Name: 从小鼠胚胎干细胞的造血干细胞的推导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: 了解从小鼠胚胎干细胞推导可移植造血干细胞的标准化实验方案，通过HoxB4逆转录病毒感染和OP9基质细胞共培养技术，建立能够重建致死剂量辐照小鼠造血系统的细胞群体，为干细胞生物学和移植治疗研究提供重要模型。

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胚胎干细胞的分化
<ol>
<li>使用ESC胰蛋白酶处理，收集接近汇合的胚胎干细胞（ESC）培养瓶中的细胞。</li>
<li>将细胞重悬于5 mL分化培养基中，转移至未经明胶包被的T25培养瓶，于37°C孵育45分钟。收集上清液，并通过离心收集细胞。 注意：来自ESC培养的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）会迅速贴附于未经明胶包被的T25培养瓶表面，因此在此贴壁步骤中可被去除。如果您未在MEFs上培养ESC，则可跳过此预贴壁步骤。 </li>
<li>将去除MEFs后的ESC用分化培养基重悬至333,333个细胞/50 mL的浓度。此浓度相当于每15 µL含有100个ESC。</li>
<li>使用多通道移液器，将ESC以每15 µL液滴含100个细胞的密度接种至15 cm2培养皿中。使用8通道移液器时，每块培养皿可接种约18–22排液滴（每皿约5 mL）。 注意：本方案中，2–5个15 cm2培养皿的悬滴量已足够，预计可获得2–5 × 106个第6天的EB来源细胞。 </li>
<li>轻柔翻转培养皿使液滴倒置，于37°C、5% CO2条件下孵育48小时。</li>
<li>通过轻柔旋转培养皿合并液滴，并转移至15 mL锥形管中。用4–6 mL PBS冲洗培养皿，冲洗液一并加入同一15 mL锥形管。 注意：最多可合并五个悬滴培养皿。EB在持续分化过程中会继续生长，若密度过高则易形成大团块。 </li>
<li>让合并后的EB依靠重力自然沉降（约10分钟），吸除上清液，注意勿扰动EB。轻柔地将EB重悬于10 mL分化培养基中，转移至10 cm非黏附性培养皿中。</li>
<li>将培养皿置于摇床，以50 rpm振荡，于37°C、5% CO2条件下继续孵育。</li>
<li>24小时后（分化第4天），轻柔旋转培养皿使EB集中于皿底中央，小心更换50%培养基（5 mL），加入5 mL新鲜分化培养基。将培养皿放回培养箱继续孵育两天。</li>
</ol>
EB 解离及 MSCV-HoxB4-IRES-GFP 感染
<ol>
<li>分化第六天，将拟胚体（EBs）转移至15 mL锥形管中，静置使其自然沉降。</li>
<li>吸除培养基，加入10 mL PBS重悬，静置使EBs再次沉降，随后吸除PBS。</li>
<li>加入250 µL解离酶混合液和1 mL PBS，于37°C水浴中孵育20分钟，期间偶尔轻柔旋转管子以混匀酶液与EBs。</li>
<li>加入8 mL无酶解离缓冲液。</li>
<li>使用5 mL移液器反复吹打混合物，直至EBs完全解离（约10次；过度吹打会增加EB来源细胞的死亡率）。<ol>
<li>随着EBs解离，混合物将因细胞释放而变得浑浊。</li>
<li>吹打时将移液器枪头抵住锥形管底部，可产生剪切力，显著促进解离过程。</li>
</ol></li>
<li>通过离心收集细胞。</li>
<li>将EB来源细胞重悬于5 mL含10%胎牛血清的IMDM培养基中，用台盼蓝染色法计数。 注意：在分化第四天至第六天期间，EBs会发生空泡化，导致大量细胞凋亡和死亡。因此，在第六天时，多达30%的EB来源细胞可能被台盼蓝染色阳性。 </li>
<li>将EB来源细胞以每2 mL含100,000个细胞的比例重悬于10% IMDM培养基与病毒上清液的混合液中，使感染复数（MOI）达到5–10。加入硫酸鱼精蛋白至终浓度为8 µg/mL。 注意：需准备足够的EB/病毒上清混合液，以接种四块6孔板（按每孔2 mL计算）。 </li>
<li>将2 mL EB/病毒上清混合液接种至已预先接种OP9基质细胞的四块6孔板中（见下文）。</li>
<li>将培养板在室温下以2500 rpm离心90分钟，随后转移至37°C、5% CO2培养箱中孵育。</li>
<li>4–6小时后，收集各孔上清液，并通过离心收集可能仍悬浮的细胞。</li>
<li>将离心所得沉淀（可能较小）重悬于48 mL含10%胎牛血清并添加细胞因子的IMDM培养基中。每孔加入2 mL重悬液，回置至原先进行感染并收集上清的四块6孔板中。 注意：含细胞因子的10% IMDM培养基必须在使用前新鲜配制。 </li>
<li>将培养板置于37°C、5% CO2条件下孵育七天。感染后第四天应可见克隆形成，第七天时克隆应较大且形态完整。正常扩增情况下，第七天每孔可获得40–60个克隆。</li>
<li>感染后第七天，使用胰酶处理，收集并合并所有孔中的全部细胞（包括OP9基质细胞）。 注意：在胰酶处理过程中使用的上清液或PBS洗涤液切勿丢弃。此时部分克隆可能仅轻微贴壁，且悬浮细胞较多。务必收集并合并所有洗涤液和上清液，以防丢失潜在有价值的细胞。 </li>
<li>将细胞重悬于8 mL新鲜的含细胞因子的10% IMDM培养基中，每2 mL分装至四个T75培养瓶中。每个培养瓶额外添加13 mL含细胞因子的10% IMDM培养基。在37°C、5% CO2条件下继续孵育三天（即感染后第十天）。</li>
</ol>
&nbsp;
OP9 基质细胞的培养与铺板
<ol>
<li>按照标准操作规程在含20%胎牛血清的α-MEM培养基中培养OP9基质细胞。当OP9细胞生长至完全汇合时，其特性会发生改变。请始终在细胞达到80%汇合度时进行传代，传代比例不得超过1:3。</li>
<li>在使用MSCV-HoxB4-IRES-GFP病毒感染第6天胚胎体来源细胞前24小时，将25,000个OP9细胞接种至4块6孔板的每孔中，培养基为含20%胎牛血清的α-MEM。</li>
</ol>
样品收集、分选与移植
<ol>
<li>用胰蛋白酶处理在OP9基质上扩增10天的细胞，收集细胞并计数。 注意：在胰蛋白酶处理过程中使用的上清液或PBS洗涤液切勿丢弃。此时培养物中部分集落可能仅轻微贴壁，且有大量细胞悬浮于培养基中。应收集并合并所有洗涤液和上清液，以确保不丢失任何潜在有价值的细胞。 注意：良好的扩增应获得 40–50 × 106 细胞/原始6孔板感染，总计160-200 x 106 细胞 </li>
<li>此时可根据标准技术通过磁珠分选或流式细胞术对细胞进行分选。</li>
<li>通过眶后静脉或尾静脉注射，将细胞移植至经分次照射（两次照射间隔2.5小时，每次4.625 Gy，总计9.25 Gy）的Rag-2/gc缺陷型受体小鼠（体重15–22克）。 注意：照射时动物体重必须在15至22克之间。若动物体重超过22克，9.25 Gy的照射剂量将不足以实现适当的消融，细胞可能无法介导对致死性照射的挽救和/或植入造血系统。若移植较大动物，需通过实验确定合适的照射剂量。 </li>
<li>最低剂量为 2-5 x 106 细胞/动物需要确保能够从致死性辐射中被成功挽救。若对细胞进行分次注射，每次注入 2-5 x 106 细胞当量（例如 如果目标细胞群占未分选细胞池的10%，则注入2-5 × 105 细胞/动物 注意：如果进行注射 &gt;2 x 106 细胞，务必通过尾静脉注射，以避免眼眶内畸胎瘤的形成，因经眼眶后途径注射大量细胞可能导致此情况。 </li>
<li>维持 Rag-2-/-/gc-/- 在高压灭菌的笼具中饲养缺陷型受体小鼠。根据动物设施的“洁净程度”，移植后的小鼠在致死性照射后的5周内可能需要给予酸化水或甲氧苄啶-磺胺噁唑（Septra）。 </li>
<li>预期 &gt;移植后3周外周血中90%的ES来源白细胞为GFP阳性。嵌合应为多谱系，尽管已知淋巴细胞会沉默逆转录病毒HoxB4-IRES-GFP。 </li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6 Rag-2/gamma-c 缺陷型小鼠</td><td>动物</td><td>Taconic Farm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>平板摇床</td><td>工具</td><td>VWR international</td><td>33998-360</td><td>Ikaworks 品牌的轨道摇床</td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>工具</td><td>VWR international</td><td>15000-174</td><td>BioHit ePet</td></tr><tr><td>ES 胰蛋白酶</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td>含 0.25% 胰蛋白酶的 PBS</td></tr><tr><td>标准胰蛋白酶</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>含 0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td></tr><tr><td>PBS</td><td>缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>无酶解离缓冲液</td><td>缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>解离酶混合液</td><td>缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>500 mg IV 型胶原酶</td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2126</td><td>分装为 500 &amp;mu;L 每份冷冻保存，避免反复冻融</td></tr><tr><td>DNase</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>10-017CV</td><td></td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3369</td><td>8 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>EB 分化培养基</td><td>培养基</td><td></td><td></td><td>请参见附带的 Protocol.doc 文件中的配方</td></tr><tr><td>10% IMDM</td><td>培养基</td><td></td><td></td><td>请参见附带的 Protocol.doc 文件中的配方</td></tr><tr><td>10% IMDM+细胞因子</td><td>培养基</td><td></td><td></td><td>请参见附带的 Protocol.doc 文件中的配方</td></tr><tr><td>20% 抗 MEM</td><td></td><td></td><td></td><td>请参见附带的 Protocol.doc 文件中的配方</td></tr></tbody></table>

从小鼠胚胎干细胞中衍生造血干细胞

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

干细胞是指具有自我更新能力并能产生多种分化后代细胞的细胞。胚胎干细胞（ESC）来源于早期胚胎的胚泡，具有多能性分化潜能。由于其强大的分化潜力，胚胎干细胞已成为众多研究的焦点，旨在探索如何诱导其生成具有临床应用价值的细胞类型。最近，从小鼠胚胎干细胞成功衍生出造血干细胞（HSC）的技术已实现，本视频方案将展示该过程。HSC是目前临床上应用最广泛的细胞群体，用于治疗多种造血系统恶性肿瘤和疾病。然而，许多可能从HSC治疗中受益的患者无法获得合适的供体。胚胎干细胞可能为这些患者提供一种替代性的HSC来源。以下实验方案建立了一个基础研究体系，可用于研究ESC来源的HSC，并为从人胚胎干细胞中分离HSC提供参考。在本方案中，胚胎干细胞在 commercially available serum（经预先筛选适用于最佳造血分化的商品化血清）中以拟胚体（EB）形式进行为期6天的分化。随后将EB解离，并用逆转录病毒HoxB4进行感染。感染后的EB来源细胞被接种于OP9基质细胞上共培养，OP9基质细胞系源自M-CSF-/-小鼠颅骨的骨髓基质细胞，在含有促进造血的细胞因子的培养体系中共同培养十天。在此共培养过程中，被感染的细胞大量扩增，最终生成数亿个异质性细胞的混合群体。这些细胞可用于挽救并重建致死剂量辐照小鼠的造血系统。

本方案详细描述了从小鼠胚胎干细胞（ESC）中获得可移植的造血干细胞，并将其注射到致死剂量辐照的受体小鼠中的过程。简言之，ESC 被诱导形成拟胚体并进行分化，随后用逆转录病毒 HoxB4 感染，并与 OP9 基质细胞及造血细胞因子共培养。

干细胞被定义为具有自我更新能力并能产生多种分化后代细胞的细胞。胚胎干细胞（ESC）是……

我们首先要取一培养瓶融合度达到100%的umsl细胞。我将先用PBS洗涤一次，然后加入几滴胰蛋白酶（TR），静置几分钟。此时可以看到细胞已从培养瓶底面脱落，说明已基本准备好。好的，现在我将收集胰蛋白酶处理的眼部细胞，最好轻轻敲击一下装有胰蛋白酶处理眼部细胞的培养皿，短暂震荡以分散细胞克隆，然后将其接种到未处理的培养皿中。接着将其放入培养箱中静置约30至45分钟。现在我将对这些细胞进行离心，以收集细胞沉淀，并用移液器吸除上清液。所以几分钟后我将重新悬浮，以便进行计数。我已经完成重悬并进行了计数，现在取出一份等分试样，将这份等分试样稀释至50毫升，这样就能获得合适的浓度，确保每滴含有约100个细胞，以确认细胞状态良好。现在我们有了一个储液槽。只需再轻轻晃动一下，然后将它们倒入我们的储液槽中。好的，这个程序已经设置好了。好了，就这样。现在它已经相当直了。将其翻转过来，放在一边。每隔几块培养板，我都会稍微倾斜一下，让液体稍微晃动一下。好的，一共是五个培养皿。现在我将它们放入培养箱中。这些是我们两天前设置的悬滴培养样本。因此，收集时只需轻轻摇晃培养板以收集液滴。我将收集所有液体，并尽量轻柔操作，以免过度破坏EVs，然后取五到六次PBS进行洗涤。之后，将这些样品静置至少10分钟，EBS将依靠重力自然沉降。一旦通过肉眼确认胚胎体（EBS）已沉降，即可移除大部分上清液，但不要完全移除，以免扰动样本。好的。接下来将其在摇床上继续培养至第6天。这些胚胎体是6天前由小鼠胚胎干细胞诱导形成，通常在收集前需轻轻晃动培养板。当您轻轻晃动培养皿时，胚胎干细胞会向培养皿中央聚集，这样更便于进行校正。接下来，让胚胎干细胞依靠重力沉降到离心管底部，然后吸除培养基，并用10毫升至12毫升的PBS洗涤一次。好的，现在我们让这些细胞静置片刻。现在，我将移除P。我们加入250微升的酶混合液，然后再加入1毫升，随后将它们放入37摄氏度的水浴中。每隔一段时间，我会过来一两次，轻轻弹动一下管子以混匀溶液，因为酶已经沉降。现在我们有了这种无酶的细胞解离缓冲液，它直接来自gpro。我们将向每根试管中加入约 8 mL 的该溶液。然后使用 5 mL 移液器反复吹打，以使组织解离；在反复吹打过程中，溶液会变得非常浑浊，这表明细胞正在分散到培养基中，形成均匀的悬液。接下来，我将通过台盼蓝排斥法对细胞进行计数；如果您计划进行感染实验或计算感染复数（MOI），准确的细胞计数至关重要。因此，我将配制一大批含有适当浓度病毒、培养基、细胞以及蛋白硫酸盐的混合液。然后，我需要确保细胞充分混匀，再次强调，我总是非常担心细胞未充分重悬。因此我始终注意这一点，同时使用小体积操作，尽量避免产生过多飞溅，我们在2,500 rpm下离心5分钟。因此，我正在收集第10天的细胞，所有洗涤液我都保存下来。我过去曾使用碘化丙啶（PI）进行染色，但七氨基放线菌素D（7-AAD）的荧光强度不如前者，因此其在多个通道间的溢出较少，背景更干净。现在我们只需获取变量，这是一种防止因体积问题导致针头损耗的有效方法。我是Shannon McKinney Freeman，波士顿儿童医院George Families生命法律事务所的博士后研究员。今天，我们将介绍如何从小鼠胚胎干细胞中获得具有移植能力的细胞群体，这些细胞能够重建血液系统。我们为什么要进行这一实验呢？原因在于，利用该体系，我们能够获得一类具有造血干细胞活性的细胞群体。这类细胞的最终实验方案最初是为了从胚胎干细胞中获得具有造血功能的细胞而开发的，这些细胞能够挽救经致死剂量辐射的小鼠，长期重建其整个外周血所有谱系的造血系统，且效果可持续至动物整个生命周期。因此，我们才开发了该实验方案。目前，我们正在进行进一步的实验，以明确在所获得的扩增细胞群体中，究竟是哪些细胞亚群介导了这种造血干细胞活性。因为我们尚不清楚具体是哪些细胞发挥了作用；我们知道该细胞群体具有高度异质性，且真正能够挽救小鼠的细胞在该群体中极为稀少。因此，我们基本上试图定义其表型，以便能够从这些高度异质的细胞中将其纯化出来。随后，我们最感兴趣的是了解它在功能上如何与真正的、来自全骨髓的造血干细胞相比较。它是否具有同等的发育重建能力？它是否似乎反映了成体骨髓造血干细胞的特征？或者它可能更类似于一种造血干细胞。你可能会在GM或胎肝的早期发育阶段发现它。这正是我们最终试图理解的问题，而我们希望解答这些问题，是因为从最终目标来看，我们希望该方案能够为我们在人类胚胎干细胞方面感兴趣开展的类似工作提供参考和指导。我们认为，通过数学系统所获得的信息将对未来的实验大有裨益。我认为有几点值得注意：首先，它是一种良好的体外模型，也是一种理想的发育特征模型。因此，我们首先试图理解造血干细胞的发育过程。这是一个非常理想的系统，可用于研究异位基因表达以及这些因素如何影响造血干细胞的发育。因此，从基础科学的角度来看，这一系统具有重要的研究价值。但最终，我们确实希望开发出某种基于细胞的疗法，可能在临床上用于从人类细胞中获得可移植的代谢干细胞。不过这可能还需要相当长的时间才能实现。实际上，我们发现最困难的部分并不在于细胞本身的获取，而是通过一系列严谨的实验，我们发现有一段时间在使细胞重建受体动物方面遇到了困难。而我们最终发现，必须非常仔细地关注受体的消融处理，因为这些细胞不具备相应的修复能力。通常情况下，当你使用骨髓来源的造血细胞对小鼠进行移植时，会给予小鼠10或11 Gy的辐射剂量，而骨髓造血细胞（HC）通常足以使动物从这种辐射损伤中恢复。然而事实证明，我们所扩增的这群细胞无法使动物从如此高剂量的电离辐射中恢复。因此，我们必须非常仔细地调整照射剂量，并注意动物的体型。因为我们发现，如果动物体型过大，而仍使用相同的剂量，就无法有效清除其细胞。但同样，如果对动物的照射不足，则这些细胞将无法与更具抗性的宿主细胞有效竞争。因此，当我们真正意识到这是一个关键变量时——它使我们难以观察这些细胞的清髓活性——我们系统地滴定了辐射剂量，同时还发现动物的年龄和体重具有非常显著的影响。正是从这时起，我们的实验才开始具有高度的可重复性。我们发现，如果使用体重约为20克（15至20克）的小鼠，并以9.25 Gy的剂量进行清髓处理，这一剂量似乎是最佳选择，能够为这些细胞提供重建小鼠造血系统所需的优势。是的，我认为这是最重要的变量之一。另一个重要的因素是注射的细胞数量。我们还针对辐射模式生物的特定条件进行了滴定。同时，我们也对注射到小鼠体内的这些未分级、异质性细胞群体的数量进行了滴定。我们基本上发现，需要大约最低剂量的 200 万到 500 万个细胞才能挽救动物。如果注射的细胞数量少于这个范围，动物就无法被挽救。我认为这说明了该细胞在这一异质性群体中可能非常稀少，实际上正是这种细胞介导了挽救效应。因此，我认为最重要的变量是你注射的细胞数量，以及确保无论使用何种移植模型，都要对受体进行充分的处理（例如使用套管或刀片），以便为细胞提供重建所需的有利条件，但又不能过度处理导致其完全无法实现挽救。这些因素一直是主要的关键变量。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从小鼠胚胎干细胞的造血干细胞的推导

人类胚胎干细胞具有自我更新能力，并能分化为体内所有类型的细胞，这表明它们在医学应用以及作为研究发育和疾病基本问题的工具方面具有巨大潜力。本文提供了一种简明的逐步实验方案，通过免疫外科手术法分离内细胞团，从胚胎中获取人类胚胎干细胞。...

通过免疫手术法建立人类胚胎干细胞系

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

在分化中的胚胎干细胞（ESCs）中调控基因的时间特异性表达，可利用诱导型基因系统实现。然而，构建此类细胞系成本较高且耗时较长。本实验方案可实现外源基因在分化中的ES来源细胞中的快速表达，并进一步分析其下游的造血分化过程。...

逆转录病毒感染小鼠胚胎干细胞衍生的拟胚体细胞以分析造血分化

本方案将介绍从小鼠和人类胚胎干细胞中诱导获得心肌前体细胞的方法。该方案的主要策略是利用流式细胞术，通过在胚胎干细胞系中构建的荧光报告系统来富集心肌前体细胞。...

从胚胎干细胞中获取心脏前体细胞

小鼠胚胎干细胞可通过 OP9-DL1 共培养系统在体外分化为 T 细胞。in vitro...

T细胞的制备 体外 从小鼠胚胎干细胞

造血干细胞和祖细胞（HSPC）在发育过程中来源于特化的（生血性）内皮细胞，但关于部分内皮细胞如何特化为造血细胞的过程仍知之甚少。我们展示了一种基于流式细胞术的方法，可从鼠胚组织中同时分离生血性内皮细胞和HSPC。...

小鼠胚胎造血性内皮细胞的分离

本文所述方案详细介绍了通过过表达少量转录因子，在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导造血程序的方法。该技术可被拓展至人类体系，为未来研究造血过程、血液系统疾病以及造血干细胞移植提供平台。...

利用转录因子重编程小鼠胚胎成纤维细胞以诱导造血程序

本文介绍了人类多能干细胞（hPSC）的培养方案，用于将hPSC分化为CD34+造血祖细胞。该方法通过阶段特异性调控经典WNT信号通路，使细胞特异性地定向分化为确定型或原始型造血程序。...

从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞

本文介绍了一种从囊胚阶段小鼠胚胎中高效建立和培养多能干细胞系的实验方案。...

从小鼠植入前胚胎中建立干细胞系

本文介绍了在小鼠胚胎发育过程中对造血干细胞前体进行克隆分析的方法。我们将来自胚胎主动脉-性腺-中肾区域的单个细胞进行索引分选，结合内皮细胞共培养和移植实验，以表征单个造血前体细胞的表型特征及其植入潜能。...

利用单细胞索引分选联合内皮细胞微环境共培养技术对胚胎造血干细胞前体进行克隆分析

本文介绍了一种在约1周内将人多能干细胞定向分化为生血性内皮细胞的简单方案。...

人多能干细胞向造血内皮细胞的定向分化

了解从小鼠胚胎干细胞推导可移植造血干细胞的标准化实验方案，通过HoxB4逆转录病毒感染和OP9基质细胞共培养技术，建立能够重建致死剂量辐照小鼠造血系统的细胞群体，为干细胞生物学和移植治疗研究提供重要模型。

从小鼠胚胎干细胞中衍生造血干细胞

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