通过可逆生物素化测定质膜蛋白内吞速率

本方案提供了一种通用方法，通过使用可还原的膜不通透性生物素化试剂来测定大多数质膜蛋白的内吞速率。在此过程中，细胞表面含有胞外赖氨酸的蛋白质或在4°C下被磺基-NHS-SS-生物素（如图中绿色所示）共价标记的蛋白质。随后将细胞升温至37°C，以允许表面蛋白发生内吞。然后将细胞重新冷却至4°C以终止膜运输，并使用还原剂去除残留的表面生物素，该还原剂可断裂二硫键而保留内部标记。

因此，唯一保留下来的生物素标记蛋白是那些起源于细胞表面、已被内化并免受剥离步骤影响的蛋白。最后，细胞被溶解，生物素标记的蛋白通过链霉亲和素亲和层析进行分离。大家好，我是来自马萨诸塞大学医学院精神病学系Heli Milk Ian实验室的Luke Gabriel。

今天我们将向您展示一种利用可逆生物素洗脱技术来测量内吞或内化速率的实验方法。我们使用该方法来测定多巴胺转运体的内化速率。现在就开始吧。

实验前一天，准备细胞和基质，供次日使用。细胞类型和培养基会有所不同，但如果实验用细胞贴壁不牢固，则应在每个六孔板上使用适当的细胞粘附基质，例如多聚赖氨酸包被的组织培养板。共标记四个孔，使用两个独立的六孔板。

针对每种被测蛋白质，对照板上的两个孔将用于总表面蛋白和剥离对照。在实验板上为每种待测的内化条件准备一个孔。每孔接种一乘以十的六次方个细胞，加入两毫升细胞培养液，确保细胞在次日达到约80%的汇合度。

细胞培养后，配制以下溶液，并于4摄氏度保存，供第二天使用。PBS 2+ 溶液由pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水配制而成，添加1.5毫摩尔/升氯化镁和0.2毫摩尔/升氯化钙；终止反应缓冲液（tonation quench solution）由PBS 2+ 溶液添加100毫摩尔/升甘氨酸配制而成；NT缓冲液含150毫摩尔/升氯化钠、1毫摩尔/升EDTA、0.2% BSA和20毫摩尔/升Tris，pH为8.6；RIPA缓冲液含10毫摩尔/升Tris（pH 7.4）、150毫摩尔/升氯化钠、1毫摩尔/升EDTA、0.1% SDS、1% Triton X-100和1%脱氧胆酸钠。

接下来，将SULF N-H-S-S-S生物素溶解于SULFOXIDE或DMSO中，配制成浓度为200毫克/毫升的储备液。分装为500微升每份，于-20摄氏度保存。按照本三联方案，分装样品可经历多次冻融循环。

将二硫苏糖醇磷酸盐盐酸盐（TCEP）配制成浓度为500毫摩尔的储备液，溶解于50毫摩尔的Tris溶液中，并将pH值调节至7.4。由于TCEP具有强酸性，需在加入TCEP后、于-20摄氏度保存前，将溶液pH值调节至7.4并用铝箔包裹避光。第二天，配制含有0.18%葡萄糖和0.2%蛋白酶无活性的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS 2+ GBSA），并在水浴中预热至37摄氏度。

在室温下解冻SFO N-H-S-S-S生物素储备液。使用前立即配制新鲜的硫N-H-S-S-S生物素溶液，并充分涡旋振荡以溶解DMSO。

将两块板置于冷室中的冰浴上，每孔用2毫升冰预冷的PBS 2+溶液清洗三次，保持板子略微倾斜，以确保缓冲液完全排出。最后一次洗涤后，每孔加入0.75毫升新鲜的磺基-NHS-SS-生物素溶液，在冰浴中4摄氏度孵育15分钟，并在平台摇床上剧烈振荡，孵育结束前即完成此步骤。

另配制一份新鲜的SUHO N-H-S-S-S生物素溶液，并在15分钟时将旧溶液更换为新鲜溶液。第二次孵育后，在4°C下于摇床中剧烈振荡继续孵育额外15分钟，然后用2毫升淬灭缓冲液快速洗涤细胞3次，以淬灭所有未反应的NHS生物素分子。随后在2毫升淬灭缓冲液中孵育15分钟。

15 分钟后更换为新鲜的淬灭溶液，并继续孵育 15 分钟。每次孵育时，将培养板置于平台摇床上，在 4 摄氏度条件下轻轻振荡；对照板则放置在冷室中工作台上的淬灭溶液内。在此时点，将实验板从冷室中取出，置于冰浴上。

如果正在测试药物处理，将适当浓度的药物加入预热的含 GBSA 的 PBS 2 中。本实验中，我们使用乙醇溶剂或 1 µM 的佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）来激活 PKC 通路。每次用 2 mL 预热的含 GBSA 的 PBS 2 缓冲液洗涤实验板的每个孔，共洗涤三次，并在最后一次洗涤后加入含有相应药物处理的缓冲液。

加入2毫升相应的PBS加GBSA溶液，并用预热的培养基填充所有空孔，以确保整块板温度均匀。在孵育结束前立即把细胞转移至37摄氏度培养箱中孵育10分钟。使用NT缓冲液中50毫摩尔的TCEP溶液配制新鲜的洗脱溶液，并置于冰上保存。

每孔准备足量溶液，确保每孔1毫升。孵育10分钟后，迅速将实验板转移至冰浴中，并立即返回冷室。快速用冰冷的NT缓冲液每孔2毫升洗涤实验孔三次，以终止内吞作用。

然后用两毫升冰冻的 NT 缓冲液将剥离对照孔洗涤三次。将总对照孔保留在淬灭溶液中。向每个实验孔和剥离对照孔中加入一毫升剥离溶液，并在冰上孵育 15 分钟。

孵育结束前，在4°C条件下轻轻振荡。再次准备与之前相同体积的新鲜剥离溶液。15分钟后，将旧的剥离溶液更换为新鲜溶液，并在4°C条件下轻轻振荡继续孵育额外15分钟，以首先裂解细胞。

用两毫升 NT 缓冲液将暴露于剥离液的所有孔清洗三次。然后用两毫升冷 PBS 将所有孔（包括总对照孔）清洗三次。最后一次清洗后，向每个孔中加入 300 微升含有新鲜蛋白酶抑制剂的 RIPPA 缓冲液，于 4 摄氏度摇动 20 分钟以裂解细胞。

将裂解液转移至1.5毫升微量离心管中，在4°C条件下以18,000 ×g离心10分钟，去除细胞碎片。根据裂解条件选择相容的蛋白定量方法，例如使用Pierce公司的BCA蛋白检测试剂盒，以标准牛血清白蛋白曲线为参照测定裂解液中的蛋白浓度。随后，将裂解液制备用于链霉亲和素结合及亲和层析。

用等量的每种样品蛋白填充1.5毫升微量离心管。本实验中，我们从50微克细胞裂解液中分离生物素标记的蛋白质。向每个样品中加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液，使最终体积达到200微升。

接下来，在使用前将链霉亲和素包被的磁珠和琼脂糖珠充分涡旋振荡，用剪去尖端的200微升移液器吸取20微升链霉亲和素磁珠和琼脂糖珠加入每根离心管中。涡旋振荡各管，然后在4°C条件下于旋转仪上孵育过夜。次日，将样品在室温下以18,000 ×g离心2分钟收集磁珠，小心吸除上清液，避免吸头接触磁珠沉淀，随后加入0.75毫升室温的

向每管中加入裂解缓冲液，高速涡旋振荡以洗涤磁珠。在18,000 ×g下离心2分钟。室温下收集磁珠，并重复此洗涤、涡旋、离心步骤两次，共完成三次洗涤。

尽可能吸出缓冲液，注意不要扰动磁珠沉淀。随后，向每根管中加入 20 至 25 微升的 2× 还原性上样缓冲液。还原剂将裂解 N-H-S-S-S 生物素二硫键，使分离的蛋白质释放到溶液中。

由于大多数膜蛋白不能耐受煮沸处理，因此在还原和变性后，需将离心管置于旋转仪上，室温孵育30分钟以分离蛋白质。使用标准SDS-PAGE凝胶，将蛋白质电转移至膜上进行免疫印迹，并用适当的抗体孵育。在本实验中，我们使用来自Checon编号3609的鼠抗DAT抗体，按1:2000稀释，通过CCD相机凝胶成像系统捕获免疫反应性条带，确保无饱和像素。在本实验中，我们采用BioRad VersaDoc成像系统配合Quantity One软件对每条条带的密度进行定量分析。

此处展示的是多巴胺转运体可逆阻断实验中的一个代表性免疫印迹结果。最强信号为内化前表面蛋白的总量，见于“总蛋白”泳道（T）。理想情况下，“洗脱对照”泳道（S）应接近空白，表明洗脱效率高。洗脱效率通过以下公式计算，使用条带密度测量值：

本实验中使用的条带效率为99.8%。效率大于或等于90%的条带为理想结果，低于该水平的结果应予以舍弃。此孔条带示例显示条带泳道中存在可见条带，其条带效率为34%。此处较弱强度的条带来自实验板的内化泳道。细胞在10分钟内化过程中，分别用溶剂溶液或1微摩尔PMA处理，并检测多巴胺转运体的内化速率。

内化速率通过条带密度测量值计算，如下图所示，在溶剂处理条件下，10分钟内有10.4%的表面DAT发生内化。而PMA处理使DAT内化速率增加至总表面DAT的23.2%。至此，您已了解如何利用可逆生物素化技术测定质膜蛋白的内化速率。

需要牢记两点：一是生物素化试剂和TCP必须在使用前新鲜配制；二是在实验过程中若发现细胞损失过多，可在培养板上使用细胞粘附基质。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利成功。