使用电压敏感性染料对豚鼠肠神经系统网络中的电活动进行光学记录

本视频演示了使用天然荧光电压敏感染料 D four A-N-E-P-P-D-H-Q 对电刺激的肠神经系统标本进行分离和后续成像的过程。取一只安乐死后的豚鼠的一小段肠道，通过解剖暴露其黏膜下层，最终暴露肌间神经丛，以便进行光学记录。在获取初始高分辨率图像后，将电极放置于已固定并用 D for A-N-E-P-P-D-H-Q 染色的组织上。

使用高速相机记录反映电活动的光学变化。在高速采集过程中施加电刺激。然后将高分辨率图像叠加到高速相机的像素图上，利用neuro plex进行分析。

大家好，我是布莱恩·萨尔茨伯格（Brian Salzberg），宾夕法尼亚大学神经科学系细胞光学实验室（我们喜欢称之为 loco）的主任。我叫阿纳莉亚·奥比德（Analia Obide），也是细胞光学实验室的成员。

今天，我们将向您展示一种使用电压敏感染料记录完整哺乳动物神经元网络电活动的方法。我们利用该方法研究构成肠神经系统（也称为“第二大脑”或“肠道大脑”）的两个神经网络内部及之间的神经元连接性。现在，让我们开始吧。

开始制备黏膜下层和肌间神经丛样本时，取一只经异氟烷吸入麻醉并断头处死的150至200克或出生两到三周的哈特利豚鼠，切除其小肠。随后用温热的含氧M199 DM溶液冲洗肠腔，清除肠内容物。截取一段8至10厘米长的小肠节段，并注意保持其极性。

将其转移至含有室温 M199 培养基的萨氏（Sard）涂层 10 厘米玻璃培养皿中。将培养皿置于配备暗场照明的解剖显微镜下，然后使用剪刀打开肠系膜边缘，并用昆虫针将肠段固定，使黏膜面朝上。

保持均匀的张力至关重要，以便在固定组织后，黏膜绒毛呈规则排列，组织呈现矩形形态。使用直头精细杜蒙镊时，应使其接近水平位置。用镊子夹住肠段一端的绒毛，沿组织的纵轴方向牵拉，从而剥离黏膜。持续分离黏膜条带，以暴露含有黏膜下神经节和黏膜下血管的黏膜下层。

接下来，使用非常精细的剪刀，沿着环形肌纤维的走向，在黏膜下层进行切开。然后用精细镊子非常轻柔地提起黏膜下层，同时用剪刀将环形肌层向下推，沿纵向边缘进行分离切割。

随着分离的进行，将黏膜下层从其余组织中游离出来。现在，沿环形肌纤维的方向，在距离第一切口1.5至3厘米处做第二个切口，以确定黏膜下层组织的最终大小；所得的黏膜下层片段厚度为30至50微米，呈半透明薄膜状。将其转移至另一含有新鲜M1 99 DM的Sylguard培养皿中，并轻轻固定，避免张力。

然后将培养皿置于室温下的充氧 chamber 中以备后续使用。此时，原始肠段的黏膜层和黏膜下层应已被去除，暴露出环形肌层。该肠段现可用于制备肌间神经丛，以暴露肌间神经丛。

使用直头精细镊子从标本两侧剥离纤维束，尽可能去除环形肌层。暴露的肌间神经丛无法与纵行肌层及其下方的环肌层（CI）分离。将肌间神经丛标本转移至一个新的涂有沙尔德（sard）的培养皿中，内含充氧的M199培养基。然后松散地用针固定含有活体肌肉的标本。在进行光学实验前几分钟，将标本转移至另一个已盛有含2微摩尔尼非（nefe）的M199 DM培养基的小型涂有沙尔德（syl guard）的培养皿中，以防止肌肉收缩，并小心地在标本周围放置多枚极细的固定针，将其牢固固定。

确保张力均匀分布，且组织完全平整地贴在硅胶护板底部。此时组织样本已准备好用于生理学实验。在玻璃小瓶中，用含2 µM硝苯地平的M199培养基配制5至50 µg/mL的DAI four A-N-E-P-P-D HQ储备液，并用铝箔包裹避光。

来自储备液的乙醇应占溶液的比例小于0.5%，将覆盖在标本上的含硝苯地平的M1 99 DM溶液替换为配制好的染料溶液。加入足够体积的染料溶液以完全覆盖组织，室温孵育10至30分钟。孵育结束后，用充氧的M1 99 M加NEFE溶液完全更换灌流 chamber 中的内容物，洗涤标本。

使用一种系统对电刺激样本中的神经元活动进行光学记录，该系统包括一台配备图像分光器的直立式落射荧光显微镜、一台低分辨率高精度高速相机、一台高分辨率黑白相机、一台由计算机控制的刺激发生器以及一台微操纵器。整个装置安装在主动隔振台上，并用厚重的隔音帘和聚酯薄膜顶棚包围，以最大限度减少空气传播的振动。尽管可以使用一台运行 Neuro Plex 和 Global Lab Image Two 或其他任何图像采集软件的计算机同时从两台相机获取图像，但此处所示的配置采用两台计算机，分别控制各自的相机以启动光学实验。

将含有染色后筛选样品的培养皿置于显微镜载物台上。由于 D four A 和 EPPD HQ 是一种膜非永久性染料，仅在脂质环境中才会产生荧光，因此来自染色肠神经丛制备物的健康神经元在20倍以上任何放大倍数下观察时，应呈现为空心气球状。使用激发滤光片 HQ 5 35 50、发射滤光片 HQ 5 72 LP 四以及 5 65 纳米二向色镜。

接下来，使用显微操作器控制装置，将一个多通道线性矩阵阵列电极置于组织的口端，确保电极避开显微镜物镜。一种包含10根钨电极、分布在1厘米范围内的线性矩阵阵列，能够同时激活多条独立的神经通路，非常适合用于研究相互连接的神经节环路。然而，在本研究的代表性数据中，我们使用了一种自制的双导线刺激电极。

在进行功能记录之前，使用粘蜡将接地电极置于记录 chamber 的另一端，并获取将要记录电活动区域的高分辨率黑白图像，以辅助可视化。灰度模式可反转，使荧光呈现为暗色。若需使用计算机控制的刺激发生器施加电流刺激，应首先通过选择适当的强度、持续时间、频率和刺激次数，以及相对于光学数据采集开始时间的延迟，对设备进行编程设置。

为确保刺激发生在光学数据采集的时间范围内，需将刺激发生器配置为神经记录系统（neuro plex）控制的设备。接下来，在神经记录系统中设置采集参数，包括帧率、帧数和相机增益。为完整定义一次动作电位，帧率应至少设置为每秒一千赫兹（1 kHz）。

由于D四A和E-P-P-G-H-Q在去极化时荧光强度的降低与电压变化呈线性关系，因此在Neuro Plex中反转光学信号的显示，以使动作电位不会显示为倒置。开始采集。在进行每次功能记录之前，请务必先为每个视野采集一张新的高分辨率黑白图像。

采集完成后，使用 Neuro Plex 离线分析结果。屏幕上一个称为“页面显示”的区域会显示由 80×80 高速相机捕获的单帧原始图像。当页面模式设置为“绝对帧叠加”时，通过 Neuro Plex 显示命令，将第二台相机获取的高分辨率图像叠加到原始图像的像素图上。

这需要将页面模式从绝对轨迹更改为轨迹模式，并在显示命令中选择叠加图像。使用鼠标从页面显示的图像中选择单个像素或像素组。这些感兴趣区域的输出将以轨迹形式显示在轨迹显示窗口中，反映这些像素随时间记录的光学变化幅度。

在高分辨率图像中反转灰度可以改善在轨迹模式页面显示中的可视化效果，强烈建议显示刺激器的模拟输出。选择模拟输出通道，将其包含在轨迹显示窗口中。该输出可指示实验过程中施加刺激的精确时间。

要将数据以视频形式查看，请使用Neuro Plex中的视频命令，通过伪彩色标度显示数据集内的连续帧，伪彩色标度根据荧光强度的最大和最小变化进行调整。使用高分辨率相机和60倍物镜对经DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q染色的肠肌神经丛制备样本中的一个神经节进行成像。在数据采集期间，样本受到一串5次脉冲、频率为40赫兹的刺激。

每个脉冲的幅度为15毫安，持续时间为0.5毫秒。确定了四个感兴趣区域（ROIs），并生成了轨迹，以显示在伪彩色帧序列中选定区域内的光学数据平均值。膜去极化的首个光学响应区域中，指示神经元活动的部分呈现为黄色至红色。这些数据表明，刺激诱发的活动出现在每个神经节的特定区域，主要由穿行轴突介导。ROI 2、ROI 3和ROI 4分别标识了距离ROI 1不同距离的单个神经元。

图二以10倍放大倍数展示了信息可能传播的解剖通路，箭头指示了刺激激活所鉴定的肌间神经节所遵循的方向。我们刚刚向您展示了用于记录电压敏感性染料电活动的光学装置的组成部分，以及当该技术应用于肠神经系统时，如何在显微镜视野下研究两个完整哺乳动物神经网络内部及之间的功能连接性。使用光学记录技术时，对细节的关注极为重要。

必须严格控制噪声来源，包括光学、机械和电学方面的干扰，同时需要精心维护样本的生理状态。因此，熟练掌握本实验方案中的每一个步骤，对于实现光学记录的成功至关重要。以上就是全部内容。

非常感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。