Name: 在成年斑马鱼的眼窝射出 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-07T18:43:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: 学习成年斑马鱼眼窝注射技术，用于造血干细胞移植研究。该方法通过荧光显微镜观察标记红细胞的分布，为血液学研究提供可靠的活体模型实验手段。

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本工作由霍华德·休斯医学研究所及美国国立卫生研究院（NIH）资助，用于研究胚胎造血作用。

第1部分. 注射材料的制备
<ol>
 <li>Tg(globin:GFP) 细胞：</li>
 <li>使用涂有肝素（1 单位/微升）的 10 微升移液枪头刺破成年供体鱼的鳃后部，进行采血。</li>
 <li>吸取红细胞并将其加入细胞缓冲液（0.9× PBS + 5% FBS + 1% 青霉素/链霉素）中。</li>
 <li>将细胞悬液通过 40 µm 滤网过滤，并使用血细胞计数板按照 LeBlanc 等人先前描述的方法测定细胞浓度。</li>
 <li>离心后重悬于细胞缓冲液中，调整至所需浓度，使最终注射体积不超过 5 µL。本实验中，每条受体鱼注射 150 万至 200 万个细胞。</li>
 <li>对于德克萨斯红®葡聚糖，将染料溶解于 DPBS 中，使最终注射浓度为 10–12 mg/mL。计划每条鱼注射 4 µL。</li>
</ol>
第2部分. 注射
<ol>
 <li>用三卡因（4.2 ml (4 mg/ml) 三卡因 / 100 ml 鱼用水）麻醉斑马鱼。</li>
 <li>注射前用 70% 乙醇清洗 Hamilton 注射器 3–4 次，再用 0.9X DPBS 冲洗 3–4 次。</li>
 <li>将鱼背侧朝上、头朝右放置在湿润的海绵上。</li>
 <li>右手持 Hamilton 注射器，食指置于活塞上，左手轻轻固定鱼体。</li>
 <li>将针头斜面朝上放置，假设鱼眼为时钟，针头应指向 7:00 位置，并与鱼体呈 45 度角（图 1）。</li>
 <li>将针头轻柔地插入 7:00 位置 1–2 mm，然后缓慢下压活塞。</li>
 <li>将鱼放入新鲜 E3 水中恢复。</li>
 <li>在注射不同试剂之间，按上述方法清洗针头。</li>
 <li>每隔几分钟轻弹细胞溶液以重悬细胞，防止细胞聚集。</li>
 <li>处理后将鱼从循环水流中移出，持续 1 周，每日更换水以避免感染。此期间我们将鱼饲养在 ICU 水中（每 38 升 E3 水中加入 10 mL Stress Coat + 5 mL Pemafix + 5 mL Melafix）。</li>
</ol>
第3部分. 典型结果
如果操作正确，并且注射物质经过某种方式标记，则可以观察到注射物。例如，在注射后不久，应在荧光体视显微镜下观察到Tg(globin:GFP)红细胞在受体casper鱼的血管系统中循环，如图2所示。同样，将70 kDa Texas Red®标记的葡聚糖通过眶后注射到透明鱼体内后，可立即在血管系统中观察到荧光信号（图3）。来自Tg(β-actin:GFP)供体鱼的荧光肾脏细胞也可通过眶后途径注射到经辐照的casper受体鱼体内。这些细胞最终会归巢至受体的肾髓腔（图4a），并在数周后进一步重建肾脏造血组织（图4b）。
如果注射过浅或针头角度避开了眶后静脉窦腔，可观察到注射物质在眼部周围积聚或流出。相反，如果注射过深，鱼类可能会出现组织损伤或大量出血，尽管仍可能恢复。正确操作时，眶后注射后的死亡率应低于总注射鱼类的5%，而成功将物质递送至血液循环的比例应高于90%。
<img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig1.jpg" alt="斑马鱼昼夜节律研究；时间注射法示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1: 眶后注射技术示意图。鱼的右眼被表示为一个类比时钟，其中七点钟位置对应正确的注射位点。
<img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig2.jpg" alt="荧光显微镜图像，蛋白质定位，细胞结构，显微镜实验。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2: 成年casper鱼经眼眶后注射三天后，尾部血管中循环的 Tg(globin:GFP) 红细胞。
<img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig3.jpg" alt="斑马鱼显微成像，红色荧光突出显示鳍部肌肉结构和身体形态。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 图 3: 将作为染料使用的 Texas Red® 标记的 70 kDa 葡聚糖成功注射后，在透明成年斑马鱼 casper 中可观察到荧光标记的血管系统，使用标准的全动物荧光显微镜即可清晰观察。
<img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4a.jpg" alt="荧光发射检测、显微镜图像、高亮区域、生物学分析" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 4a"> 图 4a：将来自 Tg(β-actin:GFP) 供体鱼的全肾髓细胞经眶后注射后三天，可在经辐照的成年 casper 受体鱼的肾髓中观察到这些细胞的归巢现象。
<img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4b.jpg" alt="斑马鱼荧光显微镜图像，显示神经组织中GFP的表达。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4b"> 图4b：通过眶后注射来自Tg(β-actin:GFP)供体鱼的全肾髓细胞四周后，可在经辐照的成年casper受体鱼中观察到绿色供体全肾髓细胞对受体肾脏的重建造影。

<ol><li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+route+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Pinkerton, W., Webber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+injecting+small+laboratory+animals+by+the+ophthalmic+plexus+route%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Bio.+Med%22%5BJournal%5D)">A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route.</a> Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).</li>
<li>White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+whole+kidney+marrow+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
</ol>

成年斑马鱼的眶后注射可实现注入物质进入血液的最高递送效率，同时死亡率最低。由于注射部位的特性，穿刺点似乎愈合迅速，从而减少了感染的发生以及失血量。例如，在短期内可对同一部位进行多次重复注射，以实现药物的每日给药。
在传统的成年鱼类治疗方法中，需要购买大量药物，仅通过将鱼类浸泡在含有目标药物的水中进行给药。然而，若将药物直接注射入动物的血液中，则所需药物剂量显著减少，从而降低实验成本。对于某些因分子过大而无法通过浸泡进入鱼类循环系统的化合物（例如某些肽类），经眶后注射可能更具优势。
此外，由于在成年鱼中，眶后注射比心脏内注射技术更快、更简便，因此眶后注射的另一应用可能包括成年鱼的化学遗传学筛选。因此，眶后注射可极大促进需要化学物质或药物递送的斑马鱼研究。

<table><tbody><tr><td>肝素钠盐（源自猪肠黏膜）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>300 USP 单位预称重小瓶</td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>西方化学</td><td></td><td>MS-222</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red 葡聚糖&amp;#174;</td><td>分子探针，Life Technologies</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl&lt;br/&gt;0.17 mM KCl&lt;br/&gt;0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;0.33 mM MgSO₄&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>微升注射器</td><td>Hamilton公司</td><td>80300</td><td>701N 10μL 注射器（26s/2&amp;#8221;/2)</td></tr></tbody></table>

成年斑马鱼的眶后注射

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

对整体动物进行药物处理是药理学和化学生物学研究中任何模型系统的基本工具。静脉（IV）注射通常是递送目标试剂最有效且创伤最小的方式。在斑马鱼（Danio rerio)，由于血管直径较小，对斑马鱼进行静脉注射药物一直是一项挑战。这在造血干细胞移植过程中注射细胞时也构成了重大障碍。传统上，进入血液循环的注射是直接通过心脏进行的。然而，这种心脏内注射方法具有很高的死亡率，因为在注射过程中心脏常常被刺穿，导致斑马鱼容易发生感染、大量失血或致命的器官损伤。借鉴我们在小鼠实验中的经验，我们开发了一种新的斑马鱼注射方法，注射部位位于眼球后方并进入眶后静脉窦。这种眶后（RO）注射技术已成功应用于成年斑马鱼的药物注射以及全肾髓细胞的移植。与传统的心内注射相比，RO注射的死亡率显著降低。接受眶后注射的斑马鱼在注射后出血较少，且对心脏等重要器官造成损伤的风险大大降低。此外，若操作得当，注射的细胞和/或药物可迅速进入血液循环，使化合物能够对整条鱼发挥作用，同时使肾细胞易于归巢至其微环境。因此，这种新的注射技术在最大限度降低死亡率的同时，实现了将物质高效递送至成年斑马鱼血液中的目标。本文以Tg(globin:GFP) 细胞注入成年个体casper鱼类以及红色荧光染料（右旋糖酐，Texas Red）的注射 ) 转化为成体casper鱼。然后通过整体动物荧光显微镜观察来验证注射是否成功。

本文展示了如何对成年斑马鱼进行眶后静脉窦注射。

对整体动物进行药物处理是药理学和化学生物学研究中各类模型系统的基本工具。静脉注射（IV）是……

首先通过穿刺转基因珠蛋白GFP鱼供体动物的心脏并吸取红细胞，收集供体红细胞。待细胞准备好后，对受体鱼进行眶后注射，随后利用标准的整体动物荧光显微镜成像，以确认荧光标记细胞的成功注射。类似地，将与Texas red偶联的有色染料葡聚糖制备好后进行眶后注射，并对注射后的动物进行成像，以确认注射成功。大家好，我是来自波士顿儿童医院血液学与肿瘤学系Leonard Zan实验室的Emily Atch。今天我们将向您展示一种在成年斑马鱼中进行眶后注射的技术。在我们的实验室中，该技术用于造血干细胞移植的研究。那么我们开始吧。我们将演示将转基因珠蛋白GFP细胞和一种与德克萨斯红染料偶联的红色荧光葡聚糖通过眶后注射到成年Casper斑马鱼体内的操作。Casper斑马鱼是一种透明品系的斑马鱼，用于制备转基因珠蛋白。GFP细胞的获取是通过使用经肝素包被的10微升移液器吸头刺穿成年供体鱼的鳃后部，吸取红细胞，并将其转移至细胞缓冲液中。接下来，将细胞悬液通过40微米滤网过滤。按照LeBlanc等人先前所述方法，使用血细胞计数仪测定细胞浓度后，以1500 RPM离心5分钟。将细胞重悬于细胞缓冲液中，调整至所需浓度，使最终注射体积不超过5微升。在本实验中，我们将为每个受体注射 150 万至 200 万个细胞，以制备红色荧光染料，并将其溶解于 DPBS 中，使最终注射浓度为每毫升 10 至 12 毫克。由于注射操作步骤相同，每条鱼将注射 4 微升。无论注射何种物质，本演示仅展示红色荧光染料的注射过程。注射鱼类前，使用70%乙醇清洗Hamilton注射器三到四次。再用0.9 XDPS冲洗三到四次。将鱼在Trica中麻醉后，将其背侧朝上、头朝右放置于湿润的海绵上。用右手持装有样品的Hamilton注射器，右手食指按住推杆，同时用左手轻轻固定鱼体。将针头斜面朝上，若以鱼眼为钟面，则针头指向七点钟位置，并与鱼体呈45度角，轻轻将针头插入七点钟位置约1至2毫米，然后缓慢推动推杆。将鱼放入新鲜的E3水中恢复。停止流水养殖一周，并进行每日换水以避免感染，此期间我们将鱼饲养在ICU水中。当正确进行眶后注射时，可观察到被标记的注射物质。例如，在注射后第三天，可在受体成年Casper鱼尾部的血管中，通过荧光解剖显微镜观察到循环的转基因珠蛋白GFP红细胞；同样，将70千道尔顿与Texas red偶联的葡聚糖成功注射后，可立即观察到荧光标记的血管系统。在透明的成年Casper鱼中，可通过标准的全动物荧光显微镜清晰观察；来自转基因β-肌动蛋白GFP供体鱼的荧光头肾髓样细胞，也可通过逆行口服方式注射到经辐照的Casper受体鱼体内。如图所示，这些细胞在注射后三天归巢至受体的髓样组织；四周后，这些绿色的供体细胞可能进一步重建受体的肾脏造血系统。我们刚刚向您展示了如何在成年斑马鱼中进行眶后注射。进行此操作时，重要的是要记住将针头与鱼体平面呈45度角进行注射。就是这样。感谢观看，祝您的实验顺利。

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生物学

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