使用Di-8-ANEPPS测量诱导膜电压

对生物学家而言，细胞是生命的基本单位，包含多种不同的细胞器，每个细胞器执行特定功能，共同使细胞能够完成其重要的生命活动。然而从电学角度来看，细胞的内部结构并不十分重要，可将其视为由绝缘膜包裹的导电胞质，外部则被导电环境所包围。由于离子浓度存在轻微失衡，过剩的离子在膜附近聚集，从而形成静息膜电位。

将细胞置于电场中会导致细胞膜两侧发生局部电荷重新分布。其结果是产生诱导膜电压，该电压会叠加在静息电压上，并在电场关闭后消失。对于简单的细胞形状，可以对球形细胞的诱导膜电压进行解析计算。

它由Schwan方程给出，该方程指出电压与电场强度和细胞大小成正比，并沿细胞膜呈余弦函数分布。对于更复杂的细胞形状，诱导电压可能显著偏离余弦函数，必须通过功能强大的计算机进行数值计算，或使用电位计量染料通过实验测定。其中一种广泛用于此目的的电位计量染料是di-8-ANEPPS。

一种快速染料，其激发和发射光谱依赖于膜电位，AIPs 在结合到膜上时会强烈荧光，且荧光强度的变化与膜电位的变化成正比。本视频展示了使用 D AIPs 测量诱导膜电位的实验方案。在此示例中，使用中国仓鼠卵巢细胞，以每孔 100,000 个细胞的密度将细胞接种于培养小室中。

在 HAMF 12 培养基中，添加胎牛血清、L-谷氨酰胺和抗生素，将细胞在培养基中孵育 2 至 4 小时，以获得呈球形的贴壁细胞；或孵育 16 至 20 小时，以获得形态更复杂的单个贴壁细胞。在原始小瓶中制备 1000 万 MO 储存液，将 diet aaps 溶解于 DMSO 中。某些细胞系可能需要额外添加 onic 以促进染料掺入细胞膜。取 1 毫升悬浮细胞，将最低必需培养基 SMEM 转移至 EOL 管中，加入 2.5 微升 20% onic 和 3 微升 10 毫摩尔的 diet aaps。

此步骤可获得含有约30 µM饮食AAPS和0.05%离子型化合物的负载溶液。用该负载溶液替换腔室中的培养基。将腔室转移至冰箱中，在4 °C温度下孵育10分钟。

染色后，通过质膜对染料的内吞作用在很大程度上受到抑制，需用纯SMEM小心洗涤去除多余的染料数次。最后，在培养腔中保留1.5毫升SMEM。使用配备油浸物镜、单色器和CCD相机的荧光显微镜观察细胞。

在采集软件中，将激发波长设置为 419 纳米，并选择一个中心波长约为 605 纳米的带通滤光片，尽管此处未实际应用。Diet aaps 还支持膜电压的比率测量。将装有细胞的腔室放置在显微镜载物台上，将电极置于腔室底部，并将其连接至脉冲发生器。

在此示例中，生成一个幅值为35伏、持续时间为50毫秒的方波脉冲。通过使用直流电压电源和由微处理器控制的开关装置，将该脉冲传递至一对电极，在电极之间形成电场，从而诱导出膜电压。脉冲的传递必须与图像采集同步。

找到目标细胞，对每个脉冲施加单个电脉冲或一系列脉冲。采集两幅荧光图像：一幅是在脉冲施加前立即获取的对照图像，另一幅是在脉冲期间获取的脉冲图像，这是由于染料的响应较慢。荧光的变化难以直接区分，只有在处理并打开每个脉冲对应的图像后才会变得明显。

在对照图像和脉冲图像中均减去背景。选择一个细胞，并设置感兴趣区域，使其与膜区域相对应。测量该区域在对照图像和脉冲图像中的荧光强度，并将每次脉冲的数值记录到电子表格中。

从脉冲数据中减去对照数据，再将结果除以对照数据，以获得相对荧光变化。如果施加了一系列脉冲，则可对每个脉冲确定的相对变化值进行平均。为了获得更可靠的测量结果，可将相对荧光变化转换为诱导的膜电压。

利用校准曲线，该曲线的粗略估计值可从文献中获得，但为了获得更高的准确性，必须针对每个特定的实验装置进行测量。将电压相对于相对弧长作图。对于球形细胞，也可使用适当的滤波器使曲线平滑。

所得绘图结果接近于与施万方程一致的余弦曲线。对于更复杂的细胞形状，相同步骤会产生更复杂的膜电位空间分布。