Name: 人类DNA修复蛋白的遗传研究利用酵母作为模型系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-18T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: 了解利用酵母模型系统研究人类WRN基因功能的方法。通过质粒酶切、连接转化和表型分析，探索DNA代谢与细胞衰老的分子机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作完全由美国国立卫生研究院国家衰老研究所的院内研究项目资助。我们感谢哥伦比亚大学的Rodney Rothstein博士提供的酵母菌株，以及宾夕法尼亚大学医学院（美国宾夕法尼亚州费城）的Brad Johnson博士提供的SGS1表达质粒。

1. 酵母菌株
已鉴定的菌株包括具有野生型 SGS1 TOP3（WT；W303-1A，基因型为 MATa ade2-1 canl-100 his3-11,15 leu2-3,112 trpl-l ura3-1）[2]、sgs1 突变体（W1292-3C；基因型为 MATa SUP4-o::URA3 sgs1-25 ade2-1 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 rad5-535）以及 sgs1 top3 突变体（W1058-11C，基因型为 MATa SUP4-o::URA3 sgs1-25 top3-2::HIS3 ade2-1 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 rad5-535）[3]，这些菌株由美国哥伦比亚大学 Rodney Rothstein 博士惠赠。
2. 质粒DNA构建
WRN 基因按照前述方案被克隆至 YEp112SpGAL 中。
<ol>
 <li>使用诱变引物和Quickchange II XL定点诱变试剂盒（Stratagene）的标准方案，由Lofstrand Labs（Gaithersburg, MD）在质粒YEp195SpGAL-WRN [4] 中构建了WRN的定点突变（E84A核酸外切酶失活，K577M解旋酶失活，R834C和K1016A）。</li>
 <li>将编码WRN及其相关突变体的DNA片段通过SalI和MluI双酶切从相应的YEp195SpGAL-WRN构建体中切下，并进行凝胶纯化。</li>
 <li>将凝胶纯化的片段克隆至载体YEp112SpGAL的SalI和MluI位点，该载体为含有TRP1筛选标记的2 μm多拷贝质粒，从而构建出在半乳糖诱导型启动子控制下的YEp112SpGAL WRN或WRN突变体，如图1所示。</li>
 <li>所获得的构建体分别命名为YEp112SpGAL-WRN、YEp112SpGAL-WRN E84A、YEp112SpGAL-WRN K577M、YEp112SpGAL-WRN K1016A和YEp112SpGAL-WRN R834C。</li>
</ol>
3. 转化
酵母菌培养采用标准方案，转化采用Gietz的乙酸锂法进行 等 [5]. 简而言之，执行了以下步骤。
<ol>
	<li>将上述菌株在5 ml YPD（酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖）培养基中过夜培养。随后将培养物重新接种至50 ml YPD培养基中，继续培养至OD600达到1.0 – 1.2。</li>
	<li>收集培养物，用20 ml水洗涤，并重悬于1 ml 100 mM醋酸锂（LiAc）溶液中。细胞在30°C下孵育10分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于100 mM LiAc中，终体积为500 μl，足以进行十次转化。取50 μl细胞悬液分装，通过离心收集细胞沉淀。</li>
	<li>向细胞沉淀中依次加入：250 μl 50%聚乙二醇（PEG）、36 μl 1 M LiAc、25 μl 2 mg/ml的ssDNA（鲑鱼精子DNA）、5 ml质粒DNA（100 ng – 1000 ng）以及50 μl水。将混合物涡旋振荡1分钟。</li>
	<li>将细胞在30°C下孵育30分钟，随后进行42°C热激处理20分钟。</li>
	<li>收集细胞并重悬于1 ml水中。由于质粒YEp112SpGAL含有trp作为筛选标记，所有携带该构建体的突变菌株均具有色氨酸合成能力。因此，通过将悬液涂布于缺乏Trp的SC（合成完全）葡萄糖培养基平板上，并在30°C培养3–4天至菌落出现，以筛选转化子。</li>
</ol>
4. WRN 转化 sgs1 top3 菌株中缓慢生长表型恢复的遗传学分析。
1. 划线分析：
<ol>
	<li>为了考察……的影响 WRN 野生型亲本（W303-1A）中基因表达对生长的影响 sgs1，或 sgs1 top3 菌株，携带 YEp112SpGAL 或 YEp112SpGAL- 的相应菌株WRN 在含有2%葡萄糖（glu）或2%半乳糖（gal）的SC缺失色氨酸（Trp）平板上划线接种。作为对照， sgs1 top3/YEp112SpGAL-SGS1 被纳入。将培养板在 30°C 2天。</li>
	<li>确定……的能力 WRN 影响生长速率 sgs1 top3 较低菌株 WRN 蛋白表达水平，的 sgs1 top3 用 YEp112SpGAL、YEp112SpGAL- 转化的菌株WRN，或 YEp112SpGAL-SGS1 在含有不同浓度半乳糖（gal）的SC缺色氨酸（Trp）培养板上划线接种，半乳糖浓度范围从0.005%至2%。随后将培养板于 30°C 2天。</li>
	<li>为了评估功能需求 WRN 以恢复该菌株的缓慢生长表型 sgs1 top3 背景， sgs1 top3 用 YEp112SpGAL- 转化WRN （E84A、K577M、R834C 和 K1016A）划线接种于含指定浓度葡萄糖或半乳糖的缺乏色氨酸的SC平板上。作为对照， sgs1 top3 用 YEp112SpGAL、YEp112SpGAL- 转化的菌株WRN 或 YEp112Sp GAL-SGS1 加入。随后将培养板在 30°C 2天。</li>
</ol>
2. 液体培养分析：
<ol>
<li>为了评估转化后的 sgs1 top3 菌株在液体培养基中的生长情况，将酵母细胞在 SC raf 缺乏 Trp 的培养基中于 30°C 过夜培养。将培养物重新接种至 SC raf 缺乏 Trp 的培养基中，在 30°C 下培养至对数生长早期（OD600 约为 0.5）。随后将培养物以 OD0.05 重新接种至含有 2% 半乳糖的 SC 培养基中，并在指定的时间间隔通过测定吸光度来监测其生长情况。</li>
</ol>
5. WRN 转化酵母菌株对羟基脲或甲基磺酸甲酯敏感性的遗传学分析。
<ol>
	<li>为了确定WRN表达对sgs1或sgs1 top3菌株在MMS和HU中敏感性的影响，将转化了YEp112SpGAL或YEp112SpGAL-WRN的菌株在30°C下于SC raf缺失Trp培养基中培养。</li>
	<li>将培养物重新接种至缺失Trp的SC raf培养基中，并在30°C下培养至对数早期（OD600约为0.6至0.8）。</li>
	<li>使用缺失Trp的SC培养基对这些菌株进行十倍系列稀释。从处于指数生长期的培养物中取5 × 106个细胞，依次进行连续稀释，最高稀释至10,000倍。将每种稀释液各4微升点样于含有指定浓度HU或MMS的SC gal缺失Trp平板上。平板在30°C下培养。</li>
	<li>作为对照，将野生型亲本菌株（W303-1A）转化YEp112SpGAL或YEp112SpGAL-WRN，或sgs1 top3/YEp112SpGAL-SGS1，按上述方法处理。</li>
</ol>
6. WRN 转化的 sgs1 top3 菌株的细胞周期分布。
<ol>
	<li>为了研究 WRN 转化的 sgs1 top3 菌株的细胞周期分布，将携带 YEp112SpGAL、YEp112SpGAL-WRN 或 YEp112SpGAL-SGS1 的 sgs1 top3 菌株，以及携带空载体的野生型亲本菌株（W303-1A）接种于 SC raf 缺乏色氨酸培养基中，在 30°C 下过夜培养。</li>
	<li>将培养物以 OD0.05 重新接种，并培养至对数早期（OD600 为 0.5–0.6）。通过加入半乳糖至终浓度 2% 诱导 WRN 表达。随后将培养物在 30°C 下继续培养 6 小时。</li>
 <li>接着对培养物进行 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色处理。
	<ol>
 	<li>在室温下以 5800 × g 离心 10 分钟收集细胞。</li>
		<li>细胞用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，随后在 70% 乙醇中固定 20 分钟（室温）。</li>
		<li>固定后的细胞用 1× PBS 洗涤两次，最后重悬于 1× PBS 中。</li>
 </ol>
 </li>
		<li>将细胞滴加至载玻片上，并用含 DAPI（1 μg/ml）的 Vectashield 封片剂（Vector，USA）封片。使用 Axiovert 200 M 荧光显微镜（Zeiss；100 倍物镜）结合微分干涉差（DIC）成像观察细胞。荧光图像采用 AxioVision 3.0 版本软件（Zeiss）进行分析。</li>
</ol>
7. 蛋白质印迹分析。
1. 为了检测转化的 sgs1 或 sgs1 top3 菌株中 WRN 或 WRN 变体的蛋白表达水平，采用以下方法制备裂解液，并通过免疫印迹分析蛋白。
<ol>
	<li>将转化后的 sgs1 或 sgs1 top3 菌株在30°C下于SC raf minus Trp培养基中过夜培养。</li>
	<li>将培养物重新接种，并在30°C下孵育至对数早期（OD600为0.5–0.8），然后加入半乳糖至终浓度2%进行诱导。继续在30°C下培养6小时。</li>
	<li>取3 ml细胞，通过离心收集并用PBS洗涤。细胞沉淀重悬于碱性裂解缓冲液中[50 mM NaOH，pH 10.5，2 mM EDTA，1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF），2% SDS，10%甘油，5% 2-巯基乙醇及蛋白酶抑制剂（Roche Molecular Biochemicals）]，煮沸5分钟，离心澄清后用1 M HCl中和。</li>
	<li>取等量细胞裂解液中的蛋白质，在8-16%聚丙烯酰胺SDS凝胶上进行电泳分离。</li>
</ol>
2. 为了确定不同浓度半乳糖影响下WRN蛋白的表达水平，按如下步骤处理培养物。
<ol>
	<li>将转化的 sgs1 top3 菌株在 30°C 下于 SC 半乳糖-色氨酸培养基中过夜培养。</li>
	<li>将培养物重新接种，并在 30°C 下培养至对数生长早期（OD600 为 0.5 - 0.8），然后加入半乳糖至终浓度 2% 进行诱导。继续在 30°C 下培养 6 小时。</li>
	<li>通过离心收集细胞，并重悬于含有蛋白酶抑制剂（0.05% PMSF，0.05 μg/ml 亮抑蛋白酶肽）的缓冲液（50 mM Tris-Cl，pH 7.5，1% 脱氧胆酸钠，1% Triton X-100，0.1% 十二烷基硫酸钠 [SDS]）中。</li>
	<li>向混合物中加入玻璃珠（425 至 600 μm），通过涡旋振荡破碎细胞。</li>
	<li>将所得匀浆液在 15000 × g 下离心 5 分钟，收集上清组分。</li>
	<li>采用 Bradford 法测定裂解液组分中的蛋白浓度。</li>
	<li>将不同裂解液组分中等浓度的蛋白质在 8-16% 聚丙烯酰胺 SDS 凝胶上进行电泳分离。</li>
</ol>
3. 表达 WRN 或 WRN 突变蛋白通过Western blot使用 WRN 针对纯化C末端片段中某一表位的小鼠单克隆抗体 WRN [6]（1:1000，Spring Valley Labs）
4. 一抗孵育后，加入二抗（辣根过氧化物酶标记抗体，1:5000）孵育。按照生产商的方案，使用ECL Plus Western检测试剂盒对印迹膜进行处理。
5. 进行定量 Western blot 分析时，在凝胶中加入不同浓度的纯化重组 His 标签全长 WRN 蛋白，以便在对印迹结果进行定量时生成标准线性曲线。此外，加载了来自等量细胞的细胞提取物或 20 μg 酵母裂解液样品，以估算 WRN 的浓度。
6. 对凝胶进行 ImageQuant 分析，并生成标准线性曲线。
7. 使用上述生成的标准线性曲线估算不同半乳糖浓度下 WRN 蛋白的浓度。
8. 代表性结果
本研究中使用的所有菌株均为色氨酸营养缺陷型。因此，将含有 YEp112SpGAL 或 YEp112SpGAL-WRN 质粒的 sgs1、sgs1 top3 及野生型 W303-1A 菌株根据其在 SC 缺乏色氨酸培养基中生长的能力进行筛选。为了检测 WRN 表达对转化后的 sgs1 top3 突变细胞生长的影响，将菌液划线接种于含有 2% 半乳糖的 SC 缺乏色氨酸培养板上，以诱导 WRN 的表达。Top3 可解离 Sgs1 解旋酶在复制过程中产生的相互缠绕的 DNA 分子[1, 2]；因此，在缺失 Top3 的情况下，扭转应力无法得到缓解，导致生长缓慢和高频重组。sgs1 的遗传功能是抑制 top3 突变体的生长迟缓表型。如果 WRN 能够在与 Top3 的遗传互作中替代 SGS1 的功能，则预期在 sgs1 top3 突变体中恢复 top3 的生长迟缓表型。
如图 2A 所示，WRN 转化的 sgs1 top3 菌株相较于载体转化的 sgs1 top3 菌株生长显著减慢。sgs1 top3 菌株转化 YEp112SpGAL-SGS1 质粒作为阳性对照（图 2A），表明在 sgs1 top3 突变体中表达的野生型 Sgs1 能够在遗传上弥补其生长表型。在无半乳糖（gal）条件下培养 2 天时，转化后的 sgs1 top3 菌株生长情况相似（图 2A）。表达 WRN 对亲本野生型（W3031A）或 sgs1 菌株的生长无影响（图 2B），表明 WRN 对细胞生长的作用特异性地出现在 sgs1 top3 突变背景中。利用 WRN 变体进行的遗传学研究表明，WRN 的解旋酶活性而非外切核酸酶活性对于恢复 top3 的生长表型是必需的（图 3B）。WRN 中一个天然存在的错义多态性会干扰其解旋酶活性，从而消除了其恢复 top3 缓慢生长表型的能力。
top3 突变菌株在细胞周期的晚期 S 期/ G2 期存在延迟[1]，这一特征可能解释其生长缓慢的现象。top3 背景下SGS1 基因的突变可抑制细胞周期 S/G2 期的延迟。如果表达 WRN 能够恢复 sgs1 top3 菌株在细胞周期 S/G2 期的延迟，则预期表达 WRN 的 sgs1 top3 突变细胞中将出现更高比例的大型芽生细胞且细胞核未分裂。如图4所示，与 sgs1 top3/vector 相比，sgs1 top3/WRN 的大型芽生细胞比例更高，表明 top3 所特有的 S/G2 期延迟特征得以恢复。
sgs1 top3 双突变体对 MMS 或 HU 的敏感性低于 top3 单突变体 [2]。由于 WRN 影响 sgs1 top3 的细胞生长，我们接下来检测了其对甲基磺酸甲酯（MMS，一种烷化剂）和羟基脲（HU，一种复制抑制剂）敏感性的影响。sgs1 top3 / WRN 对这两种药物的敏感性与 sgs1 top3 / SGS1 相当（图5）。对 WRN 变体的遗传学分析表明，WRN 解旋酶/ATP酶活性（而非 WRN 外切酶活性）在其对 MMS 和 HU 敏感性的影响中是必需的。
<img src="/files/ftp_upload/1639/1639fig1tmb.jpg" alt="质粒重组示意图，WRN基因连接，限制性内切酶分析，YEp载体。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 在YEp112SpGAL载体中克隆WRN / WRN 变体的示意图。 请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1639/1639fig1.jpg">点击此处</a>查看图1的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1639/1639fig2tmb.jpg" alt="在含有半乳糖和葡萄糖的琼脂平板上比较 sgs1 top3 WRN 菌株的细菌生长情况。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 在 sgs1 top3 背景中表达 WRN 可恢复 top3 的生长缓慢表型。 图 A，将携带 YEp112SpGAL 或 YEp112SpGAL WRN 质粒的 sgs1 top3 菌株划线接种于含有 2% 葡萄糖（glu）或 2% 半乳糖（gal）的 SC-Trp 平板上。作为对照，将携带 YEp112SpGAL SGS1 质粒的 sgs1 top3 菌株同时划线于两个平板上。平板在 30°C 下培养 2 天后拍照。图 B，将野生型亲本菌株 W303-1A 或 sgs1 菌株（均转化了 YEp112SpGAL 或 YEp112SpGAL WRN 质粒）划线接种于含有 2% 葡萄糖或 2% 半乳糖的 SC-Trp 平板上。平板在 30°C 下培养 4 天后拍照。平板的成分别如 图 A 和 图 B 所示。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1639/1639fig2.jpg">点击此处</a>查看图 2 的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1639/1639fig3tmb.jpg" alt="基因编辑的静态平衡图；酵母在含2%半乳糖和2%葡萄糖的琼脂平板上的生长情况。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 在 sgs1 top3 背景下，WRN 的ATP酶/解旋酶活性（而非外切核酸酶活性）对于恢复 top3 的缓慢生长表型是必需的。 将携带ATP酶/解旋酶失活突变（YEp195SpGAL WRN K577M）、外切核酸酶失活突变（YEp195SpGAL-WRN E84A）、RQC结构域突变（YEp195SpGAL-WRN K1016A）或多样性突变（YEp195SpGAL-WRN R834C）的 sgs1 top3 菌株划线接种于含2%葡萄糖（图C）或2%半乳糖（图B）的SC-Trp平板上。平板在30°C下培养2天后拍照。平板成分同图A。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1639/1639fig3.jpg">点击此处</a>查看图3的高清版本。
<img src="/files/ftp_upload/1639/1639fig4tmb.jpg" alt="细胞增殖实验示意图；用WRN载体分析的sgs1 top3细胞；显微镜结果。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. WRN 表达在 sgs1 top3 细胞中诱导S/G2期阻滞。 将携带YEp112SpGAL、YEp112SpGAL WRN 或YEp112SpGAL SGS1的sgs1 top3菌株以及携带空载体的野生型亲本菌株在2%半乳糖浓度下诱导培养6小时。收集培养物，按照材料与方法中所述进行DAPI染色，并使用Axiovert 200 M显微镜（Zeiss；100倍物镜）观察。图中显示了携带YEp112SpGAL（左上）和YEp112SpGAL WRN（右上）的sgs1 top3细胞的DAPI染色结果。箭头指示含有未分裂细胞核的细胞。下图显示了处于G1期（单细胞）和S/G2期（出芽细胞）的细胞分布情况。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1639/1639fig4.jpg">点击此处</a>查看图4的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1639/1639fig5tmb.jpg" alt="酵母在不同培养基中的生长情况；点样实验；遗传菌株比较；实验结果分析。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 图5. WRN 表达对 sgs1 top3 菌株MMS和HU敏感性的影响。 将携带 YEp112SpGAL、YEp112SpGAL WRN、核酸外切酶失活突变体（YEp112SpGAL-WRN E84A）、ATP酶/解旋酶失活突变体（YEp112SpGAL WRN K577M）、RQC结构域突变体（YEp112SpGAL-WRN K1016A）、多态性突变体（YEp112SpGAL-WRN R834C）、YEp112SpGAL SGS1 的 sgs1 top3 菌株，以及空载体转化的野生型亲本菌株，在对数生长期培养后进行十倍系列稀释，并点样接种至含有葡萄糖或半乳糖且添加指定浓度MMS或HU的SC-Trp平板上。平板在30°C条件下培养，对照板培养2天，MMS和HU处理板培养4天，随后拍照记录。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1639/1639fig5.jpg">点击此处</a>查看图5的放大图像。

<ol><li>Aggarwal, M., Brosh, R. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+helicase+defective+in+the+premature+aging+disorder+Werner+Syndrome+genetically+interacts+with+Topoisomerase+3+and+restores+the+top3+slow+growth+phenotype+of+sgs1+top3%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">WRN helicase defective in the premature aging disorder Werner Syndrome genetically interacts with Topoisomerase 3 and restores the top3 slow growth phenotype of sgs1 top3.</a> Aging. 1, 219-233 (2009).</li>
<li>Gangloff, S., McDonald, J. P., Bendixen, C., Arthur, L., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+type+I+topoisomerase+Top3+interacts+with+Sgs1%2C+a+DNA+helicase+homolog%3A+a+potential+eukaryotic+reverse+gyrase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The yeast type I topoisomerase Top3 interacts with Sgs1, a DNA helicase homolog: a potential eukaryotic reverse gyrase.</a> Mol Cell Biol. 14, 8391-8398 (1994).</li>
<li>Shor, E., Gangloff, S., Wagner, M., Weinstein, J., Price, G., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+homologous+recombination+genes+rescue+top3+slow+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in homologous recombination genes rescue top3 slow growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 162, 647-662 (2002).</li>
<li>Sharma, S., Sommers, J. A., Brosh, R. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+function+of+the+conserved+non-catalytic+domain+of+Werner+syndrome+helicase+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">In vivo function of the conserved non-catalytic domain of Werner syndrome helicase in DNA replication.</a> Hum Mol Genet. 13, 2247-2261 (2004).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc%2FSS-DNA%2FPEG+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li>
<li>von Kobbe, C., Thoma, N. H., Czyzewski, B. K., Pavletich, N. P., Bohr, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Werner+syndrome+protein+contains+three+structure+specific+DNA+binding+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Werner syndrome protein contains three structure specific DNA binding domains.</a> J Biol Chem. 278, 52997-53006 (2003).</li>
</ol>

利用酵母作为模式系统的优势之一，在于可以获得特定DNA复制和修复通路的突变体，这些通路在酵母与人类之间是保守的。由于实验室菌株为营养缺陷型突变体，且带有营养缺陷型标记的载体易于获取，因此对携带特定基因的转化子进行筛选既简便又可靠。利用这些载体，可通过将目标基因置于可诱导启动子（例如gal可诱导启动子等）的控制之下，实现对基因产物表达的调控。鉴于上述优势，我们建立了一个基于酵母的模型系统，用于研究在人类与酵母间可能保守的通路中，与Werner综合征相关的WRN基因的功能需求。通过所描述的方法，我们首次提供了WRN能够在影响top3-相关表型的遗传通路中发挥作用的证据。我们的观察结果提示，有必要进一步探究WRN在人类细胞的DNA复制或重组过程中是否与Top3α存在功能上的相互作用。可以设想，在BLM功能受损的情况下，WRN可能通过与拓扑异构酶的蛋白相互作用，部分地替代BLM的功能。

利用酵母作为模式系统研究人类dna修复蛋白的遗传学

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

理解人类DNA修复蛋白在遗传通路中的作用对许多研究人员而言是一项艰巨的挑战。由于缺乏现成的工具，包括明确的突变遗传细胞系、可调控的表达系统以及合适的可筛选标记，哺乳动物系统中的遗传学研究受到了限制。为了克服这些困难，低等真核生物中的模式遗传系统已成为研究功能保守的DNA修复蛋白及通路的优选方案。我们已建立了一种酵母模型系统，用于研究维尔纳综合征解旋酶-核酸酶（Werner syndrome helicase-nuclease,WRN) 在核酸代谢中的作用。可通过研究具有明确遗传突变背景的细胞表型，以阐明其在细胞和分子水平上的功能。WRN通过其催化活性和蛋白质相互作用。人类WRN基因及其相关变异体可克隆至DNA质粒中，用于在酵母中表达，并可由调控性质粒元件控制其表达。随后可将表达载体转化至相应的酵母突变体背景中，并通过多种方法检测其遗传功能。利用该方法，我们确定WRN，与其相关的RecQ家族成员BLM和Sgs1类似，作用于一条依赖Top3的通路，该通路可能在基因组稳定性中发挥重要作用。相关内容详见我们最近发表的出版物[1]<a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>本文提供了酵母中基因互补研究的特定检测方法的详细步骤。

利用酵母进行遗传学研究可用于探讨人类基因在细胞DNA代谢中的分子和细胞功能。本文描述了利用酵母这一易于操作的模式系统，在功能保守的通路中对早衰疾病——维尔纳综合征（Werner syndrome）中存在缺陷的人类WRN基因产物进行遗传学表征的方法。

利用酵母作为模式系统研究人类DNA修复蛋白的遗传学

了解人类DNA修复蛋白在遗传通路中的作用对许多研究人员而言是一项艰巨的挑战。哺乳动物中的遗传学研究……

WRN 质粒用限制性内切酶Cell one和MLU one进行消化，并从凝胶中纯化片段。将经Cell one至MLU one消化获得的WN片段连接至酵母载体的Cell one至MLU one位点。该多拷贝质粒还含有TRP one可筛选标记。按照标准方案将W Rrn构建体转化至酵母中，并在缺乏色氨酸的合成完全葡萄糖培养基上筛选转化子。随后将单个转化子划线接种到缺乏色氨酸的合成完全葡萄糖培养基平板上，并从主平板开始培养。为分析WRN转化的SGS菌株中缓慢生长表型的恢复情况，选取三种生长表现最佳的双突变菌株转化子，分别划线接种于含葡萄糖或半乳糖的平板上。为了分析WRN表达对羟基脲（HU）和甲基磺酸甲酯（MMS）敏感性的影响，进行点种实验以确定表达WRN的酵母细胞的细胞周期分布。进行DAPI染色。通过蛋白质印迹分析（Western Blot Analysis）检测WRN在异源宿主中的表达情况。大家好，我是 Robert Broch，来自美国国立卫生研究院下属的国家衰老研究所分子老年学实验室 DNA Hela 病例研究组。大家好，我是 Monica Agarwal，同样来自国家衰老研究所分子遗传学实验室的 DNA Heli 病例研究组。理解人类 DNA 修复蛋白及遗传通路的作用，对许多研究人员而言是一项颇具挑战性的课题。由于缺乏易于获得的工具（包括突变型遗传细胞系、调控表达系统以及合适的可筛选标记），哺乳动物系统的遗传学研究一直受到限制。今天我们将向您展示利用酵母作为模式系统来研究一种称为解旋酶的DNA解链酶在防止早衰过程中的分子与细胞功能的相关实验步骤。在本实验室中，我们采用这些方法对早衰症中DNA修复及基因组稳定性维持功能缺陷的人类早衰基因产物进行遗传学表征。维尔纳综合征（Werner syndrome）是人类五种req家族解旋酶病例之一，存在于东部地区。目前仅有一种名为sgs的模型用于研究人类维尔纳蛋白在复制应激反应中的作用。我们已研究了维尔纳蛋白表达在东部地区突变背景下对多种生物学终点的影响。那么，让我们开始吧。由于我们将使用酵母作为异源宿主，第一步是将人类 Werner 基因或其变异体克隆到酵母载体中。Werner 质粒用限制性内切酶 Sal I 和 Mlu I 进行消化，并将纯化后的片段连接到酵母表达载体的 Sal I 和 Mlu I 位点上，该载体受半乳糖诱导型启动子的调控。该多拷贝质粒还包含一个TRP1选择性标记。随后将这些Werner表达质粒转化至本研究中使用的相应色氨酸营养缺陷型酵母菌株中，并通过将菌液涂布于合成完全葡萄糖培养基上筛选转化子。在缺乏色氨酸的条件下，将平板置于30摄氏度培养三至四天，直至菌落出现。菌落生长后，将单个转化子在合成完全葡萄糖培养基上划线，并将平板置于30摄氏度培养两至三天。随后，通过以下各节所展示的技术，对表达人WEER基因及其变异体的突变酵母菌株进行细胞表型分析。前三突变株表现出严重的生长缺陷。然而，SGS1 基因的突变可抑制前三突变株的生长迟缓表型。为检测 Werner 表达对野生型 SGS1 或 SGS1 前三突变株生长的影响，将相应菌株与空载体或 Werner 表达质粒分别划线接种于缺乏色氨酸但含有 2% 葡萄糖或 2% 半乳糖作为碳源的合成完全培养基平板上，其中半乳糖组作为阳性对照。将平板在 30°C 下培养两天后观察结果，以确定 SGS1 表达的影响。野生型和携带空载体或Werner的SGS1突变菌株在生长模式上无任何差异。然而，与携带空载体的SGS1 top3双突变菌株相比，携带Werner的SGS1 top3双突变菌株生长显著减慢，以此评估Werner在恢复缓慢生长表型中的功能需求。在sgs1 top3背景下，将携带Werner催化结构域突变体的sgs1 top3菌株划线接种于缺乏色氨酸、并含有2%葡萄糖或2%半乳糖的合成完全培养基平板上，培养两天后观察。孵育Werner外切酶突变体（表示为E84A）可恢复Werner的缓慢生长表型，表明外切酶活性在恢复前三种缓慢生长表型中并非必需。Werner解旋酶突变体生长良好，表明Werner解旋酶活性对于恢复前三种缓慢生长表型是必需的。为确定Werner影响sgs生长速率的能力。在较低蛋白表达水平下，将三种表现最佳的菌株分别与载体Werner或sgs1转化至缺乏色氨酸但含有逐渐增加浓度半乳糖的合成完全培养板上进行划线。将所有培养板于30°C下孵育两天。Werner及Werner外切酶突变体在所有浓度半乳糖条件下均能恢复三种最佳菌株的表型。然而，Warner解旋酶突变体则没有这种表现。已有研究表明，SGS1-top3双突变体对DNA烷基化试剂甲基磺酸甲酯（methyl methanesulfonate，MMS）或复制抑制剂羟基脲（hydroxyurea，HU）的敏感性低于top3单突变体。为了确定Warner表达对SGS1或SGS1-top3菌株在MMS和HU敏感性上的影响，将携带空载体或Warner表达质粒的酵母菌株在缺乏色氨酸的合成完全棉子糖培养基中，于30°C条件下培养作为对照。使用携带空载体的野生型亲本菌株接种所有缺乏色氨酸的合成完全棉子糖培养基中的培养物，并在30摄氏度下培养至对数生长早期。当培养物达到对数生长早期时，使用缺乏色氨酸的合成完全培养基对该菌株进行10倍系列稀释，最高稀释至10,000倍，取每个稀释度4微升点样于含有10毫摩尔HU或0.0025% MMS的缺乏色氨酸的合成完全GAL培养基平板上，在30摄氏度下培养4天。一种携带野生型sgs基因的sgs1Δ top3Δ双突变菌株。一种是在细胞周期的晚SG2期发生延迟，导致出现哑铃形形态。相比之下，野生型酵母完成细胞分裂，留下较少的哑铃形细胞，可用于研究Werner转化的sgs1-top3菌株的细胞周期分布。首先，在30摄氏度下，于缺乏色氨酸的合成完全RAF培养基中，过夜培养以下菌株的对数生长期培养物。将SGS1与质粒Werner或SGS1以及空载体转化的野生型亲本菌株重新接种至OD 0.05。重新接种后，将培养物培养至OD 0.5，通过离心收集细胞，随后通过添加2%浓度的半乳糖诱导Werner蛋白表达。将培养物在30摄氏度下继续培养六小时。六小时后，收集培养物，通过离心收集细胞。离心后将培养物转移至微量离心管中，用 PBS 洗涤细胞一次。随后，在室温下用 70% 乙醇固定细胞 20 分钟，固定后用 PBS 洗涤细胞两次，再将细胞重悬于 1× PBS 中。将细胞悬液置于载玻片上，加入防淬灭封片剂，使用含DAPI的封片介质，DAPI浓度为每毫升一微克。在XI Saxo vert显微镜下观察载玻片，寻找细胞核呈哑铃形的细胞，这是酵母细胞处于细胞周期SG2期的特征。为了确定Werner蛋白在转化后的SGS1或SGS1 top3酵母菌株中的表达或其变异情况，首先在含有半乳糖的培养基中培养菌株6小时，以诱导Werner蛋白的表达。通过离心收集细胞后，用PBS洗涤并重悬。一种碱性裂解缓冲液。将细胞煮沸五分钟，然后通过离心澄清，并用1摩尔盐酸中和。这些裂解物现在可用于在8%至16%的聚丙烯酰胺SDS凝胶中进行电泳，以确定在不同浓度半乳糖影响下Warner蛋白的表达水平。首先，用不同浓度的半乳糖诱导培养物6小时。然后通过离心收集细胞，并将其重悬于含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中。向混合物中加入425至600微米的玻璃珠，高速涡旋振荡1分钟以破碎细胞，随后冰浴1分钟。重复上述步骤共八次。接着，将所得匀浆在15,000 G下离心5分钟，并收集上清组分。使用Bradford法测定裂解物组分中的蛋白含量后，将等浓度蛋白上样至8%–16%聚丙烯酰胺SDS凝胶，通过Western blot检测sgs中Werner蛋白的表达水平。SGS1 TOP3 三重突变株中，SGS1 的存在可恢复其缓慢生长表型，如这些照片所示。当 SGS1 TOP3 突变株分别转化空载体或 SGS1 表达质粒后，在含有 2% 葡萄糖或 2% 半乳糖的 SC 缺色氨酸平板上划线培养。在半乳糖诱导下，WERNER 的表达导致 SGS1 TOP3 突变株生长速度减慢。相比之下，野生型亲本菌株或在 SGS1 背景中转入 Werner 基因的菌株生长不受影响，表明 Werner 所导致的生长迟缓具有 SGS1 背景特异性。当在 SGS1 背景菌株中转入 Werner 基因的不同变体后，将其划线接种于含有 2% 葡萄糖或 2% 半乳糖的 SC 缺色氨酸平板上培养。无外切酶活性的Werner蛋白仍能恢复top three的缓慢生长表型。这表明Werner蛋白的ATP酶解旋酶活性而非外切酶活性对于恢复top three的缓慢生长表型是必需的。在SGS one top three背景下，Werner蛋白在整个GAL浓度范围内均能恢复SGS one top three的缓慢生长表型。这些结果表明，在 sgs1-top3 突变体背景下，低水平的 Werner 蛋白表达即可恢复其缓慢生长表型。将含有 Werner 或其变异体的 sgs1、top3 菌株在对数生长期进行培养后，以十倍系列稀释法点种于含有葡萄糖或半乳糖以及 MMS 或 HU 的 SC 色氨酸平板上。我们观察到，Werner 的表达增强了 sgs1-top3 菌株对 MMS 和 HU 的敏感性。此外，Werner 在 sgs1-top3 背景下对 MMS 和 HU 敏感性的影响依赖于其 ATP 依赖性解旋酶活性，而不依赖于外切酶活性。最后，Werner蛋白的表达也恢复了top three细胞中SG期的典型双延迟，表现为体积较大的成对细胞比例升高。在表达Werner的sgs1 top3突变细胞中，与携带空载体的sgs1 top3突变细胞相比，细胞经Dabi染色。为了观察细胞核，箭头指示的是未分裂的细胞核中Werner蛋白的表达。在转化的sgs中，通过添加指定浓度的半乳糖诱导顶层三个细胞，诱导后六小时收集细胞。将等量的总细胞裂解液上样至8%至16%的聚丙烯酰胺SDS凝胶，随后使用抗Warner抗体进行蛋白质印迹检测。我们向您展示了如何利用特定的酵母突变背景来研究与之相关的细胞表型，从而阐明人类学习相关基因通过其催化活性和蛋白质相互作用所介导的细胞与分子功能。酵母可作为模式生物用于研究该基因在特定通路中的功能。在进行这些实验操作时，选择合适的酵母突变背景以明确目标基因在特定通路中的作用至关重要。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

genetic-studies-human-dna-repair-proteins-using-yeast-as-model

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

人类DNA修复蛋白的遗传研究利用酵母作为模型系统

哺乳动物细胞中DNA双链断裂（DSB）修复的分析

本文介绍了一组DNA突变检测方法，这些方法可与酵母时序性寿命模型相结合，用于研究在衰老过程中调控或导致基因组DNA不稳定的基因/通路。...

使用 S. cerevisiae 时序寿命模型研究年龄依赖性基因组不稳定性

HO诱导的转位检测法可监测二倍体Saccharomyces...

通过单链退火法在Saccharomyces cerevisiae中定量与分析HO内切酶诱导的染色体易位的形成

核糖核苷酸是在真核生物细胞核DNA复制过程中掺入基因组中最丰富的非经典核苷酸之一。如果未能被及时清除，核糖核苷酸可能导致DNA损伤和诱变。本文介绍了两种用于评估DNA中核糖核苷酸掺入丰度及其诱变效应的实验方法。...

研究核糖核苷酸的掺入：酵母基因组中核糖核苷酸的链特异性检测及核糖核苷酸诱导突变的测量

本文介绍了四种构建和利用酵母Saccharomyces...

酵母作为研究人类P53功能检测方法开发的底盘系统

本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的关键步骤。这些实验方案常用于研究与DNA损伤相关的细胞过程，并用于可视化及定量分析参与DNA修复的蛋白质的募集情况。...

可视化与定量内切酶介导的位点特异性DNA损伤

本文介绍了一种sgRNA/CAS9核酸酶与下一代测序的实验方案，可用于鉴定与CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变。...

利用下一代测序技术鉴定与Cas9诱导的CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变

本研究描述了一种在裂殖酵母（Schizosaccharomyces...

遗传筛选鉴定裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中的多拷贝抑制子

本方案描述了一种用于定量HEK-293T细胞中非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）效率的染色体外非同源末端连接（NHEJ）检测方法和同源重组（HR）检测方法。...

利用基于GFP的报告系统分析HEK-293T细胞中非同源末端连接和同源重组效率

青鳉和斑马鱼在脊椎动物基因组功能的遗传解析方面具有互补性。本方案重点介绍了对青鳉胚胎进行显微注射的关键步骤，这是实验室中利用青鳉和斑马鱼开展胚胎学与遗传学分析的重要技术。...

作为模式遗传生物的青鳉胚胎显微注射

了解利用酵母模型系统研究人类WRN基因功能的方法。通过质粒酶切、连接转化和表型分析，探索DNA代谢与细胞衰老的分子机制。

利用酵母作为模式系统研究人类DNA修复蛋白的遗传学

探索更多视频