Name: 在豚鼠肠道网络，利用电压敏感染料光学记录的电活动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-04T17:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 学习利用电压敏感染料对豚鼠肠道神经网络进行光学记录电活动的方法。该技术可记录肠神经系统中单个细胞至多神经节回路的电生理信号，为研究胃肠道神经功能提供高分辨率成像方案。

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我们感谢CHOP的D.A. Coulter允许我们使用他的双光子显微镜获取视频开头所示的双光子图像，并感谢H. Takano与我们分享他的专业技术知识。

第1部分：组织制备
<ol>
<li>通过连续解剖150-200克（2-3周龄）哈特利豚鼠的小肠，分离获得黏膜下神经丛和肌间神经丛标本。豚鼠通过吸入异氟烷麻醉后断头处死。安乐死后，取出小肠，并用预热的含氧溶液冲洗肠腔以清除内容物。我们使用M199培养基，添加25 mM HEPES、5 mM NaHCO3 和2 mM谷氨酰胺，并将pH调节至7.4（以下简称M199-DM），该溶液已预热至37 °C。然而，后续所有操作步骤均在室温下进行。</li>
<li>取一段8-10厘米长的肠段，转移至盛有M199-DM的硅胶培养皿中，沿肠系膜缘剪开，并用昆虫针将黏膜面朝上固定。保持均匀张力极为重要，固定后的组织应呈矩形，黏膜绒毛排列整齐。</li>
<li>使用尖端平直的精细Dumont镊子，几乎水平操作，从标本一端夹住绒毛，沿组织纵轴轻轻拉扯，即可轻松剥离黏膜。当样本被均匀固定时，可在几次操作中分离出条带状的黏膜，暴露出含有黏膜下神经节和黏膜下血管的黏膜下层。</li>
<li>对于神经丛的精细解剖，我们建议使用配备暗场照明的解剖显微镜。这种照明方式产生的伪三维效果有助于区分各组织层，从而避免或尽量减少器械对组织的损伤。</li>
<li>制备黏膜下层标本时，我们采用Hirst和McKirdy4的经典方法，具体步骤如下：a）沿环形肌纤维走向在黏膜下层做一切口，可使用极精细的剪刀（如Moria MC19或其等效产品）完成；b）用精细镊子非常轻柔地提起黏膜下层，同时用精细剪刀将环形肌层向下推压；c）随着分离进展，沿纵向边缘剪开，使黏膜下层与其余组织分离；d）在距离第一切口一定位置处，沿环形肌纤维方向做第二次切口，以确定最终黏膜下层标本的大小。所得黏膜下层片段仅厚30至50 μm，呈薄纱状，可转移至另一盛有新鲜M199-DM的硅胶培养皿中，轻轻且无张力地固定，并置于充氧环境中备用。</li>
<li>原始肠段在去除黏膜和黏膜下层、暴露环形肌后，仍可用于制备肌间神经丛标本。为暴露肌间神经丛，需尽可能去除环形肌层。此步骤可使用前述相同平头精细镊子完成。先从标本一侧，再从另一侧轻柔地拉去肌纤维束。暴露的肌间神经丛无法与纵行肌层及下方的浆膜分离。因此，“肌间神经丛标本”指的是可沿固定针剪下的组织段。由于其含有活体肌肉，建议将其非常松弛地固定于盛有充氧M199-DM的培养皿中，直至生理实验开始。</li>
<li>由于黏膜是肠神经系统（ENS）的主要感受器，且所有效应器均嵌于肠壁内，因此可制备保留完整反射通路的半完整标本。这些“定制化”标本需结合1.3至1.6节所述步骤，应用于分离肠段的相邻区域。</li>
<li>在正式进行光学实验前几分钟，将选定标本安装至实验腔室，确保张力分布均匀，组织完全平整贴附于硅胶底部。可通过多个极细的固定针在标本周围均匀固定，避免造成组织损伤。</li>
</ol>
第二部分：光学记录用组织样本的制备
<ol>
<li>（可选）为防止染料与残留的平滑肌和结缔组织结合而产生背景荧光，可将分离的神经丛在含胶原酶VII（≤50 U/ml）和蛋白酶IX（≤0.5 μg/ml）的M199-DM培养基中孵育30–60分钟。酶处理后，组织样本应使用M199-DM清洗，并在含10%动物血清（如马或牛血清）及抗生素（青霉素100 U/ml；链霉素100 μg/ml）的M199-DM培养基中于95% O2 和5% CO2 饱和的培养环境中过夜维持。该步骤我们已使用多年，因其显著提高光学记录的信噪比，但对于初学者可能并不适用，应谨慎采用。事实上，在解剖过程中受损的组织样本在酶处理期间存在解体的风险。然而，即使不进行酶处理，我们也建议将组织样本在含血清和抗生素的M199-DM培养基中过夜维持，此步骤有助于急性解剖损伤后的组织修复，并提高样本的透明度。</li>
<li>在肌肉持续收缩的组织样本中无法实现电活动的光学记录。因此，在记录肌间神经丛时，为防止肌肉收缩，我们建议在光学实验开始前数分钟向浸泡组织的M199-DM培养基中添加2 μM硝苯地平。</li>
</ol>
第3部分：使用di-4-ANEPPDHQ染色
<ol><li>Di-4-ANEPPDHQ 可以以冻干粉形式从商业渠道获得。我们建议将其溶于纯乙醇中，配制成高浓度的储备液（例如 15–20 mg/ml）。该储备液在 -20°C 条件下保存时极为稳定。事实上，我们实验室最近用完了近六年前配制的一批染料储备液的最后一滴。</li>
<li>染色液应使用 M199-DM 配制，若实验方案需要，应添加 2 μM 的硝苯地平。染料的终浓度可低至 5 μg/ml，但不应超过 50 μg/ml。然而，由于储备液浓度不同，染色液中将含有一定量的乙醇，这一点需加以考虑。例如，若使用 15 mg/ml 的储备液配制含 50 μg/ml 染料的染色液，则其中乙醇含量约为 0.3%；而若储备液浓度仅为 5 mg/ml，则乙醇含量接近 1%。</li>
<li>染色时，将组织样本浸入染色液中 10–30 分钟。染色结束后，洗去染料并更换为新鲜的、充氧 M199-DM。由于 Di-4-ANEPPDHQ 是一种不能穿透细胞膜的染料，仅在脂质环境中才会产生荧光，因此经染色的肠神经系统样本中健康的神经元应呈现为空心气球状。</li>
</ol>
第4部分：电刺激
<ol>
<li>刺激可通过电压或电流驱动。我们采用电流刺激，由计算机控制的四通道刺激器提供，每个通道最大输出为 16 mA。</li>
<li>实验中所用电极的型号取决于实验目的。当目标是刺激特定神经元时，可使用细胞内移液管或膜片电极。当需要激活某一神经节中的多个神经元时，可使用接触神经索的细胞外电极。为了研究相互连接的神经节，可采用大尺寸、低电阻电极和/或多通道电极阵列；然而，由于我们通常采用电流刺激，多通道电极阵列成为唯一选择。多种型号的细胞外电极以及部分线性电极阵列均可从商业渠道直接获得。</li>
<li>电极可通过不同类型的显微操作器进行定位。为避免细长套管引起的振动，我们倾向于使用带磁性底座的小型显微操作器，将其置于实验槽附近，并用细而刚性强的金属杆支撑钨电极的柔性套管。</li>
</ol>
第5部分：灌注
我们使用一个双通道蠕动泵，其中一个通道用于输入含氧溶液，另一个通道用于输出。为了消除灌流引起的机械干扰，在采集光学数据期间会关闭泵。
第6部分：用于多点膜电位光学记录的装置
<ol>
<li>光学组件： 
 用于膜电位多点光学记录的装置包括 NeuroCCD-SM 相机（RedShirtImaging）和安装在直立显微镜三目镜筒上的 1:10 减倍镜/中继透镜。显微镜安装在 X-Y 平移台上，独立于固定在主动隔振台顶部的样品台。为最大限度减少空气中的振动干扰，整个装置被厚重的声学帘幕和聚酯薄膜顶棚包围。透射照明由一个 100 W 钨卤素灯提供，该灯由超低纹波反馈稳压电源供电。入射光通过热滤光片、高 Q 值干涉滤光片（HQ530/50）和 565 nm（50% 透光率）二向色镜实现准单色化。荧光发射光通过二向色镜和长通滤光片（HQ572LP）分离。入射光强度通过中性密度滤光片进行调节。透射照明用于样本的明场观察，由第二个 100 W 钨卤素灯提供，该灯由 0–55 V、1–10 A 电源驱动，无需具备特殊性能。 </li>
<li>高速相机规格： 
 NeuroCCD-SM 相机的电子设计和性能特征已有详细描述3。简而言之，它是一款冷却型、低分辨率、高精度高速相机，采用背照式、薄化型 Marconi CCD39-01 芯片（80×80 像素）。模数转换为 14 位，全帧速率为 2 kHz。然而，根据特定需求，可通过多种像素合并模式或减少有效像素数量，将帧率提高至最高 10 kHz。该相机具有极低读出噪声的重要优势（2 kHz 时为 23 个电子，1 kHz 时为 9 个电子）。此外，其像素具有相对较大的阱深（215,000 个电子），可在高帧率下允许中等光强照射。 </li>
<li>数据采集与分析软件： 
 光学实验由 Neuroplex 软件控制，该软件由 RedShirtImaging 提供，作为 IDL 平台（交互式数据语言）中的应用程序运行，具备光学数据采集、显示和分析所需的多种功能。 </li>
<li>附加相机： 
 作为装置的组成部分，显微镜三目镜筒上的分光镜将样本图像投射至第二台高分辨率 CCD 相机，该相机连接至图像采集卡。图像通过 Global Lab Image/2 软件采集和存储，可叠加在 NeuroCCD-SM 相机捕获的亚毫秒级时间分辨光学信号显示画面上，从而生成光学记录电压信号空间来源的精确图谱。在本实验室中，该相机的图像采集卡位于与功能数据采集计算机不同的另一台计算机中。因此，图像文件需在两台计算机之间传输，并在实现两台相机图像完美配准前，对高分辨率图像的尺寸和位置进行微调。</li>
</ol>
第7部分：光学实验
<ol>
<li>每次功能记录之前，我们通过光学手段获取计划记录电活动区域的高分辨率黑白图像（如6.4节所述）。当该图像叠加到高速相机的像素图上时，有助于我们识别产生光学信号的结构。</li>
<li>在适当的系统配置下，Neuroplex（见6.3节）还可控制快门并触发电刺激。由于高速数据采集需要较大的计算机运算能力，因此建议尽可能使用配备大容量内存和高容量硬盘的专用计算机。然而，这并非易事。例如，我们自己的系统已使用多年，所采用的数据采集板过大，无法安装在当前主流的计算机中。作为折中方案，我们专门配置了一台戴尔Precision 390计算机，配备500 GB硬盘和4 GB内存。该计算机使我们能够继续使用较旧但性能足够的A/D和D/A采集板，同时仍具备足够运算能力以支持实验运行。</li>
<li>一旦数据采集完成，Neuroplex即可以多种互补格式显示结果，部分格式详述如下：
<ol class="lalpha">
<li>屏幕上一个称为“页面显示”的区域，可显示由80×80高速相机捕获的样本原始图像的单帧画面。将第二台相机获取的高分辨率图像（如6.4节和7.1节所述）叠加至该像素图上，可进一步提升操作者识别感兴趣区域的能力。</li>
<li>当通过鼠标选中“页面显示”中的特定像素时，Neuroplex会自动将其光学输出转换为曲线，显示这些像素随时间记录的光学变化幅度（例如，ΔF/F随时间的变化）。操作者可选择这些曲线反映单个像素的输出，或反映样本特定区域内多个位点的空间平均输出。</li>
<li>数据亦可以视频格式显示。 
 然而，为确保从每次实验运行中充分提取所有信息，我们更倾向于对光学数据进行离线分析。此类分析的代表性结果可提供参考。</li>
</ol>
</li>
</ol>
第8部分：如何在光学实验中实现技术质量
光学实验的技术成功最终由记录信号的信噪比来衡量。此外，良好的信噪比并非源于灵光一现，而是源于一个持续改进的过程。如同歌剧演出一样，最终效果取决于多种因素的协同作用。因此，要实现技术上可靠的光学实验，必须独立优化光学装置以及实验方案中每一步骤所需的操作技能。以下是可能存在问题的几个方面，以及一些避免未预料问题的建议5：
<ol>
<li>噪声来源 
 在使用电压敏感性染料记录电活动时，机械和光学稳定性至关重要，因为反映生理反应的相对变化（ΔF/F）相对较小（在大多数肠道记录中&lt; 10% / 100 mV），而噪声信号通常预示着不良结果。因此，为了优化信噪比，必须消除或至少最大限度地减少两大主要干扰源的影响：a) 机械振动，以及 b) 光源波动。 
 <ol class="lalpha">
 <li>机械振动可能由多种因素引起，包括实验装置的配置、建筑物的稳定性、附近电动设备、气流、声学噪声、液体流动或漂浮在灌流液中的颗粒。良好的隔振系统，以及在极端情况下使用隔音帘（例如，参见5.1节中的描述），可显著改善实验条件，其成本投入是值得的。此外，一些常识性措施也非常有效，例如对实验所用溶液进行过滤，或在装置的小型可移动部件上使用磁性底座。</li>
 <li>光源在接近最大强度时最为稳定。因此，应为电源设置电流限制，并在必要时通过在光路中插入中性密度滤光片来降低光强，而不是通过降低电压来实现。弧光灯本质上噪声较大。相比之下，钨卤素灯或发光二极管（LED）更加稳定，应作为首选光源6。 </li>
 </ol>
 </li>
<li>动物年龄 
 解剖应使用年轻动物的肠道组织，因为随着年龄增长，肠道内的结缔组织会变硬，使得在不严重损伤两个神经丛中神经元的情况下分离各组织层变得更加困难，而这些神经元的传入和传出纤维可能跨越组织层边界，或沿肠道纵轴延伸较长距离。当研究目标为神经节内连接时，此建议可适当忽略；但当实验目的为分析神经节间回路或激活反射通路时，该建议极为重要。 </li>
<li>染料内化 
 应尽可能使用最低浓度的染料，并尽量减少不必要的光照暴露。尽管di-4-ANEPPDHQ已被证明比其他染料光毒性更低，但随着组织状态的恶化，染料最终仍会被细胞内化。染料内化会显著增加背景荧光，从而降低信噪比3。 </li>
<li>电极维护 
<ol class="jove_lalpha">
<li>每次实验后应仔细且彻底清洗电极。钨电极尖端的有机沉积物会增加电极电阻，妨碍刺激效果。</li>
<li>市售钨电极的绝缘层非常脆弱，容易受损。绝缘层破损会导致电流分流，削弱刺激效果，并危及实验的成功。 </li>
</ol>
</li>
<li>灌流风险 
 灌流过程中切勿离开实验装置无人看管。如果蠕动泵的进液和出液流量未正确平衡，可能发生两种灾难性事件：
<ol class="lalpha">
<li>溢出可能导致显微镜遭受不可逆损坏。</li>
<li>组织标本可能在实验过程中干涸。 </li>
</ol>
</li>
<li>软件问题 
 必须熟悉控制数据采集与分析的软件。高速数据采集和/或生成非常大的文件容易使系统接近崩溃边缘，而Neuroplex软件容错性较差，若不遵守其运行边界条件，将频繁崩溃。当分析仅局限于有限的兴趣区域时，记录中的细微特征可能被忽略，而通过数据的视频显示则常常能揭示这些细节。</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, L. eonard R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCosta%2C+Marcello+%22in+Physiology+of+the+Gastrointestinal+Tract%2C+edited+by+Leonard+R%22">in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R</a>. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).</li>
<li>Obaid, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterns+of+activity+in+an+intact+mammalian+network+with+single-cell+resolution%3A+optical+studies+of+nicotinic+activity+in+an+enteric+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus.</a> J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).</li>
<li>Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+naphthylstyryl-pyridinium+potentiometric+dyes+offer+advantages+for+neural+network+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis.</a> J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).</li>
<li>Hirst, G. D., McKirdy, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+potentials+recorded+from+neurones+of+the+submucous+plexus+of+guinea-pig+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine.</a> J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).</li>
<li>Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Methods+in+Cellular+Neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Current Methods in Cellular Neurobiology.</a> Barker, J., McKelvy, J. , John Wiley and Sons, Inc. New York. 139-139 (1983).</li>
<li>Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-stable+non-coherent+light+source+for+optical+measurements+in+neuroscience+and+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).</li>
<li>Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+studies+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subtypes+in+the+guinea-pig+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system.</a> J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).</li>
<li>Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+with+single+cell+resolution+from+a+simple+mammalian+nervous+system%3A+Electrical+activity+in+ganglia+from+the+submucous+plexus+of+the+guinea-pig+ileum%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum.</a> Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).</li>
<li>Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+impulses+in+individual+neurones+of+an+invertebrate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system.</a> Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).</li>
</ol>

本方案的撰写基于两个目标。第一个目标是说服其他研究者：得益于过去十年中的众多技术进步，利用电压敏感染料进行电活动的光学记录已成为研究完整神经网络最强大、最可靠且成本较低的方法之一；事实上，即使资源有限的实验室也能轻松实施该技术。第二个目标是推广肠神经系统作为一种独特的实验模型，可用于关联分子与细胞事件和两个神经丛的电活动行为及其生物学输出。

<table><tbody><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3769</td><td>含 Earle&amp;rsquo;s 盐，不含 L-谷氨酰胺、酚红和碳酸氢钠</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184 硅酮弹性体试剂盒</td><td></td></tr><tr><td>用于解剖的昆虫针</td><td>F.S.T.</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子</td><td>F.S.T.</td><td>11203-23 或 11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Moria MC19/B Pascheff-Wolff 弹簧剪刀</td><td>F.S.T.</td><td>15371-92</td><td></td></tr><tr><td>实验过程中固定组织用针</td><td>Seirin Corp.</td><td>Seirin Spinex</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 VII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0773</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 IX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6141</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10439-016</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（PenStrep）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 100X</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>硝苯地平</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-4-ANEPPDHQ</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D36802</td><td></td></tr><tr><td>四通道刺激发生器</td><td>Multi Channel System MCS GmbH</td><td>2000 系列</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Rainin</td><td>双通道 Dinamax RP-1</td><td></td></tr><tr><td>高速相机</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>1:10 减倍镜 / 中继透镜</td><td>Optem, Qioptiq Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正置显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61TRF</td><td></td></tr><tr><td>带电动 X-Y 平移台的 Gibraltar 固定载物台</td><td>Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada</td><td>PSSG--BX2</td><td></td></tr><tr><td>线性矩阵电极</td><td>FHC, Inc.</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>主动隔振台</td><td>Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA</td><td>Micro 60</td><td></td></tr><tr><td>超低纹波反馈稳压电源</td><td>Kepco, Flushing, NY</td><td>ATE 75-15M</td><td></td></tr><tr><td>热滤光片</td><td>Schott AG</td><td>KG-1</td><td></td></tr><tr><td>高Q值干涉滤光片</td><td>Chroma Inc.</td><td>HQ530/50</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Chroma Inc.</td><td>565 nm（50% 透射率）</td><td></td></tr><tr><td>长通滤光片</td><td>Chroma Inc.</td><td>HQ572LP</td><td></td></tr><tr><td>声学窗帘</td><td>Acoustical Surfaces, Inc.</td><td>BSC-25</td><td></td></tr><tr><td>Neuroplex</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDL</td><td>ITT Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高分辨率 CCD 相机及其独立的相机控制器</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高分辨率相机用图像采集卡</td><td>Data Translation</td><td>DT3120K-1</td><td></td></tr><tr><td>高分辨率相机成像软件</td><td>Data Translation</td><td>Global Lab Image/2</td><td></td></tr></tbody></table>

使用电压敏感性染料对豚鼠肠神经系统网络中的电活动进行光学记录

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

肠神经系统（ENS）是一个具有明确功能的自含式神经网络，能够在隔离状态下执行复杂行为。其神经元（直径为10至25 μm）排列成神经丛，局限于肠壁的不同平面内。1; 肌间神经丛位于纵行肌层与环形肌层之间，黏膜下神经丛则位于环形肌层与黏膜之间。由于这些神经丛的效应系统（转运性上皮、内分泌细胞、免疫成分、血管和平滑肌）也包含在肠壁内，因此可以制备出保留不同反射通路各个独立组分的半完整标本。效应系统的活动由黏膜下神经丛和肌间神经丛协同调控。因此，要理解胃肠道的正常功能，必须深入了解神经节内及神经节间的突触相互作用，以及不同神经丛之间的通信机制。肠神经系统（ENS）作为一个完整的神经系统，是一种独特的实验模型，可用于将分子和细胞事件与神经网络的电活动及其生理输出相关联。由于其神经丛具有准二维结构，肠神经系统特别适用于利用电压敏感性染料进行多点光学记录技术来研究神经网络。2,7,8,9. 我们将在此介绍一种相对较新的萘苯乙烯基吡啶𬭩染料（di-4-ANEPPDHQ）的使用方法3具有比其前代染料更多的优势，包括极低的光毒性、缓慢的内化速率以及卓越的化学稳定性。当与能够实现亚毫秒级时间分辨率的相机联用时，该染料可使我们以100倍放大下约2.5 μm的最大空间分辨率，监测视野中所有神经元的电活动。在较低放大倍数（10倍或20倍）下，尽管牺牲了单细胞分辨率，但获得了更广阔的视野，从而揭示了神经节间环路的复杂结构。

本方案展示了电压敏感染料如何实现对完整神经网络（如豚鼠肠神经系统中的神经丛）电活动的光学记录，其分辨率可调，范围从单个细胞到多神经节环路。

肠神经系统（ENS）是一个具有明确功能的自含式神经网络，能够在隔离状态下执行复杂行为。其神经元……

本视频演示了使用出生时即具荧光特性的会阴电压敏感染料 D four A-N-E-P-P-D-H-Q，对经电刺激的肠神经系统标本进行解剖及后续成像的过程。取自安乐死后的豚鼠的一小段肠道被分离，通过解剖依次暴露黏膜下层，最终暴露肌间神经丛，以进行光学记录。在获取初始高分辨率图像后，将电极放置于已固定并用 D four A-N-E-P-P-D-H-Q 染色的组织上。使用高速相机记录反映电活动的光学变化。在高速采集过程中施加电刺激。然后将高分辨率图像叠加到高速相机的像素图上，利用Neuro Plex进行分析。您好，我是布莱恩·萨尔茨伯格（Brian Salzberg），宾夕法尼亚大学神经科学系细胞光学实验室（我们喜欢称之为 loco）的主任。我叫阿纳莉亚·奥比德（Analia Obide），也是细胞光学实验室的成员。今天，我们将向您展示一种使用电压敏感染料记录完整哺乳动物神经元网络电活动的方法。我们利用该方法研究构成肠神经系统（也称为“第二大脑”或“肠道大脑”）的两个神经网络内部及之间的神经元连接性。现在，让我们开始吧。开始制备黏膜下层和肠肌间神经丛标本时，取一只经异氟烷吸入麻醉并断头处死的150至200克或出生两周至三周的哈特利豚鼠，切除其小肠。随后用温热的含氧M199 DM溶液冲洗肠腔，以清除肠道内容物。截取一段8至10厘米长的小肠节段，并注意保持其极性。将其转移至含有室温 M199 培养基的 10 厘米萨氏（Sard）涂层玻璃培养皿中。将培养皿置于配备暗场照明的解剖显微镜下，然后使用剪刀切开肠系膜边缘，并用昆虫针将肠段固定，使黏膜面朝上。保持均匀的张力至关重要，以便在固定组织后，黏膜绒毛呈规则排列，组织呈现矩形形态。使用直头精细杜蒙镊子时，应使其接近水平位置。从肠段一端夹住绒毛（VII），沿组织的纵轴方向牵拉，从而剥离黏膜。持续分离黏膜条带，以暴露含有黏膜下神经节和黏膜下血管的黏膜下层。接下来，使用非常精细的剪刀，沿环形肌纤维的走向在黏膜下层进行剪切。然后用精细镊子非常轻柔地提起黏膜下层，同时用剪刀将环形肌层向下推压，并沿纵向边缘继续剪开。随着分离的进行，将黏膜下层从其余组织中游离出来。接着，沿环形肌纤维的走向，在距离第一切口1.5至3厘米处做第二个切口，以确定黏膜下层组织的最终大小；所得的黏膜下层片段厚度为30至50微米，呈半透明薄膜状。将其转移至另一含有新鲜M1 99 DM的Sylguard培养皿中，并轻轻固定，避免张力。然后将培养皿置于室温下的充氧环境中以备后续使用。此时，原始肠段的黏膜层和黏膜下层应已被去除，暴露出环形肌层。该肠段现可用于制备肌间神经丛，以暴露肌间神经丛。使用直头精细镊子从标本两侧剥离纤维束，尽可能去除环形肌层。暴露的肌间神经丛无法与纵行肌层及下方的环肌层（CI）分离。将肌间神经丛标本转移至一个新的涂有沙尔德（sard）的培养皿中，内含充氧的M199培养基。然后松散地用针固定含有活体肌肉的标本。在进行光学实验前几分钟，将标本转移至另一个已盛有M199 DM培养基的较小涂有沙尔德（syl guard）的培养皿中，培养基中含2 µM的尼非（nefe）以防止肌肉收缩，并仔细地在标本周围放置多枚极细的固定针，将其牢固固定。确保张力均匀分布，且组织完全平整地贴在硅胶护板底部。此时组织样本已准备好用于生理学实验。在玻璃小瓶中，用含2微摩尔硝苯地平的M199培养基配制5至50微克/毫升的DAI四A-N-E-P-P-D HQ储备溶液，并用铝箔包裹避光。来自储备液的乙醇应占溶液的比例小于0.5%，将覆盖在标本上的含硝苯地平的M1 99 DM溶液替换为配制好的染料溶液。加入足够体积的染料溶液以完全覆盖组织，室温孵育10至30分钟。孵育结束后，用充氧的M1 99 M加NEFE溶液完全更换灌流 chamber 中的内容物，洗涤标本。对电刺激标本中神经元活动的光学记录采用一套系统完成，该系统包括一台配备图像分光器的直立式落射荧光显微镜、一台低分辨率高精度高速相机、一台高分辨率黑白相机、一台由计算机控制的刺激发生器以及一台微操纵器。整个装置安装在主动隔振台上，并由厚重的隔音帘和聚酯薄膜顶棚包围，以最大限度减少空气传播的振动。尽管可使用一台运行 Neuro Plex 和 Global Lab Image 2 或其他任何图像采集软件的计算机同时从两台相机获取图像，但此处所示的配置采用两台计算机，分别控制各自的相机以启动光学实验。将含有染色后富集样本的腔室置于显微镜载物台上。由于D四A和EPPD HQ是一种膜非永久性染料，仅在脂质环境中才会产生荧光，因此来自染色肠神经丛制备样本的健康神经元在20倍以上任何放大倍数下观察时，应呈现为空心气球状。使用激发滤光片HQ 5 35 50、发射滤光片HQ 5 72 LP四和5 65纳米二向色镜。接下来，使用显微操作器控制将多通道线性矩阵阵列电极置于组织的口端，确保电极远离显微镜物镜。一种在一厘米范围内分布有10根钨电极的线性矩阵阵列，能够同时激活多条独立的神经通路，非常适合用于研究相互连接的神经节环路。然而，在本研究的代表性数据中，我们使用了一种自制的双导线刺激电极。在进行功能记录之前，使用粘蜡将接地电极放置在记录 chamber 的另一端，并获取待记录电活动区域的高分辨率黑白图像，以辅助可视化。灰度模式可反转，使荧光呈现为暗色。若需使用计算机控制的刺激发生器施加电流刺激，应首先通过选择适当的强度、持续时间、频率和刺激次数，以及相对于光学数据采集开始时间的延迟，对设备进行编程设置。为确保刺激发生在光学数据采集的时间范围内，需将刺激发生器配置为神经记录系统（neuro plex）控制的设备。接下来，在神经记录系统中设置采集参数，包括帧率、帧数和相机增益。为完整记录动作电位的全过程，帧率应至少设置为每秒一千赫兹（1 kHz）。由于D四A和E-P-P-G-H-Q在去极化时荧光强度的降低与电压变化呈线性关系，因此在Neuro Plex中反转光学信号的显示，以使动作电位不会显示为倒置。开始采集。在进行每一项功能记录之前，请务必先为每个视野采集一张新的高分辨率黑白图像。采集完成后，使用 Neuro Plex 离线分析结果。屏幕上一个称为“页面显示”的区域会显示由 80×80 高速相机捕获的制备样本的原始图像，表现为单帧图像。当页面模式设置为“绝对帧叠加”时，通过 Neuro Plex 显示命令，将第二台相机获取的高分辨率图像叠加至原始图像的像素图上。这需要将页面模式从绝对轨迹更改为轨迹模式，并在显示命令中选择叠加图像。使用鼠标从页面显示的图像中选择单个像素或像素组。这些感兴趣区域的输出将以轨迹形式显示在轨迹显示窗口中，反映出这些像素随时间记录的光信号变化幅度。在高分辨率图像中反转灰度可改善迹线模式页面显示的可视化效果，强烈建议显示刺激器的模拟输出。选择模拟输出通道以包含在迹线显示窗口中。该输出可指示实验期间施加刺激的精确时间。要将数据以视频形式查看，可使用神经丛（neuro plex）中的视频命令，通过伪彩色标度显示数据集内的连续帧，伪彩色标度根据荧光强度的最大和最小变化进行调整。使用高分辨率相机和60倍物镜对经DIA四A-N-E-P-P-D-H-Q染色的肠肌神经丛制备样本中的一个神经节进行成像。在数据采集过程中，以40赫兹频率的五次脉冲串刺激样本。每个脉冲的幅度为15毫安，持续时间为0.5毫秒。确定了四个感兴趣区域（ROIs），并生成了轨迹，以显示在伪彩色帧序列中选定区域上的光学数据平均值。膜去极化的首个光学响应区域（表明神经元活动）呈现为黄色至红色。这些数据表明，刺激诱发的活动出现在每个神经节的特定区域，主要由穿行轴突介导。ROI 2、ROI 3和ROI 4分别标识了距离ROI 1不同距离的单个神经元。图二以10倍放大倍数展示了信息可能传播的解剖通路，箭头指示了刺激激活所鉴定的肌间神经节所遵循的方向。我们刚刚向您展示了用于记录电压敏感性染料电活动的光学装置的组成部分，以及当该技术应用于肠神经系统时，如何在显微镜视野下研究两个完整哺乳动物神经网络内部及之间的功能连接性。使用光学记录技术时，对细节的关注极为重要。噪声来源，包括光学、机械和电学方面的干扰，需要严格控制，同时必须精心维持样本的生理状态。因此，熟练掌握本实验方案中的每一个步骤，对于实现光学记录的成功至关重要。以上就是全部内容。非常感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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生物学

在豚鼠肠道网络，利用电压敏感染料光学记录的电活动

本文介绍了利用荧光电压敏感染料对蟹类口胃神经节神经元的详细活动进行快速、高分辨率成像的方法。...

使用电压敏感性染料对蟹类口胃神经节中神经元进行光学成像

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逆行荧光标记可实现对已鉴定神经元的靶向细胞外单单位记录 体内

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脑片中单个神经元轴突、树突及树突棘的电压敏感染料记录

本视频演示了一种通过使用电压敏感染料染色的脑片来观察神经元活动变化的方法。该染料通过改变其荧光强度来反映神经元膜电位的变化。通过施加电刺激并结合先进的成像技术，该方法能够基于电压敏感染料的荧光信号实现对神经元膜电位实时变化的可视化追踪。...

使用电压敏感染料染色的脑片中神经元活动的光学记录

本视频展示了一种在离体大鼠结肠上记录结肠传入神经活动的方法。结肠两端被插管并灌注生理盐水以增加腔内压力。随着压力升高，神经信号增强，表明神经受到刺激。...

离体大鼠结肠中结肠传入神经的电生理记录

肠神经系统（ENS）是位于肠壁内、控制肠道反射的一组神经元和胶质细胞网络。本方案描述了利用钙离子（Ca2+）成像技术在活体 ENS...

原位 Ca2+ 成像技术用于肠神经系统研究

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使用电压敏感性染料在脑片中进行全场单光子光学记录

本方案详细介绍了如何实施和进行多光纤光度记录，如何校正钙离子非依赖性伪影，以及双色光度成像的重要注意事项。...

用于记录自由活动动物神经活动的多光纤光度法

本方案介绍了一种利用吸收型电压敏感染料和光电二极管阵列，在非转基因无脊椎动物物种中以单细胞分辨率成像神经元群体活动的方法。该方法可实现快速的工作流程，可在一天内完成成像与分析。...

基于光电二极管的光学成像技术用于在非转基因无脊椎动物中以单神经元分辨率记录神经网络动态

本文介绍了一种在小型猪模型中对柔性硬膜下电极阵列进行长期性能与安全性评估的方法，详细描述了手术方法与工具、术后磁共振成像、听觉皮层的电生理学特性、植入物的电化学特性以及死后免疫组织化学分析。...

皮层下柔性脑皮层电图（ECoG）阵列植入及小型猪长期皮层记录

学习利用电压敏感染料对豚鼠肠道神经网络进行光学记录电活动的方法。该技术可记录肠神经系统中单个细胞至多神经节回路的电生理信号，为研究胃肠道神经功能提供高分辨率成像方案。

使用电压敏感性染料对豚鼠肠神经系统网络中的电活动进行光学记录

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