一种用于绘制人pre-mRNA上核糖核蛋白（RNPs）结合位点的快速高通量方法

为了绘制核糖核蛋白在pre-mRNA上的结合位点，首先在目标pre-mRNA的指定区域以30个核苷酸为窗口进行重叠排列，并将重叠寡核苷酸合成到芯片上。将寡核苷酸从芯片上煮沸洗脱，并与目标RNP共沉淀。总起始文库用SCI3标记，结合后的文库用SCI5标记，然后将两者均杂交至检测芯片上。

随后对芯片进行扫描，并使用特征提取软件来解读结果。盐类。大家好，我是来自布朗大学分子细胞生物学系Will Fair brother实验室的Kate Watkins。今天我将向大家展示一种快速且经济的方法，用于确定RNA-蛋白质复合物在前体RNA上的精确定位。在实验中，我们将前体RNA重新合成为一组重叠的寡核苷酸片段。

然后可通过共免疫沉淀将该复合物分离为结合组分和非结合组分，再通过微阵列进行分析。尽管该方法具有多种应用，我们将其用于研究多种剪接因子及其在可变剪接中的作用。接下来，让我们开始实验。

开始此实验步骤时，使用 uc SC 基因组浏览器下载特定基因、剪接位点或其他感兴趣的区域，用于设计 prem A 文库。选择感兴趣的区域，然后以 30 个核苷酸的读长和 20 个核苷酸的重叠区在选定区域上进行计算分段覆盖，使每条寡核苷酸序列相对于前一条偏移 10 个核苷酸。在确定了这些长度为 30 个核苷酸的寡核苷酸后，需在其两端分别添加通用引物序列。

将寡核苷酸提交至Agilent公司，用于定制寡核苷酸微阵列的制备。微阵列到货后，开始从其表面回收DNA寡核苷酸：将微阵列盖玻片放入杂交槽中，轻轻吹打500微升去离子水至玻片表面。将微阵列玻片正面朝下放置在盖玻片上方，使两张玻片的标签面相对，并注意避免产生气泡，以免干扰寡核苷酸的回收过程。

关闭杂交室，并在杂交炉中于99摄氏度旋转过夜。次日，小心地从杂交室中取出芯片，吸除含有从芯片表面释放的寡核苷酸的液体。将释放的寡核苷酸混合物转移至1.5毫升离心管中，以50%的振幅进行超声处理，每次3至5秒，重复三次，以打散可能存在的团块。接下来，使用在其末端添加了T启动子的通用引物，通过低循环PCR扩增该寡核苷酸混合物。

所需循环次数可能因寡核苷酸回收效率而异。避免过度扩增，过度扩增在聚丙烯酰胺凝胶上会表现为弥散条带。最后，使用Amon公司的Mega Short Script试剂盒进行RNA转录。

通过苯酚-氯仿抽提 RNA 终止转录反应，随后使用醋酸钠及作为载体的糖蓝进行乙醇沉淀。将 RNA 沉淀重悬于 105 µL TE 缓冲液中。准确测定 RNA 的浓度。

使用RiboGreen生成标准曲线，然后使用荧光酶标仪进行检测。RNA混合物现已准备好，可进行共免疫沉淀以开始拉下实验。

首先，通过将蛋白A和蛋白G磁珠按1:1的比例混合，制备磁珠，每反应体系终体积为50微升。使用磁力分离架将磁珠集中于管底，以去除上清液。第二次洗涤后，用等体积的冷1×PBS洗涤两次。

重悬，将珠粒重悬于等体积的冷1×PBS中，并按每微升加入2纳克抗体。该用量可能因抗体不同而有所变化，因此可能需要通过实验确定将抗体结合到珠粒上的最佳条件。将混合物在4°C下于旋转平台上孵育过夜。

在早晨，每反应加入两微克超声处理的酵母总RNA，以阻断非特异性结合，并在4摄氏度下旋转孵育额外30分钟。阻断步骤完成后，再次使用磁力架去除上清液。随后用500微升冷的1×PBS洗涤磁珠两次，第二次洗涤后保留PBS，将50微升磁珠混合物分装至新的离心管中。

每个共免疫沉淀反应使用一个离心管。此时珠子已准备好用于共免疫沉淀。接下来，通过将RNA寡核苷酸文库与核细胞提取物混合，制备主混合液。

以RNP为来源，取50微升主混合液作为总样本，加入保护性引物。这些引物是通用引物的RNA版本，可防止蛋白质结合至引物序列或在RNA中引入二级结构。开始共免疫沉淀时，移除磁珠分装样品中的上清液，并将磁珠重悬于120微升剩余的主混合液中。在4摄氏度下轻轻摇动反应体系1至2小时。

孵育结束后，可从小型Eloqua中（包括磁珠）取出少量样品用于后续共沉淀实验。如需进一步检测结合效率或特异性，将剩余反应体系置于磁力架上，移除上清液，并用预冷的1×XPDS缓冲液洗涤一至两次。

通过RNP与磁珠上的抗体结合的RNA即为免疫沉淀（IP）样品。将IP磁珠重悬于50微升含1% SDS的0.1 XTE缓冲液中，65摄氏度加热15分钟。为洗脱RNA，收集上清液，其中含有先前结合在磁珠上的RNA，用苯酚-氯仿抽提法纯化，随后进行乙醇沉淀，再将沉淀物重悬于50微升0.1 XTE缓冲液中。

接下来，使用反向通用引物对样品进行逆转录。然后用通用引物对样品进行PCR扩增，其中一种引物应包含T7启动子。扩增文库所需的循环次数取决于共免疫沉淀的效率。

使用 Ambion 的 mega shorts 试剂盒再次转录样本，但此次加入两微升氨基烯丙基 UTP，替代试剂盒中提供的 T7 UTP。后续将利用氨基烯丙基 UTP 通过侧基对 RNA 进行标记。转录完成后。

使用苯酚氯仿抽提并用乙醇沉淀样品。请勿使用可能干扰样品与芯片杂交的糖蓝或乙酸铵。将沉淀重悬于4.5微升0.1摩尔碳酸钠溶液中。

首先对样品进行标记，向总样品中加入 2.5 µL 无核酸酶水。向免疫沉淀（IP）样品中加入 3 µL S3 和 3 µL SCI five。避光孵育 1 小时。

在室温下，向每个样品中加入六微升四摩尔的盐酸羟胺以终止反应，充分混匀后离心。在室温下短暂孵育15分钟，通过苯酚-氯仿抽提法纯化标记的样品，随后进行乙醇沉淀。大部分颜色会随游离核苷酸进入有机相，因此沉淀物可能无明显颜色。

将每个沉淀重悬于50 µL的0.1 XTE中。按照Agilent芯片杂交试剂盒说明书制备微阵列样品，但需注意以下例外：不要对RNA进行片段化处理——在加入片段化缓冲液后，立即加入杂交缓冲液以终止片段化反应。

将样品置于芯片上，在50摄氏度下旋转孵育三小时。在50毫升锥形管中配制以下50毫升溶液：两管两倍过量的SC缓冲液，两管一倍过量的sea缓冲液，以及一管去离子水。

孵育三小时后，小心地打开芯片载玻片夹心结构，放入2×SSC缓冲液中。使用一对镊子，轻轻将芯片从盖玻片上分离。

轻轻取下盖玻片，注意不要触碰芯片。当玻片被抽出时，关闭锥形瓶并轻轻倒置 60 秒。使用镊子将芯片转移至 1×SSC 溶液中。

盖上管盖，轻轻倒置1分钟。然后将芯片转移至第二管XSSC溶液中，再次轻轻倒置1分钟。最后，将芯片转移至去离子水管中，轻轻倒置30秒。

将玻片边缘放在无尘纸上，使芯片干燥。在无尘纸上轻轻旋转芯片，注意不要触碰含有寡核苷酸的一侧。将芯片放入空的锥形管中，随后进行芯片扫描。

继续扫描芯片阵列。以下是一个典型的芯片阵列示例。每个特征点或寡核苷酸根据其来源被染成不同颜色：总非富集文库的信号显示为绿色，免疫沉淀富集文库的信号显示为红色。

每个特征点的信号被归一化为该通道的总强度。最终输出为红色通道与绿色通道的对数值比。在芯片的每个特征点上，每个基因组坐标处的平均得分被映射到指定位置。

以下以三个相互重叠的30个核苷酸寡核苷酸为例，说明该平均步骤，其得分分别为2、4和0.5，图中显示了每个10个核苷酸窗口的平均富集得分。此处以CLTA基因上多聚嘧啶区追踪结合蛋白PTB的结合模式为例，底部展示了基因的结构特征，PTB结合样本的对数平均富集得分由深红色垂直条形表示。浅红色条形表示PTB结合未富集的区域。

我刚刚向您展示了如何快速高效地构建一个覆盖特定目标区域（例如选择性剪接的轴突）的寡核苷酸文库。我们通常使用微阵列来分析这些文库，但也可以通过Illumina、Ion Torrent测序或更传统的Sanger测序方法进行测序。在进行该实验流程时，重要的是要记住，该文库的构建在RNA或蛋白质水平上均可进行修饰和调整。

在RNA水平上，可将自体区域、致病突变、多态性或随机突变引入寡核苷酸序列中。在蛋白质水平上，RNA结合因子可通过磷酸化或其他翻译后修饰进行修饰。此外，还可调控结合环境，以增加或减少与目标RNA结合蛋白竞争或相互作用的其他因子的水平。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。