在成年斑马鱼的眼窝射出

首先通过穿刺供体动物的心脏并吸出红细胞，从转基因珠蛋白 GFP 鱼中收集供体红细胞。一旦准备好注射细胞，受体鱼就会在眶后注射，然后使用标准全动物荧光显微镜成像，以成功注射荧光标记的细胞。类似地，制备与德克萨斯红偶联的有色染料糊精并在眶后注射，并对注射的动物进行成像以成功注射。

大家好，我是来自波士顿儿童医院血液学和肿瘤科 Leonard Zan 实验室的 Emily Atch。今天我们将向您展示成年斑马鱼的眶后注射程序。我们在实验室使用该程序来研究造血干细胞移植。

那么让我们开始吧。我们将演示将转基因珠蛋白 GFP 细胞和与德克萨斯红偶联的红色荧光染料糊精的眶后注射到成年 Casper 鱼中，这是一种透明的斑马鱼品种，用于制备转基因 lobin。GFP 细胞使用涂有肝素的 10 微升移液器吸头刺穿鳃后面的鱼，吸出红细胞并将其分配到细胞缓冲液中，从而使成年供体鱼出血。

接下来，过滤超过 40 微米网孔的细胞悬液。如前所述，使用血细胞仪测定细胞浓度后，LeBlanc 等人以 1500 RPM 的速度在细胞上花费 5 分钟。Reus 将细胞以所需浓度悬浮在细胞缓冲液中，使最终注射体积不超过 5 μL。

在本演示中，我们将为每个受体注射 1.5 至 200 万个细胞以制备红色荧光染料，将其溶解在 DPBS 中，最终注射浓度为 10 至 12 毫克/毫升。我们将为每条鱼注射 4 微升，因为注射程序相同。无论注入的材料如何，我们都将仅演示红色荧光染料的注射。

在注射鱼之前，使用 70% 乙醇清洗汉密尔顿注射器 3 到 4 次。用 0.9 XDPS 冲洗 3 到 4 次。在 Trica 中麻醉鱼后，将鱼的背侧朝上并面向右侧放在潮湿的海绵上。

用右手握住装满的汉密尔顿注射器，用左手将食指放在柱塞上，轻轻稳定鱼体。将指针的斜面朝上放置，这样，如果鱼眼是一个时钟，指针将指向 7 点钟位置。并与鱼成 45 度角，轻轻地将针头插入 7 点钟位置 1 到 2 毫米，然后慢慢按下柱塞。

让鱼在新鲜的 E 三水中恢复。通过每天换水让鱼停止流动一周以避免感染，在此期间我们将鱼留在 ICU 水中。当正确执行眶后注射时，可以可视化已标记的注射材料。

例如，在注射三天后，在受体 Casper 鱼尾部脉管系统中循环的荧光解剖显微镜下可以看到转基因珠蛋白 GFP 红细胞，同样成功注射与德克萨斯红共轭的 70 道尔顿糊精会立即产生荧光脉管系统。在透明的成年 Casper 鱼中，很容易通过标准全动物荧光显微镜观察，来自转基因 β 肌动蛋白 GFP 供体鱼的荧光孔肾细胞也可以逆向口服注射到辐射的 Casper 受体鱼中。这些细胞最终将回到受体骨髓，如图所示，注射后 3 天，4 周后，这些绿色供体细胞可能会继续重新填充受体肾脏。

我们刚刚向您展示了如何对成年斑马鱼进行眶后注射。执行此程序时，请务必记住用针头与鱼平面成 45 度角注射。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。