监测果蝇幼虫 Drosophila melanogaster 的心脏功能以用于生理学研究

果蝇在心脏发育、功能及基础起搏活动的研究中具有显著的遗传学优势。本实验方案展示了如何制备完整及解剖后的幼虫样本，并监测其心率。解剖后的样本还可用于记录细胞外或细胞内电位，从而进一步研究离子通道的功能。

大家好，我是罗宾·Cooper（Robin Cooper），来自肯塔基大学生物学系的教职人员。今天，我的学生安·Cooper（Ann Cooper）、凯拉·瑞曼（Kyla Ryman）、马特·沃德（Matt Ward）和伊斯特·博库（Easter Boku）将向您展示多种监测果蝇幼虫心率的方法。以下这种无束缚的检测方法被称为“蚁巢法”，因为幼虫可在单一焦平面上被观察到。

为获得最佳的幼虫观察效果，应使用解剖显微镜，配备 2 倍基础物镜和 0.5 倍管状物镜，以便在 1 厘米 × 0.5 厘米的矩形区域内实现最佳空间分辨率和放大倍数。可通过安装在目镜上的相机记录照片和视频。开始该方法时，将幼虫夹在两片玻璃载玻片之间，中间放置一层薄薄的食物。

载玻片四周使用塑料垫片隔开，间距为1至1.5毫米。将制备好的样本倾斜20至45度，持续数分钟，以促使幼虫头部保持朝下。调节显微镜反光镜，以获得心脏或两条气管的最佳对比度，便于观察心跳。

胶粘法是一种将幼虫永久固定在载玻片上的固定方法。开始进行胶粘法时，将一块干净的盖玻片放在载玻片上，然后在盖玻片的一个角上滴一滴少量的瞬干胶。

接下来，用清水冲洗幼虫。为去除多余的食物，用纸巾或纸巾的一角吸去液体。待幼虫彻底冲洗干净后，用洁净的镊子轻轻夹起，置于载玻片上，远离盖玻片，在显微镜下将幼虫腹面朝下摆放。

胃部会有微弱的横向沟纹，并带有细小的黑色刚毛。幼虫背部应朝上，具有两条条纹状结构，即为气管。使用另一套专用于处理胶水的镊子，从载玻片末端的胶滴中蘸取少量胶水，置于相对一侧的角落处。

使用极少量胶水，仅需足以覆盖镊子尖端即可。拿起动物标本，将其放置在胶水上，并确保其保持原位。腹面朝下，黑色口器朝下。

钩状结构应位于盖玻片边缘或靠近边缘处，包括口钩和棕色螺旋结构，均不得接触胶水。轻轻按压幼虫以使其展平。

施加待测物质时，最好使用注射器在幼虫头部附近滴加少量液滴。通过计数螺旋结构在一分钟内搏动的次数来观察心率。对于较长时间的观察，可直接在原位喂养幼虫并保持其湿润以防止脱水。为制作可在显微镜下使用的解剖载板，可使用解剖刀在一块磁性胶带中央切割一个直径为2厘米的孔，然后将其粘贴到载玻片上。

使用已弯曲并粘在回形针上的解剖针，以便更方便地固定。解剖过程中，将完整的三龄星虫幼虫置于解剖板上，背面向上，此时气管应可通过体壁观察到。

在幼虫口钩两侧各插入一枚解剖针，另在气门两侧也各插入一枚解剖针。接着加入生理盐水以保持幼虫湿润。然后在尾端做一横向切口，再沿气门旁侧向头部方向做一纵向切口。

抬起一根背侧针并将其钩在角质层下方。使用该针进行撑开，打开体腔。

用其余三根针重复上述操作。待动物体被固定展开后，小心移除内脏，注意不要损伤气管或心脏。某些结构（包括脑组织和部分脂肪体）与心脏相连，若移除这些结构可能会对心脏造成损伤。

解剖后，将标本置于 HL-3 生理盐水中孵育 3 至 5 分钟。在此标本上进行细胞内记录和场电位记录，同时将药理学试剂直接施加于心脏。该解剖步骤的总耗时为 3 至 6 分钟。进行电刺激起搏前，需先制备点电极：将玻璃电极在加热元件上缓慢移动以进行火焰抛光，并形成约 45 度的平缓弯曲。将充满室温 HL-3 生理盐水的点电极安装至显微操作器上，电极尖端朝下。

确保刺激器导线接触电极内的生理盐水，并确认刺激器处于关闭状态。将新鲜的心脏解剖标本固定在显微镜下。将接地导线放入生理盐水中。

注意不要触碰针脚或扰动制备物。使用操纵器将电极向下移动至盐水中时，应始终聚焦于电极。一旦进入盐水中，调整电极尖端位置，使其横截面平贴心脏表面并轻微接触。

电极定位后，将刺激器频率设为2赫兹，电压调至最低档位。打开刺激器，将频率调节至约3赫兹，并缓慢增加电压，直至心跳加快至与刺激器节律同步。

现在可以通过刺激器来调控节律。可以加入化合物，以观察其是否影响收缩或电传导。要进行场电位记录，需用灌流液填充大口径膜片钳记录电极，并将其安装到复合显微镜上的操纵器中。

将电极连接至放大器和记录装置。使用操纵器将电极尖端缓慢下降至显微镜下已固定好的解剖样本心脏上方，并轻轻接触心脏表面。

现在可以进行场电位记录，以采集心脏其他区域的场电位。使用操纵器轻轻抬起电极尖端，将其移动到新区域，然后重新降低电极尖端以进行场电位记录。通过该方法可精确监测心脏电信号的频率和持续时间，从而测量幼体心肌细胞的跨膜电位。

首先，确保充满 3 摩尔氯化钾的尖锐电极的尖端与心脏表面接触，并与垂直方向呈约 45 度角。正确放置后，轻轻将电极尖端触碰心脏，并轻敲尖端使其进入细胞。若电极未损坏，可再次使用。

细胞内记录可用来测量动作电位的离子基础以及电位的特征性波形，从而研究离子通道突变或通道调节剂的作用。我们刚刚向您展示了如何进行心脏记录，以及如何获取细胞内电位和场电位。您可以利用这些技术来观察心脏的改变，以及药物干预和基因修饰的影响。

进行此操作时，切勿牵拉与心脏相连的组织结构，也不要使用聚焦电极时用力过猛。此外，采用胶水法时，需注意不要将口部或球形结构粘合封闭。以上即为注意事项。

感谢观看，祝您的实验顺利成功。