人类DNA修复蛋白的遗传研究利用酵母作为模型系统

WRN 质粒用限制性核酸内切酶细胞 1 和 MLU 1 消化，并从凝胶中纯化片段。这些表达载体与细胞 1 至 MLU 1 的 WN 片段一起消化，然后连接到细胞 1 至 MLU one 的酵母载体位点。多拷贝质粒还包含一个 TRP one 可选标记物。

按照标准方案将 W Rrn 构建体转化到酵母中，并在缺乏色氨酸的合成完全葡萄糖培养基上选择转化体。然后将单个转化体划线到缺乏色氨酸的合成完全葡萄糖培养基上，并从主板孵育板。为了分析 WRN 转化的 SGS 中缓慢生长的表型恢复，在含有葡萄糖或半乳糖的平板上划线前三个双突变菌株转化体。

为了分析 WRN 表达对 胡 和 MMS 敏感性的影响，进行点样以确定表达 WRN 的酵母细胞的细胞周期分布。进行 DAPI 染色。通过蛋白质血液分析分析异源宿主中 WRN 的表达。

大家好，我是来自美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）之一美国国家老龄化研究所（National Institute on Aging）分子老年学实验室DNA老年学实验室DNA血细胞病例科的罗伯特·布罗赫（Robert Broch）。大家好，我是 Monica Agarwal，也来自美国国家老龄化研究所分子遗传学实验室的 DNA Heli 病例科。了解人类 DNA 修复蛋白和遗传途径的作用对许多研究人员来说是一个负担得起的挑战。

由于缺乏现成的工具，包括突变遗传细胞系、调节表达系统和适当的可选标记，哺乳动物系统中的遗传研究受到限制。今天，我们将向您展示以酵母为模型系统的程序，以研究称为解旋酶的 DNA 解旋酶在预防过早衰老方面的分子和细胞功能。我们在实验室中使用这些程序来遗传表征人类燃烧器基因产物的作用，该基因产物在 DNA 修复和维持过早衰老疾病中的基因组稳定性方面存在缺陷。

Werner 综合症 Werner 是东部五个人类 req 家族 heli 病例之一。只有一个名为 sgs 的 one，用于研究人类 Werner 在复制应激反应中的作用。我们已经检查了 Werner 在东部突变体背景中的表达对各种生物学终点的影响。

所以，让我们开始吧。由于我们将使用酵母作为异源宿主，因此我们的第一步是将人类 Werner 基因或其变异克隆到酵母载体中。用限制性核酸内切酶 Sal 1 和 MLU one 消化 Werner 质粒，并在其中纯化片段，然后连接到酵母表达载体的 Sal one MLU one 位点，该位点在加仑诱导启动子的调节下。

多拷贝质粒还包含一个 TRP one 可选标记物。然后将这些 Werner 表达质粒转化到本研究中使用的适当色氨酸热带酵母菌株中。通过将悬浮液接种在合成的完全葡萄糖培养基上来选择转化体。

缺乏色氨酸的 30 摄氏度孵育板 3 到 4 天，直到菌落出现。一旦菌落长出条纹，在合成完全葡萄糖培养基上放置单个转化体，并在 30 摄氏度下孵育板 2 到 3 天。然后通过以下各节中演示的技术研究表达人 weer 基因及其变体的突变体 ye 菌株的细胞表型。

前三个突变体显示出严重的生长缺陷。然而，SGS one 基因的突变抑制了前三个突变体的缓慢生长表型，以检查 Werner 表达对野生型 S Gs one 或 S Gs one 生长的影响，前三个菌株将带有载体或 Werner 表达质粒的相应菌株划线到缺乏色氨酸但含有 2% 葡萄糖或 2%gala 乳糖作为阳性对照的合成完全培养基板上。测定 SGS 一表达的效果 在 30 度孵育板中孵育两天。

用载体或 Werner 转化的野生型和 SGS 一个突变菌株的生长模式没有显示出任何差异。然而，Werner 转化的 SGS 一个前三个双突变菌株的生长速度明显慢于 S GS 一个用载体转化的前三个双突变菌株，以评估 Warner 恢复缓慢生长表型的功能要求。在 sgs 中，一个前三个背景条纹，sgs 一个前三个菌株，用 Warner 催化结构域突变体转化到缺乏色氨酸（含有 2%葡萄糖或 2%半乳糖）的合成完整板上两天后。

孵育 Werner 核酸外切酶突变体表示为 E 84 A 恢复了与 Werner 一样的缓慢生长表型，从而表明前三个缓慢生长表型恢复不需要核酸外切酶活性。Werner 解旋酶突变体生长良好，从而证明 Werner 解旋酶活性是前三个缓慢生长表型恢复所必需的。确定 Werner 影响 sgs 生长速率的能力。

一个蛋白质表达水平较低的前三个菌株 sg一个用载体 Werner 或 sgs 1 转化到缺乏色氨酸但含有更高浓度的半乳糖的合成完整板上。将所有板在 30 摄氏度下孵育两天。Warner 和 Warner 核酸外切酶突变体在所有水平的半乳糖水平上都具有表型，恢复前三个斜坡。

然而，Warner 解旋酶突变体没有。已经表明，SGS 一前三双突变体对 DNA 烷化剂甲烷甲烷磺酸盐或 MMS 或复制抑制剂羟基脲或 胡 的敏感性低于前三单突变体，以确定华纳表达对 SGS 一或 S GS 一前三菌株的 MMS 和 HE 敏感性的影响。在 30 摄氏度下，在缺乏色氨酸的合成完全棉子糖培养基中培养用载体或 Werner 转化的酵母菌株作为对照。

使用用载体转化的野生型亲本菌株，将所有培养物重新接种在不含色氨酸的合成完全棉子糖培养基中，并在 30 摄氏度下生长至早期对数期。当培养物处于早期对数期时，使用缺乏色氨酸斑点的合成完全培养基制备 10 倍连续稀释至 10， 000 倍这些菌株斑点 4 微升每种稀释液到缺乏色氨酸的合成完全 GAL 培养基板上含有 10 毫摩尔 胡 或 0.0025% MMS，在 30 摄氏度下孵育板四天。一个 SGS 前三双突变体，用野生型 sgs 转化。

一个在细胞周期的 SG 晚期第二阶段延迟，导致哑铃形形态。相比之下，野生型酵母完成细胞分裂，留下较少的哑铃形细胞来研究 Werner 转化的 sgs 前三菌株的细胞周期分布。首先，在缺乏色氨酸的合成完全 RAF 培养基中，在 30 摄氏度下培养以下菌株的对数生长培养物过夜。

用载体 Werner 或 SGS 1 转化的前三个和载体转化的野生型亲本菌株以 OD 0.05 重新接种培养物。重新接种后，生长培养物至 OD 0.5 并通过离心收获，然后通过添加 2% 浓度的 gala 乳糖来诱导 Werner 表达。让培养物在 30 摄氏度下生长 6 小时。

6 小时后，收获培养物，离心收集细胞。离心后将培养物转移到微量离心管中，用 PBS 洗涤细胞一次。然后在室温下将细胞在 70% 乙醇中固定 20 分钟，用 PBS 洗涤固定的细胞两次后，将细胞重悬于一个 XPBS 中。

将细胞悬液放在载玻片上并添加载体盾。用 DAPI，浓度为 1 μg/mL。在 XI Saxo vert 显微镜下检查载玻片，以寻找具有哑铃形细胞核的细胞，这是细胞周期 SG 两个阶段酵母细胞的特征。

确定 Werner 蛋白的表达或其在转化的 SGS 1 或 SGS one 前三种酵母菌株中的方差。首先在含半乳糖的培养基中培养菌株 6 小时，以诱导 Werner 蛋白的表达。通过离心收集细胞后，用 PBS 洗涤并重悬。

一种碱性裂解缓冲液。将细胞煮沸 5 分钟，然后离心澄清，并用 1 摩尔盐酸中和。这些裂解物现在可以在 8% 至 16% 聚丙烯酰胺 SDS 凝胶中进行电泳，以确定在不同浓度的半乳糖影响下 Warner 蛋白的表达水平。

首先，用不同浓度的半乳糖诱导培养物 6 小时。然后通过离心收获细胞，并将其重悬于含有蛋白酶抑制剂的河豚中。向混合物中加入 425 至 600 微米的玻璃珠，高速涡旋涡旋一分钟，然后冰冻一分钟，从而打破细胞。

重复总共八次。接下来，将所得匀浆以 15， 000 Gs 离心 5 分钟，并收集上清液组分。通过布拉德福德方法测量裂解物级分中蛋白质的量后，在 8% 至 16% 聚丙烯酰胺 SDS 凝胶上分离等浓度的蛋白质，然后通过 sgs 中的 Western blot Werner 表达测定 Werner 的表达。

如这些照片所示，前 3 名的 1 个恢复了前 3 名的缓慢生长表型。当 sgs 1 时，用载体 Werner 转化的前 3 个菌株，或在含有 2% 葡萄糖或 2% 半乳糖的 SC 色氨酸平板上转化 1 个条纹。半乳糖诱导的 Werner 表达导致 SGS 前三菌株生长更慢。

相比之下，用 Werner 转化的野生型亲本菌株或 SGS 1 菌株的生长不受影响，表明 Werner 赋予的缓慢生长是 sgs 特有的。一个前三名背景。当 SGS 1 时，用 Werner 变体转化的前 3 株菌株在仅含有 2% 葡萄糖或 2% 半乳糖的 SC 色氨酸平板上划线。

核酸外切酶死亡的 Werner 仍然能够恢复缓慢生长的表型。这表明需要 Werner ATP 酶解旋酶而不是核酸外切酶活性来恢复前三个的缓慢生长表型。在 SGS one top three 背景下，Werner 在整个 GAL 浓度范围内恢复了 SGS one top three 的缓慢生长表型。

这些结果表明，在 sgs 前三个突变体背景中缓慢生长表型的恢复发生在低 Werner 蛋白表达水平下。当对数生长的 sgs 培养物时，用 Werner 或其变体转化的前三个菌株以 10 倍连续稀释点样到含有葡萄糖或半乳糖以及 MMS 或 胡 的 SC 色氨酸板上。我们观察到 Werner 表达增加了 SGS 前三菌株的 MMS 和 2 敏感性。此外，在 SGS 前三名背景中，这种对 MMS 和 胡 敏感性的影响需要 Werner ATP 的解旋酶，而不是外显子clease 活性。

最后，Werner 表达还恢复了前 3 个细胞的特征性 SG 2 延迟，如大对接细胞群的增加所示。在 sgs 中，前 3 个表达 Werner 的突变细胞。与 sgs 相比，用载体细胞转化的前 3 个细胞用 Dabi 染色。

为了可视化细胞核，箭头表示未分裂的细胞核 Werner 表达。在转化的 sgs 中，通过添加指示的半乳糖浓度诱导前三个细胞，并在诱导后 6 小时收获细胞。将等量的总细胞裂解物上样到 8% 至 16% 聚丙烯酰胺 SDS 凝胶上，然后使用抗 Warner 抗体进行蛋白质印迹血液检测。

我们已经向您展示了如何研究与确定的酵母突变体背景相关的细胞表型，以阐明由其催化活性和蛋白质相互作用介导的人类学习者基因的细胞和分子功能。酵母可以用作模式生物来研究基因在特定途径中的功能。在进行这些程序时，选择合适的酵母突变体背景以辨别所研究的基因在确定的通路中的作用非常重要。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。