利用酵母作为模式系统研究人类DNA修复蛋白的遗传学

WRN 质粒用限制性内切酶Cell one和MLU one进行消化，并从凝胶中纯化片段。将经Cell one至MLU one消化获得的WN片段连接至酵母载体的Cell one至MLU one位点。该多拷贝质粒还含有TRP one可筛选标记。

按照标准方案将W Rrn构建体转化至酵母中，并在缺乏色氨酸的合成完全葡萄糖培养基上筛选转化子。随后将单个转化子划线接种到缺乏色氨酸的合成完全葡萄糖培养基平板上，并从主平板开始培养。为分析WRN转化的SGS菌株中缓慢生长表型的恢复情况，选取三种生长表现最佳的双突变菌株转化子，分别划线接种于含葡萄糖或半乳糖的平板上。

为了分析WRN表达对羟基脲（HU）和甲基磺酸甲酯（MMS）敏感性的影响，进行点种实验以确定表达WRN的酵母细胞的细胞周期分布。进行DAPI染色。通过蛋白质印迹分析（Western Blot Analysis）检测WRN在异源宿主中的表达情况。

大家好，我是 Robert Broch，来自美国国立卫生研究院下属的国家衰老研究所分子老年学实验室 DNA Hela 病例研究组。大家好，我是 Monica Agarwal，同样来自国家衰老研究所分子遗传学实验室的 DNA Heli 病例研究组。理解人类 DNA 修复蛋白及遗传通路的作用，对许多研究人员而言是一项颇具挑战性的课题。

由于缺乏易于获得的工具（包括突变型遗传细胞系、调控表达系统以及合适的可筛选标记），哺乳动物系统的遗传学研究一直受到限制。今天我们将向您展示利用酵母作为模式系统来研究一种称为解旋酶的DNA解链酶在防止早衰过程中的分子与细胞功能的相关实验步骤。在本实验室中，我们采用这些方法对早衰症中DNA修复及基因组稳定性维持功能缺陷的人类早衰基因产物进行遗传学表征。

维尔纳综合征（Werner syndrome）是人类五种req家族解旋酶病例之一，存在于东部地区。目前仅有一种名为sgs的模型用于研究人类维尔纳蛋白在复制应激反应中的作用。我们已研究了维尔纳蛋白表达在东部地区突变背景下对多种生物学终点的影响。

那么，让我们开始吧。由于我们将使用酵母作为异源宿主，第一步是将人类 Werner 基因或其变异体克隆到酵母载体中。Werner 质粒用限制性内切酶 Sal I 和 Mlu I 进行消化，并将纯化后的片段连接到酵母表达载体的 Sal I 和 Mlu I 位点上，该载体受半乳糖诱导型启动子的调控。

该多拷贝质粒还包含一个TRP1选择性标记。随后将这些Werner表达质粒转化至本研究中使用的相应色氨酸营养缺陷型酵母菌株中，并通过将菌液涂布于合成完全葡萄糖培养基上筛选转化子。

在缺乏色氨酸的条件下，将平板置于30摄氏度培养三至四天，直至菌落出现。菌落生长后，将单个转化子在合成完全葡萄糖培养基上划线，并将平板置于30摄氏度培养两至三天。随后，通过以下各节所展示的技术，对表达人WEER基因及其变异体的突变酵母菌株进行细胞表型分析。

前三突变株表现出严重的生长缺陷。然而，SGS1 基因的突变可抑制前三突变株的生长迟缓表型。为检测 Werner 表达对野生型 SGS1 或 SGS1 前三突变株生长的影响，将相应菌株与空载体或 Werner 表达质粒分别划线接种于缺乏色氨酸但含有 2% 葡萄糖或 2% 半乳糖作为碳源的合成完全培养基平板上，其中半乳糖组作为阳性对照。将平板在 30°C 下培养两天后观察结果，以确定 SGS1 表达的影响。

野生型和携带空载体或Werner的SGS1突变菌株在生长模式上无任何差异。然而，与携带空载体的SGS1 top3双突变菌株相比，携带Werner的SGS1 top3双突变菌株生长显著减慢，以此评估Werner在恢复缓慢生长表型中的功能需求。在sgs1 top3背景下，将携带Werner催化结构域突变体的sgs1 top3菌株划线接种于缺乏色氨酸、并含有2%葡萄糖或2%半乳糖的合成完全培养基平板上，培养两天后观察。

孵育Werner外切酶突变体（表示为E84A）可恢复Werner的缓慢生长表型，表明外切酶活性在恢复前三种缓慢生长表型中并非必需。Werner解旋酶突变体生长良好，表明Werner解旋酶活性对于恢复前三种缓慢生长表型是必需的。为确定Werner影响sgs生长速率的能力。

在较低蛋白表达水平下，将三种表现最佳的菌株分别与载体Werner或sgs1转化至缺乏色氨酸但含有逐渐增加浓度半乳糖的合成完全培养板上进行划线。将所有培养板于30°C下孵育两天。Werner及Werner外切酶突变体在所有浓度半乳糖条件下均能恢复三种最佳菌株的表型。

然而，Warner解旋酶突变体则没有这种表现。已有研究表明，SGS1-top3双突变体对DNA烷基化试剂甲基磺酸甲酯（methyl methanesulfonate，MMS）或复制抑制剂羟基脲（hydroxyurea，HU）的敏感性低于top3单突变体。为了确定Warner表达对SGS1或SGS1-top3菌株在MMS和HU敏感性上的影响，将携带空载体或Warner表达质粒的酵母菌株在缺乏色氨酸的合成完全棉子糖培养基中，于30°C条件下培养作为对照。

使用携带空载体的野生型亲本菌株接种所有缺乏色氨酸的合成完全棉子糖培养基中的培养物，并在30摄氏度下培养至对数生长早期。当培养物达到对数生长早期时，使用缺乏色氨酸的合成完全培养基对该菌株进行10倍系列稀释，最高稀释至10,000倍，取每个稀释度4微升点样于含有10毫摩尔HU或0.0025% MMS的缺乏色氨酸的合成完全GAL培养基平板上，在30摄氏度下培养4天。一种携带野生型sgs基因的sgs1Δ top3Δ双突变菌株。

一种是在细胞周期的晚SG2期发生延迟，导致出现哑铃形形态。相比之下，野生型酵母完成细胞分裂，留下较少的哑铃形细胞，可用于研究Werner转化的sgs1-top3菌株的细胞周期分布。首先，在30摄氏度下，于缺乏色氨酸的合成完全RAF培养基中，过夜培养以下菌株的对数生长期培养物。

将SGS1与质粒Werner或SGS1以及空载体转化的野生型亲本菌株重新接种至OD 0.05。重新接种后，将培养物培养至OD 0.5，通过离心收集细胞，随后通过添加2%浓度的半乳糖诱导Werner蛋白表达。将培养物在30摄氏度下继续培养六小时。

六小时后，收集培养物，通过离心收集细胞。离心后将培养物转移至微量离心管中，用 PBS 洗涤细胞一次。随后，在室温下用 70% 乙醇固定细胞 20 分钟，固定后用 PBS 洗涤细胞两次，再将细胞重悬于 1× PBS 中。

将细胞悬液置于载玻片上，加入防淬灭封片剂，使用含DAPI的封片介质，DAPI浓度为每毫升一微克。在XI Saxo vert显微镜下观察载玻片，寻找细胞核呈哑铃形的细胞，这是酵母细胞处于细胞周期SG2期的特征。

为了确定Werner蛋白在转化后的SGS1或SGS1 top3酵母菌株中的表达或其变异情况，首先在含有半乳糖的培养基中培养菌株6小时，以诱导Werner蛋白的表达。通过离心收集细胞后，用PBS洗涤并重悬。

一种碱性裂解缓冲液。将细胞煮沸五分钟，然后通过离心澄清，并用1摩尔盐酸中和。这些裂解物现在可用于在8%至16%的聚丙烯酰胺SDS凝胶中进行电泳，以确定在不同浓度半乳糖影响下Warner蛋白的表达水平。

首先，用不同浓度的半乳糖诱导培养物6小时。然后通过离心收集细胞，并将其重悬于含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中。向混合物中加入425至600微米的玻璃珠，高速涡旋振荡1分钟以破碎细胞，随后冰浴1分钟。

重复上述步骤共八次。接着，将所得匀浆在15,000 G下离心5分钟，并收集上清组分。使用Bradford法测定裂解物组分中的蛋白含量后，将等浓度蛋白上样至8%–16%聚丙烯酰胺SDS凝胶，通过Western blot检测sgs中Werner蛋白的表达水平。

SGS1 TOP3 三重突变株中，SGS1 的存在可恢复其缓慢生长表型，如这些照片所示。当 SGS1 TOP3 突变株分别转化空载体或 SGS1 表达质粒后，在含有 2% 葡萄糖或 2% 半乳糖的 SC 缺色氨酸平板上划线培养。在半乳糖诱导下，WERNER 的表达导致 SGS1 TOP3 突变株生长速度减慢。

相比之下，野生型亲本菌株或在 SGS1 背景中转入 Werner 基因的菌株生长不受影响，表明 Werner 所导致的生长迟缓具有 SGS1 背景特异性。当在 SGS1 背景菌株中转入 Werner 基因的不同变体后，将其划线接种于含有 2% 葡萄糖或 2% 半乳糖的 SC 缺色氨酸平板上培养。

无外切酶活性的Werner蛋白仍能恢复top three的缓慢生长表型。这表明Werner蛋白的ATP酶解旋酶活性而非外切酶活性对于恢复top three的缓慢生长表型是必需的。在SGS one top three背景下，Werner蛋白在整个GAL浓度范围内均能恢复SGS one top three的缓慢生长表型。

这些结果表明，在 sgs1-top3 突变体背景下，低水平的 Werner 蛋白表达即可恢复其缓慢生长表型。将含有 Werner 或其变异体的 sgs1、top3 菌株在对数生长期进行培养后，以十倍系列稀释法点种于含有葡萄糖或半乳糖以及 MMS 或 HU 的 SC 色氨酸平板上。我们观察到，Werner 的表达增强了 sgs1-top3 菌株对 MMS 和 HU 的敏感性。此外，Werner 在 sgs1-top3 背景下对 MMS 和 HU 敏感性的影响依赖于其 ATP 依赖性解旋酶活性，而不依赖于外切酶活性。

最后，Werner蛋白的表达也恢复了top three细胞中SG期的典型双延迟，表现为体积较大的成对细胞比例升高。在表达Werner的sgs1 top3突变细胞中，与携带空载体的sgs1 top3突变细胞相比，细胞经Dabi染色。

为了观察细胞核，箭头指示的是未分裂的细胞核中Werner蛋白的表达。在转化的sgs中，通过添加指定浓度的半乳糖诱导顶层三个细胞，诱导后六小时收集细胞。将等量的总细胞裂解液上样至8%至16%的聚丙烯酰胺SDS凝胶，随后使用抗Warner抗体进行蛋白质印迹检测。

我们向您展示了如何利用特定的酵母突变背景来研究与之相关的细胞表型，从而阐明人类学习相关基因通过其催化活性和蛋白质相互作用所介导的细胞与分子功能。酵母可作为模式生物用于研究该基因在特定通路中的功能。在进行这些实验操作时，选择合适的酵母突变背景以明确目标基因在特定通路中的作用至关重要。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。