从小鼠胚胎干细胞中衍生造血干细胞

我们首先要取一培养瓶融合度达到100%的umsl细胞。我将先用PBS洗涤一次，然后加入几滴胰蛋白酶（TR），静置几分钟。此时可以看到细胞已从培养瓶底面脱落，说明已基本准备好。

好的，现在我将收集胰蛋白酶处理的眼部细胞，最好轻轻敲击一下装有胰蛋白酶处理眼部细胞的培养皿，短暂震荡以分散细胞克隆，然后将其接种到未处理的培养皿中。接着将其放入培养箱中静置约30至45分钟。现在我将对这些细胞进行离心，以收集细胞沉淀，并用移液器吸除上清液。

所以几分钟后我将重新悬浮，以便进行计数。我已经完成重悬并进行了计数，现在取出一份等分试样，将这份等分试样稀释至50毫升，这样就能获得合适的浓度，确保每滴含有约100个细胞，以确认细胞状态良好。现在我们有了一个储液槽。

只需再轻轻晃动一下，然后将它们倒入我们的储液槽中。好的，这个程序已经设置好了。好了，就这样。

现在它已经相当直了。将其翻转过来，放在一边。每隔几块培养板，我都会稍微倾斜一下，让液体稍微晃动一下。

好的，一共是五个培养皿。现在我将它们放入培养箱中。这些是我们两天前设置的悬滴培养样本。

因此，收集时只需轻轻摇晃培养板以收集液滴。我将收集所有液体，并尽量轻柔操作，以免过度破坏EVs，然后取五到六次PBS进行洗涤。之后，将这些样品静置至少10分钟，EBS将依靠重力自然沉降。

一旦通过肉眼确认胚胎体（EBS）已沉降，即可移除大部分上清液，但不要完全移除，以免扰动样本。好的。接下来将其在摇床上继续培养至第6天。这些胚胎体是6天前由小鼠胚胎干细胞诱导形成，通常在收集前需轻轻晃动培养板。

当您轻轻晃动培养皿时，胚胎干细胞会向培养皿中央聚集，这样更便于进行校正。接下来，让胚胎干细胞依靠重力沉降到离心管底部，然后吸除培养基，并用10毫升至12毫升的PBS洗涤一次。好的，现在我们让这些细胞静置片刻。

现在，我将移除P。我们加入250微升的酶混合液，然后再加入1毫升，随后将它们放入37摄氏度的水浴中。每隔一段时间，我会过来一两次，轻轻弹动一下管子以混匀溶液，因为酶已经沉降。现在我们有了这种无酶的细胞解离缓冲液，它直接来自gpro。

我们将向每根试管中加入约 8 mL 的该溶液。然后使用 5 mL 移液器反复吹打，以使组织解离；在反复吹打过程中，溶液会变得非常浑浊，这表明细胞正在分散到培养基中，形成均匀的悬液。接下来，我将通过台盼蓝排斥法对细胞进行计数；如果您计划进行感染实验或计算感染复数（MOI），准确的细胞计数至关重要。

因此，我将配制一大批含有适当浓度病毒、培养基、细胞以及蛋白硫酸盐的混合液。然后，我需要确保细胞充分混匀，再次强调，我总是非常担心细胞未充分重悬。因此我始终注意这一点，同时使用小体积操作，尽量避免产生过多飞溅，我们在2,500 rpm下离心5分钟。

因此，我正在收集第10天的细胞，所有洗涤液我都保存下来。我过去曾使用碘化丙啶（PI）进行染色，但七氨基放线菌素D（7-AAD）的荧光强度不如前者，因此其在多个通道间的溢出较少，背景更干净。

现在我们只需获取变量，这是一种防止因体积问题导致针头损耗的有效方法。我是Shannon McKinney Freeman，波士顿儿童医院George Families生命法律事务所的博士后研究员。

今天，我们将介绍如何从小鼠胚胎干细胞中获得具有移植能力的细胞群体，这些细胞能够重建血液系统。我们为什么要进行这一实验呢？原因在于，利用该体系，我们能够获得一类具有造血干细胞活性的细胞群体。这类细胞的最终实验方案最初是为了从胚胎干细胞中获得具有造血功能的细胞而开发的，这些细胞能够挽救经致死剂量辐射的小鼠，长期重建其整个外周血所有谱系的造血系统，且效果可持续至动物整个生命周期。

因此，我们才开发了该实验方案。目前，我们正在进行进一步的实验，以明确在所获得的扩增细胞群体中，究竟是哪些细胞亚群介导了这种造血干细胞活性。因为我们尚不清楚具体是哪些细胞发挥了作用；我们知道该细胞群体具有高度异质性，且真正能够挽救小鼠的细胞在该群体中极为稀少。

因此，我们基本上试图定义其表型，以便能够从这些高度异质的细胞中将其纯化出来。随后，我们最感兴趣的是了解它在功能上如何与真正的、来自全骨髓的造血干细胞相比较。它是否具有同等的发育重建能力？它是否似乎反映了成体骨髓造血干细胞的特征？

或者它可能更类似于一种造血干细胞。你可能会在GM或胎肝的早期发育阶段发现它。这正是我们最终试图理解的问题，而我们希望解答这些问题，是因为从最终目标来看，我们希望该方案能够为我们在人类胚胎干细胞方面感兴趣开展的类似工作提供参考和指导。

我们认为，通过数学系统所获得的信息将对未来的实验大有裨益。我认为有几点值得注意：首先，它是一种良好的体外模型，也是一种理想的发育特征模型。

因此，我们首先试图理解造血干细胞的发育过程。这是一个非常理想的系统，可用于研究异位基因表达以及这些因素如何影响造血干细胞的发育。因此，从基础科学的角度来看，这一系统具有重要的研究价值。

但最终，我们确实希望开发出某种基于细胞的疗法，可能在临床上用于从人类细胞中获得可移植的代谢干细胞。不过这可能还需要相当长的时间才能实现。实际上，我们发现最困难的部分并不在于细胞本身的获取，而是通过一系列严谨的实验，我们发现有一段时间在使细胞重建受体动物方面遇到了困难。

而我们最终发现，必须非常仔细地关注受体的消融处理，因为这些细胞不具备相应的修复能力。通常情况下，当你使用骨髓来源的造血细胞对小鼠进行移植时，会给予小鼠10或11 Gy的辐射剂量，而骨髓造血细胞（HC）通常足以使动物从这种辐射损伤中恢复。然而事实证明，我们所扩增的这群细胞无法使动物从如此高剂量的电离辐射中恢复。

因此，我们必须非常仔细地调整照射剂量，并注意动物的体型。因为我们发现，如果动物体型过大，而仍使用相同的剂量，就无法有效清除其细胞。但同样，如果对动物的照射不足，则这些细胞将无法与更具抗性的宿主细胞有效竞争。

因此，当我们真正意识到这是一个关键变量时——它使我们难以观察这些细胞的清髓活性——我们系统地滴定了辐射剂量，同时还发现动物的年龄和体重具有非常显著的影响。正是从这时起，我们的实验才开始具有高度的可重复性。我们发现，如果使用体重约为20克（15至20克）的小鼠，并以9.25 Gy的剂量进行清髓处理，这一剂量似乎是最佳选择，能够为这些细胞提供重建小鼠造血系统所需的优势。是的，我认为这是最重要的变量之一。

另一个重要的因素是注射的细胞数量。我们还针对辐射模式生物的特定条件进行了滴定。同时，我们也对注射到小鼠体内的这些未分级、异质性细胞群体的数量进行了滴定。

我们基本上发现，需要大约最低剂量的 200 万到 500 万个细胞才能挽救动物。如果注射的细胞数量少于这个范围，动物就无法被挽救。我认为这说明了该细胞在这一异质性群体中可能非常稀少，实际上正是这种细胞介导了挽救效应。

因此，我认为最重要的变量是你注射的细胞数量，以及确保无论使用何种移植模型，都要对受体进行充分的处理（例如使用套管或刀片），以便为细胞提供重建所需的有利条件，但又不能过度处理导致其完全无法实现挽救。这些因素一直是主要的关键变量。