_blank">Chart 或 Scope 软件&lt;/a&gt;。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;化学试剂：所有生理盐水试剂均购自 Sigma 化学公司（St. Louis, MO）。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;用于细胞内记录的玻璃毛细管（FHC，Brunswick, ME, 04011, USA，目录号 #30-31-0）；用于局灶大电极记录和刺激电极的 Kimax-51 玻璃管（Kimble Products，货号 34502，内径 0.8–1.1 mm，长度 100 mm）。细胞内电极的电阻应为 20 至 30 mOhm。大电极通过电极拉制仪拉制出细尖后，折断尖端制成；折断处应为直径约 20&amp;mu;M 的平整垂直断裂面。随后将尖端加热抛光，使其内径约为 10&amp;mu;M，用于局灶细胞外记录。用于驱动心脏的刺激电极，其最终尖端直径约为 20–50 &amp;mu;M。将电极杆部通过加热元件加热，使其逐渐弯曲约 45 度。这样当电极与显微操作器成角时，相对于标本整体形成约 90 度的平面或垂直电极腔面。&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

监测果蝇幼虫 drosophila melanogaster 的心脏功能以用于生理学研究

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

我们介绍多种记录幼虫心脏功能的方法Drosophila. 这些方法可用于测量自由活动和固定状态下的完整幼虫的心率。为了直接控制心脏周围的环境，另一种方法采用解剖后的幼虫并移除内脏器官，以便将心脏浸浴在所需化合物中。暴露的心脏还允许监测膜电位，从而深入了解心肌细胞产生的离子电流以及沿心脏管路的电传导情况。这些方法在未来的实验中各有优缺点，下文将对此进行讨论。幼虫心脏制备提供了除原有模型之外的另一种模型选择Drosophila骨骼神经肌肉接头以研究细胞内钙调节在细胞功能中的作用。通过进一步了解不同物种肌细胞动作电位形成过程中涉及的基础离子电流，人们有望掌握与哺乳动物多种疾病相关的特定基因所引起的离子功能障碍。

我们介绍了多种监测幼虫心脏功能的方法 果蝇 用于评估间隙连接功能、离子通道突变、起搏活性调节以及药理学研究的相关问题。

监测果蝇幼虫 Drosophila melanogaster 的心脏功能以用于生理学研究

我们介绍了多种记录幼虫期果蝇心脏功能的方法。这些方法可用于在无束缚和……条件下测量心率。

果蝇在心脏发育、功能及基础起搏活动的研究中具有显著的遗传学优势。本实验方法展示了如何制备完整及解剖后的幼虫样本，并监测其心率。解剖后的样本还可用于记录细胞外或细胞内电位，从而进一步研究离子通道的功能。大家好，我是罗宾·Cooper（Robin Cooper），来自肯塔基大学生物学系的教职人员。今天，我的学生安·Cooper（Ann Cooper）、凯拉·Ryman（Kyla Ryman）、马特·Ward（Matt Ward）和伊斯特·Boku（Easter Boku）将向大家展示多种监测果蝇幼虫心率的方法。以下这种无束缚的方法被称为“蚁巢法”（ant farm），因为可以在同一焦平面上观察幼虫。为了最佳观察幼虫，应使用体视显微镜，配备2倍基础物镜和0.5倍管镜物镜，以在1厘米×0.5厘米的矩形区域内获得最佳的空间分辨率和放大倍数。可通过安装在目镜上的相机记录照片和视频。开始该方法时，将幼虫与一层薄食物夹在两块玻璃载片之间。使用塑料垫片将载玻片在四边保持一至一点五毫米的间距。将制备样本倾斜二十至四十五度数分钟，以促使幼虫头部保持朝下。调节显微镜反光镜，以获得心脏或两条气管的最佳对比度，便于观察心跳。胶粘法是一种将幼虫永久固定在载玻片上的方法。开始进行胶粘法时，将一块干净的盖玻片放在载玻片上，然后在盖玻片的一个角上滴一滴少量的瞬间胶。接下来，用清水冲洗幼虫。为去除多余的食物，用纸巾或纸巾的一角吸去液体。待幼虫彻底冲洗干净后，用洁净的镊子轻轻夹起，放置在载玻片上，远离显微镜下的盖玻片，并将幼虫腹面朝下摆放。胃部会有微弱的横向沟纹，并带有细小的黑色毛发。幼虫背部应朝上，具有两条条纹状结构，即为气管。使用另一套专用于处理胶水的镊子，从载玻片末端液滴处蘸取少量胶水，将其置于对侧角落处。使用极少量胶水，仅需足以覆盖镊子尖端即可。拿起动物标本，将其放置在胶水上，并确保其保持原位。腹面朝下，黑色口器朝下。钩状结构应位于盖玻片边缘或靠近边缘处，包括口钩和棕色螺旋结构，均不得接触胶水。轻轻按压幼虫以使其展平。施加测试物质时，最好使用注射器在幼虫头部附近滴加少量液滴。通过计数螺旋结构在一分钟内的搏动次数来观察心率。对于较长时间的观察，可将幼虫原位喂养并保持湿润以防止脱水。为制作可在显微镜下使用的解剖载板，需使用解剖刀在磁性胶带中央切割一个直径为两厘米的孔，然后将其粘贴到玻璃载玻片上。使用已弯曲并粘在回形针上的解剖针，以便更方便地固定。在解剖过程中，将完整的三龄星虫幼虫置于解剖板上，背面向上，气管应可通过体壁观察到。在幼虫口钩两侧各插入一根针，再在螺旋结构两侧各插入一根针。接着加入生理盐水以保持幼虫湿润。然后在尾端做一横向切口，再沿螺旋旁侧向头部方向做一纵向切口。抬起一根背侧固定针，并将其钩入角质层下方。用该针向两侧展开，打开体腔。用其余三根针重复上述操作。待动物体被完全固定展开后，小心移除内脏，注意不要损伤气管或心脏。某些结构（包括脑组织和部分脂肪体）与心脏相连，若移除这些结构可能会对心脏造成损伤。解剖后，将标本置于 HL-3 生理盐水中孵育 3 至 5 分钟。在此标本上进行细胞内记录和场电位记录，同时将药理学试剂直接施加于心脏。该解剖步骤的总耗时为 3 至 6 分钟。进行电刺激起搏前，需先制备点状电极：将玻璃电极在加热元件上缓慢移动以进行火焰抛光，并形成约 45 度的平缓弯曲。将充满室温 HL-3 生理盐水的点状电极安装至显微操作器上，使电极尖端朝下。确保刺激器导线接触电极内的生理盐水，并且刺激器处于关闭状态。将新鲜的心脏解剖标本固定在显微镜下。将接地导线放入生理盐水中。注意不要触碰针脚或扰动制备物。使用操纵器将电极向下移动至盐水中时，应始终聚焦于电极。一旦进入盐水中，调整电极尖端位置，使其横截面平贴心脏表面并轻微接触。电极定位后，将刺激器频率设为2赫兹，电压调至最低档位。打开刺激器，将频率调节至约3赫兹，并缓慢增加电压，直至心跳加快至与刺激器节律同步。现在可以通过刺激器来调控节律。可以添加化合物，以观察其是否影响收缩或电传导。要进行场电位记录，需用灌流液填充宏膜片记录电极，并将其安装到复合显微镜的操纵器上。将电极连接至放大器和记录装置。使用操纵器将电极尖端轻柔地接触固定在显微镜下的解剖样本心脏表面。现在可以进行场电位记录，以采集心脏其他区域的场电位。使用操纵器轻轻抬起电极尖端，将其移动至新区域，然后重新降低电极尖端以进行场电位记录。通过该方法可精确监测心脏电信号的频率和持续时间，从而测量幼体心肌细胞的跨膜电位。首先，确保充满 3 摩尔氯化钾的尖锐电极的尖端与心脏表面接触，并与垂直方向呈约 45 度角。正确放置后，轻轻将电极尖端触碰心脏，并轻敲尖端使其进入细胞。若电极未损坏，可再次使用。细胞内记录可用来测量动作电位的离子基础以及电位的特征性波形，从而研究离子通道突变或通道调节剂的作用。我们刚刚向您展示了如何进行心脏记录，以及如何获取细胞内电位和场电位。您可以利用这些技术来观察心脏的改变，以及药物干预和基因修饰的影响。进行此操作时，切勿牵拉与心脏相连的组织结构，也不要使用聚焦电极时用力过猛。此外，采用胶水法时，需注意不要将口部或球形结构粘合封闭。以上即为注意事项。感谢观看，祝他们的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在幼虫的监测心脏功能果蝇生理研究

高分辨率视频追踪成年黑腹果蝇的运动行为

对黑腹果蝇（Drosophila）胚胎进行电生理记录，可分析发育中肌肉和神经元的电学特性，并表征谷氨酸能神经肌肉接头以及中枢胆碱能和GABA能突触的功能性突触形成过程。...

电生理记录在 果蝇 胚胎

介绍了在幼虫和成虫期果蝇（Drosophila）中可视化跳动心脏所需的技术。每个发育阶段都需要采用不同的方法。...

在 Drosophila 中观察跳动的心脏

我们开发了一种半自动光学心跳分析方法（SOHA），用于分析来自高速光学记录的数据...

小心脏半自动光学心跳分析

本报告描述了一种用于测量的方法 黑腹果蝇 使用TriKinetics检测幼虫活动性 黑腹果蝇...

Drosophila 活动监测仪中幼虫活动度的测量

此处描述了制备的实验方案 果蝇 在不同发育阶段进行纵向光学成像 果蝇...

黑腹果蝇 心脏功能的制备与纵向成像 体内 使用光学相干显微成像技术（OCM）

本方案描述了一种简单的检测方法，用于鉴定在正常大气氧浓度下处于缺氧状态的Drosophila...

一种用于检测缺氧的掘穴/隧道形成实验方法 黑腹果蝇 幼虫

本方案描述了一种记录黑腹果蝇（Drosophila...

Drosophila Melanogaster 三龄幼虫中枢神经系统活动的电生理记录

本方案描述了在果蝇（Drosophila...

建立用于心脏功能成像与光遗传学调控的 Drosophila melanogaster 模型

本方案介绍了一种高通量、低成本的方法，通过量化果蝇运动功能障碍来评估其神经毒性，作为传统哺乳动物模型的替代方案。该方法旨在利用一种灵敏、可重复且符合伦理要求的模型，评估药物化合物、环境因子或基因修饰的神经毒性效应。...

Drosophila melanogaster 运动功能障碍的行为学分析作为神经毒性的检测指标

学习在果蝇幼虫中监测心脏功能的方法，包括完整和解剖制备技术，用于评估离子通道功能和起搏器活动。该视频演示了心脏记录、电场电位测量及药理学操作，为心脏生理学研究提供可靠的实验方案。

监测果蝇幼虫 Drosophila melanogaster 的心脏功能以用于生理学研究

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