使用电压敏感性染料对豚鼠肠神经系统网络中的电活动进行光学记录

本视频演示了使用出生时即具荧光特性的会阴电压敏感染料 D four A-N-E-P-P-D-H-Q，对经电刺激的肠神经系统标本进行解剖及后续成像的过程。取自安乐死后的豚鼠的一小段肠道被分离，通过解剖依次暴露黏膜下层，最终暴露肌间神经丛，以进行光学记录。在获取初始高分辨率图像后，将电极放置于已固定并用 D four A-N-E-P-P-D-H-Q 染色的组织上。

使用高速相机记录反映电活动的光学变化。在高速采集过程中施加电刺激。然后将高分辨率图像叠加到高速相机的像素图上，利用Neuro Plex进行分析。

您好，我是布莱恩·萨尔茨伯格（Brian Salzberg），宾夕法尼亚大学神经科学系细胞光学实验室（我们喜欢称之为 loco）的主任。我叫阿纳莉亚·奥比德（Analia Obide），也是细胞光学实验室的成员。

今天，我们将向您展示一种使用电压敏感染料记录完整哺乳动物神经元网络电活动的方法。我们利用该方法研究构成肠神经系统（也称为“第二大脑”或“肠道大脑”）的两个神经网络内部及之间的神经元连接性。现在，让我们开始吧。

开始制备黏膜下层和肠肌间神经丛标本时，取一只经异氟烷吸入麻醉并断头处死的150至200克或出生两周至三周的哈特利豚鼠，切除其小肠。随后用温热的含氧M199 DM溶液冲洗肠腔，以清除肠道内容物。截取一段8至10厘米长的小肠节段，并注意保持其极性。

将其转移至含有室温 M199 培养基的 10 厘米萨氏（Sard）涂层玻璃培养皿中。将培养皿置于配备暗场照明的解剖显微镜下，然后使用剪刀切开肠系膜边缘，并用昆虫针将肠段固定，使黏膜面朝上。

保持均匀的张力至关重要，以便在固定组织后，黏膜绒毛呈规则排列，组织呈现矩形形态。使用直头精细杜蒙镊子时，应使其接近水平位置。从肠段一端夹住绒毛（VII），沿组织的纵轴方向牵拉，从而剥离黏膜。持续分离黏膜条带，以暴露含有黏膜下神经节和黏膜下血管的黏膜下层。

接下来，使用非常精细的剪刀，沿环形肌纤维的走向在黏膜下层进行剪切。然后用精细镊子非常轻柔地提起黏膜下层，同时用剪刀将环形肌层向下推压，并沿纵向边缘继续剪开。

随着分离的进行，将黏膜下层从其余组织中游离出来。接着，沿环形肌纤维的走向，在距离第一切口1.5至3厘米处做第二个切口，以确定黏膜下层组织的最终大小；所得的黏膜下层片段厚度为30至50微米，呈半透明薄膜状。将其转移至另一含有新鲜M1 99 DM的Sylguard培养皿中，并轻轻固定，避免张力。

然后将培养皿置于室温下的充氧环境中以备后续使用。此时，原始肠段的黏膜层和黏膜下层应已被去除，暴露出环形肌层。该肠段现可用于制备肌间神经丛，以暴露肌间神经丛。

使用直头精细镊子从标本两侧剥离纤维束，尽可能去除环形肌层。暴露的肌间神经丛无法与纵行肌层及下方的环肌层（CI）分离。将肌间神经丛标本转移至一个新的涂有沙尔德（sard）的培养皿中，内含充氧的M199培养基。然后松散地用针固定含有活体肌肉的标本。在进行光学实验前几分钟，将标本转移至另一个已盛有M199 DM培养基的较小涂有沙尔德（syl guard）的培养皿中，培养基中含2 µM的尼非（nefe）以防止肌肉收缩，并仔细地在标本周围放置多枚极细的固定针，将其牢固固定。

确保张力均匀分布，且组织完全平整地贴在硅胶护板底部。此时组织样本已准备好用于生理学实验。在玻璃小瓶中，用含2微摩尔硝苯地平的M199培养基配制5至50微克/毫升的DAI四A-N-E-P-P-D HQ储备溶液，并用铝箔包裹避光。

来自储备液的乙醇应占溶液的比例小于0.5%，将覆盖在标本上的含硝苯地平的M1 99 DM溶液替换为配制好的染料溶液。加入足够体积的染料溶液以完全覆盖组织，室温孵育10至30分钟。孵育结束后，用充氧的M1 99 M加NEFE溶液完全更换灌流 chamber 中的内容物，洗涤标本。

对电刺激标本中神经元活动的光学记录采用一套系统完成，该系统包括一台配备图像分光器的直立式落射荧光显微镜、一台低分辨率高精度高速相机、一台高分辨率黑白相机、一台由计算机控制的刺激发生器以及一台微操纵器。整个装置安装在主动隔振台上，并由厚重的隔音帘和聚酯薄膜顶棚包围，以最大限度减少空气传播的振动。尽管可使用一台运行 Neuro Plex 和 Global Lab Image 2 或其他任何图像采集软件的计算机同时从两台相机获取图像，但此处所示的配置采用两台计算机，分别控制各自的相机以启动光学实验。

将含有染色后富集样本的腔室置于显微镜载物台上。由于D四A和EPPD HQ是一种膜非永久性染料，仅在脂质环境中才会产生荧光，因此来自染色肠神经丛制备样本的健康神经元在20倍以上任何放大倍数下观察时，应呈现为空心气球状。使用激发滤光片HQ 5 35 50、发射滤光片HQ 5 72 LP四和5 65纳米二向色镜。

接下来，使用显微操作器控制将多通道线性矩阵阵列电极置于组织的口端，确保电极远离显微镜物镜。一种在一厘米范围内分布有10根钨电极的线性矩阵阵列，能够同时激活多条独立的神经通路，非常适合用于研究相互连接的神经节环路。然而，在本研究的代表性数据中，我们使用了一种自制的双导线刺激电极。

在进行功能记录之前，使用粘蜡将接地电极放置在记录 chamber 的另一端，并获取待记录电活动区域的高分辨率黑白图像，以辅助可视化。灰度模式可反转，使荧光呈现为暗色。若需使用计算机控制的刺激发生器施加电流刺激，应首先通过选择适当的强度、持续时间、频率和刺激次数，以及相对于光学数据采集开始时间的延迟，对设备进行编程设置。

为确保刺激发生在光学数据采集的时间范围内，需将刺激发生器配置为神经记录系统（neuro plex）控制的设备。接下来，在神经记录系统中设置采集参数，包括帧率、帧数和相机增益。为完整记录动作电位的全过程，帧率应至少设置为每秒一千赫兹（1 kHz）。

由于D四A和E-P-P-G-H-Q在去极化时荧光强度的降低与电压变化呈线性关系，因此在Neuro Plex中反转光学信号的显示，以使动作电位不会显示为倒置。开始采集。在进行每一项功能记录之前，请务必先为每个视野采集一张新的高分辨率黑白图像。

采集完成后，使用 Neuro Plex 离线分析结果。屏幕上一个称为“页面显示”的区域会显示由 80×80 高速相机捕获的制备样本的原始图像，表现为单帧图像。当页面模式设置为“绝对帧叠加”时，通过 Neuro Plex 显示命令，将第二台相机获取的高分辨率图像叠加至原始图像的像素图上。

这需要将页面模式从绝对轨迹更改为轨迹模式，并在显示命令中选择叠加图像。使用鼠标从页面显示的图像中选择单个像素或像素组。这些感兴趣区域的输出将以轨迹形式显示在轨迹显示窗口中，反映出这些像素随时间记录的光信号变化幅度。

在高分辨率图像中反转灰度可改善迹线模式页面显示的可视化效果，强烈建议显示刺激器的模拟输出。选择模拟输出通道以包含在迹线显示窗口中。该输出可指示实验期间施加刺激的精确时间。

要将数据以视频形式查看，可使用神经丛（neuro plex）中的视频命令，通过伪彩色标度显示数据集内的连续帧，伪彩色标度根据荧光强度的最大和最小变化进行调整。使用高分辨率相机和60倍物镜对经DIA四A-N-E-P-P-D-H-Q染色的肠肌神经丛制备样本中的一个神经节进行成像。在数据采集过程中，以40赫兹频率的五次脉冲串刺激样本。

每个脉冲的幅度为15毫安，持续时间为0.5毫秒。确定了四个感兴趣区域（ROIs），并生成了轨迹，以显示在伪彩色帧序列中选定区域上的光学数据平均值。膜去极化的首个光学响应区域（表明神经元活动）呈现为黄色至红色。这些数据表明，刺激诱发的活动出现在每个神经节的特定区域，主要由穿行轴突介导。ROI 2、ROI 3和ROI 4分别标识了距离ROI 1不同距离的单个神经元。

图二以10倍放大倍数展示了信息可能传播的解剖通路，箭头指示了刺激激活所鉴定的肌间神经节所遵循的方向。我们刚刚向您展示了用于记录电压敏感性染料电活动的光学装置的组成部分，以及当该技术应用于肠神经系统时，如何在显微镜视野下研究两个完整哺乳动物神经网络内部及之间的功能连接性。使用光学记录技术时，对细节的关注极为重要。

噪声来源，包括光学、机械和电学方面的干扰，需要严格控制，同时必须精心维持样本的生理状态。因此，熟练掌握本实验方案中的每一个步骤，对于实现光学记录的成功至关重要。以上就是全部内容。

非常感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。