微量法测定蛋白浓度使用NanoDrop 2000C分光光度计
2009年11月4日
微量样品定量分光光度计系统，采用天然的表面张力，无需使用比色皿或毛细血管保留样本。用这种方法的动态范围，通过它们可以测量蛋白质浓度和速度都大大增加。
NanoDrop 技术结合了光纤和表面张力，可固定和测量少量样品，例如核酸和蛋白质。将一小滴样品直接移液到下基座上。然后，上部光学基座与样品啮合以形成色谱柱。
基座会自动移动以调整最佳路径长度。缩短光程，无需对大多数蛋白质样品进行稀释，测量可在几秒钟内完成，并显示可见光谱结果。大家好，我是赛默飞世尔科技 NanoDrop 实验室的 Lynn Kalhorn。
今天，我们将展示一种使用创新的超微量分光光度计测定蛋白质浓度的程序。NanoDrop 2000 C 分光光度计采用创新的样品保留系统，该系统依靠液体的表面张力在两个光学基座之间固定和测量微量样品，无需使用比色皿或毛细管。将微量样品直接放置在检测表面的顶部，并通过表面张力在光纤末端之间形成液柱。
该液柱形成垂直光路。氙气闪光灯提供光源，使用利用线性 CCD 阵列的光谱仪来分析穿过样品的光。从系统中去除传统密闭装置（如比色皿）有几个优点。
测量需要非常少量的样品。1 到 2 μL 的净化只需要用实验室擦拭布擦拭光学表面，光程在测量过程中会自动实时变化。此外，缩短光程可以测量更高的浓度，从而有效地消除了对大多数蛋白质样品进行稀释的需要。
在需要兽医的情况下，例如动力学研究，NanoDrop 2000 C 在同一分光光度计中提供了兽医选项。对于该协议，我们将使用微量基座选项来确定蛋白质浓度。蛋白 A two 80 方法适用于含有色氨酸酪氨酸和苯丙氨酸残基或半胱氨酸半胱氨酸 diss 硫化键的纯化蛋白质，并在 280 纳米处表现出吸光度。
要开始此过程，请从主菜单中选择蛋白 A two 80 应用程序。如果出现波长验证窗口，请确保臂已放下，从下拉列表中选择要测量的样品类型。对于大多数未知蛋白质混合物，建议使用默认设置，其中 1 ABSORBENCE 等于 1 毫克/毫升。
如果测量先前表征的纯化蛋白质，则可以输入质量消光系数或摩尔消光系数。要更精确地确定蛋白质浓度，请从颜色编码框旁边的下拉列表中选择浓度单位。接下来，建立一个空白。
使用适当的缓冲液，使用悬浮蛋白质的缓冲液很重要。使用的缓冲液应与样品溶液具有相同的 pH 值和相似的离子强度。由于不同蛋白质之间的表面张力存在差异，我们建议上样 2 μL 样品，以确保正确形成色谱柱。
要加载，请在排出溶液的同时将低吸附移液器吸头接触底部基座表面，以防止溶液粘附在移液器吸头外部，排出的样品量少于满量，以防止爆裂和气泡进入样品。加载样品后，放下臂，单击空白。消隐完成后，擦去上下基座上的空白溶液。
在取等分试样进行测量之前，使用干燥的实验室擦拭布确保样品均匀非常重要。使用中等 RPM 轻轻涡旋，轻柔但彻底地混合样品，以避免将微气泡引入液体中。在相应的字段中输入样品 ID。
如前所述，为空白样品加载 2 微升第一个样品，放下臂并单击测量测量完成后，从上下基座上擦拭样品。使用干燥的实验室擦拭布，以相同的方式测量所有其他样品，每次测量使用新鲜的 2 微升样品等分试样。普通的无绒实验室抹布通常足以在两次测量之间清洁光学基座。
唯一不相容且不得使用的溶剂是氢氟酸溶液，含有表面活性剂的试剂可能会随着时间的推移使测量基座表面失效，从而阻止形成样品液柱。下基座上的液滴变平表明光学表面变得无法修复。基座表面要么使用实验室擦拭布用力抛光，要么首选方法是按照指示使用 NanoDrop 基座修复化合物 PR one。
如果样品是未表征的蛋白质溶液、细胞裂解物或粗蛋白提取物，我们建议使用 NanoDrop 2000 C 上提供的预配置比色方法之一。BCA 检测将在此处演示。BCA 分析所需的试剂包含在 thermos scientific 穿刺还原剂兼容试剂盒 BCA、试剂 A、B、C、A、试剂 B 和牛血清白蛋白标准品中。
我们将使用 pierce 的预稀释白蛋白组，因为我们的标准参考 pierce BCA 文献来确定哪些检测标准品适合您的情况。要制备试剂，首先将所有未知蛋白质和蛋白质标准品平衡至室温，然后通过轻轻涡旋充分混合。使用中等 RPM 以避免将微气泡引入液体中。
由于气泡可能会对读数产生负面影响。使用试剂 A 与 50 比 1 的比例为要测量的标准品和样品准备足够的新鲜工作试剂 B.In 在本例中，我们将准备 3 毫升工作试剂以涵盖参考 5 个标准品和 6 个样品。常规 BCA 检测涵盖更宽的动态范围，使用 20 比 1 的试剂与蛋白质比例，而微量 BCA 检测更敏感，使用一对一的试剂与蛋白质比例，动态范围更窄。
由于我们正在进行的是常规 BCA 检测，因此我们将制备 20：1 的工作试剂与样品的比例。向每管中加入 190 μL 工作试剂，并配备足够的试管以覆盖所有样品和标准品。接下来，向每个含有试剂的试管中加入 10 μL 标准品或样品。
轻轻涡旋混合均匀。将试管在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育后，让反应物平衡至室温约 10 分钟。
与蛋白 A two 80 方法不同，蛋白 BCA 方法要求在测量样品蛋白质浓度之前生成标准曲线。要生成标准曲线，请先从主菜单中选择蛋白质 BCA 方法。如果出现波长验证窗口，请确保臂已关闭。
在右侧窗格表中输入每个标准浓度的值。该软件允许参考和最多七个附加标准。参比和/或标准品可以重复测量。
使用适当的缓冲液建立空白。用于色度测定的空白通常是去离子的。将两微升水移液到底部基座上，然后放下手臂。
单击空白。只需一个空白即可涵盖参比和标准品的所有后续测量。通过将仅工作试剂和缓冲液的 2 μL Eloqua 移液到下基座上来建立参考。
放下手臂并单击 measure。在标准品选项卡下，突出显示所需的标准品，并将 2 微升所需标准品移液到较低的基座上。放下手臂并单击 measure。
对所有标准品重复此过程。要查看标准曲线，请单击 view standard curve （查看标准曲线）。测量完所有标准品后，单击样品按钮。
输入样品 ID，将 2 微升样品加载到下基座上，然后单击 Measure（测量）。每次测量应使用新鲜的 2 微升等分试样。测量完成后，使用干燥的实验室抹布擦拭样品上下基座和上
基座。然后，由于使用标准曲线自动计算样品的最终浓度，因此获得结果。我们刚刚展示了两种测定蛋白质浓度的方法，一种是通过直接测量两个 80 的方法，另一种是通过间接色度法，每种方法都使用微量 NanoDrop 2000 C 分光光度计。就这样。
感谢观看。
概述
NanoDrop 2000 C 分光光度计利用创新技术测量蛋白质和核酸的微小体积样品，而无需使用传统的比色皿。这种方法提高了测量速度和动态范围，允许高效确定蛋白质浓度。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 分析化学
- 蛋白质分析
背景
- NanoDrop 技术采用光纤和表面张力来保持样品。
- 它允许直接测量小体积样品（1-2 µL）。
- 消除比色皿减少了样品需求和清洁时间。
- 该系统可以在不稀释的情况下测量高浓度。
研究目的
- 演示使用 NanoDrop 2000 C 确定蛋白质浓度的程序。
- 突出微小体积分光光度法的优势。
- 提供有效使用该设备的指南。
使用的方法
- 直接将样品移液到光学底座上。
- 使用适当缓冲液的空白进行校准。
- 在 280 nm 处测量吸光度以确定蛋白质浓度。
- 利用 BCA 等比色分析法对未表征的蛋白质进行分析。
主要结果
- NanoDrop 2000 C 提供快速和准确的蛋白质浓度测量。
- 表面张力有效地保留微小体积样品进行分析。
- 实时路径长度调整提高了测量准确性。
- 在测量之间需要的样品清洁工作最少。
结论
- NanoDrop 2000 C 是研究环境中蛋白质分析的有价值工具。
- 其设计简化了测量过程并减少了样品浪费。
- 比色方法扩大了其对各种蛋白质样品的适用性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Microvolume protein quantification addresses the challenge of limited sample availability in early-stage discovery, enabling precise target validation with minimal material. The NanoDrop 2000c enhances predictive confidence by delivering rapid, reproducible concentration data without dilution, supporting go/no-go decisions in lead identification. Its real-time path length adjustment and broad dynamic range improve assay standardization across discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of purified protein samples using A280 absorbance for rapid assessment of expression and purity.
- Operational Value: Reduces sample consumption to 1-2 µL, preserving precious material for downstream assays.
- Predictive Value: Supports functional target validation by providing accurate concentration inputs for activity and binding studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of standardized protein inputs for biochemical and cell-based assays via precise quantification.
- Operational Value: Eliminates cuvette use and dilution steps, accelerating assay setup and improving reproducibility.
- Scalability: Enables high-throughput readiness through rapid measurement and simple wipe-clean protocol between samples.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment by enabling quantification of protein standards and samples in BCA-based assays.
- Preclinical Model Relevance: Ensures accurate dosing in functional studies by providing reliable concentration data for lysates and extracts.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in target engagement studies through precise protein normalization.
Pipeline & Workflow Integration
The NanoDrop 2000c fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical evaluation, supporting consistent protein quantification across stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling accurate normalization of protein samples in pathway and interaction studies.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible protein inputs for enzyme, binding, and functional screens.
- Analytics: Provides quantitative A280 and colorimetric readouts that allow comparison across conditions and samples.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via reliable quantification in BCA assays for standard curves and sample analysis.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared, reusable platform for protein quantification across multiple projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing variability in protein input quantification.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through automated path length adjustment and minimal sample handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing sample waste and accelerating measurement timelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable concentration data for go/no-go decisions in lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory training in pipetting and sample handling for microvolume techniques.
- Depends on access to a NanoDrop 2000c spectrophotometer and compatible laboratory wipes for surface maintenance.
- Necessitates cross-team standardization on blanking procedures and buffer matching for accurate results.
- Involves adaptation considerations for viscous or surfactant-containing samples that may affect surface tension-dependent column formation.
- Includes practical limitations such as incompatibility with hydrofluoric acid and surfactant-rich reagents that can degrade optical surfaces over time.
