Name: 衡量可逆的生物素的血浆膜蛋白吞价格 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 学习使用可还原生物素标记技术测量血浆膜蛋白的内吞速率。该方法通过温度控制和还原剂剥离表面标记，有效分离内化蛋白，适用于多巴胺转运体等膜蛋白动态研究。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 DA15169，授予 H.E.M.。

操作概述：
采用该方法，在运输受限条件（即低温）下，使用膜非渗透性、二硫键偶联的生物素标记试剂（sulfo-NHS-SS-生物素）对细胞表面蛋白的可及胞外赖氨酸残基进行共价标记（示意图见图1）。一组细胞转移至允许运输的条件（37°C），使生物素标记的蛋白发生内化；另一组细胞则保持在低温下作为对照，用于：1）确定时间为0时的总表面蛋白量，以及2）脱标对照。经过短暂的内化期后，细胞重新转移回低温环境以终止内化过程，并通过还原剂处理细胞去除残留的表面生物素，该还原剂可裂解二硫键偶联的生物素。来源于细胞表面并已内化的生物素化蛋白则在脱标步骤中受到保护，成为唯一保留的生物素化蛋白。细胞裂解后，利用链霉亲和素亲和层析分离生物素化蛋白，并通过定量免疫印迹检测目标蛋白。为确定内吞速率，将内化蛋白的量与时间为0时标记的总表面蛋白对照进行比较。我们已成功应用该方法测定神经元去甲肾上腺素1和多巴胺1-4转运体的内化速率。
详细实验步骤：
第1天：
<ol>
	<li>将细胞接种于6孔板中，使其在第2天达到约80%汇合度。或者，若使用转染细胞，则应以适当密度转染，使其在测定内化速率时达到约80%汇合度。若细胞贴壁不牢固，应使用细胞黏附基质（如聚-D-赖氨酸）处理组织培养器皿，以防止在多次洗涤步骤中发生细胞脱落。</li>
<li>针对每种待检测蛋白，在一块培养板上包被两个孔，用于总表面蛋白（t=0）和剥离对照。在第二块培养板上，针对每种内化条件（即基础内吞速率与药物处理）各包被一个孔。</li>
<li>配制以下溶液，并按指示温度保存，供第2天使用：<ul>
<li>PBS2+磷酸盐缓冲液（pH 7.4），添加 1.5 mM MgCl2，0.2 mM CaCl2, (4°C)</li>
<li>生物素化淬灭液PBS2+ 添加100 mM甘氨酸，（4°C)</li>
<li>NT缓冲液：150 mM NaCl，1.0 mM EDTA，0.2% BSA，20 mM Tris，pH 8.6，（4°C)</li>
<li>RIPA缓冲液：10 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，1.0 mM EDTA，0.1% SDS，1.0% Triton X-100，1.0% 脱氧胆酸钠，（4°C)</li>
<li>Sulfo-NHS-SS-生物素储存液：溶于二甲基亚砜（DMSO）至 200 mg/ml，(-20°C)</li>
<li>盐酸三(2-羧乙基)膦 (TCEP) 储备液： 500 mM in H2O, (-20°C，用铝箔包裹以避光</li>
</ul>
</li>
</ol>
第2天：
<ol>
<li>制备含0.18 g/ml葡萄糖和0.2%免疫球蛋白/蛋白酶-free牛血清白蛋白的PBS2+溶液（PBS2+/g/BSA）。将该溶液在水浴中预热至37°C。</li>
<li>在实验台面上解冻sulfo-NHS-SS-生物素储备液，使其DMSO完全融化。使用前立即配制新鲜的sulfo-NHS-SS-生物素溶液（2.5 mg/ml，溶于冰浴预冷的PBS2+中，每孔需0.75 ml）。剧烈涡旋以充分溶解DMSO。注意：NHS-生物素试剂在水溶液中极易水解，因此所有溶液均应在使用前即刻配制。</li>
<li>生物素标记：将培养板置于冷室中的冰浴上，用冰浴预冷的PBS2+冲洗3次，每次2 ml。确保培养板略微倾斜，以便缓冲液完全排出。向每孔加入0.75 ml新鲜配制的sulfo-NHS-SS-生物素溶液。在冰浴中4°C条件下剧烈振荡孵育15分钟。孵育结束后，重新配制新鲜的sulfo-NHS-SS-生物素溶液，替换原有溶液后继续在冰浴中4°C孵育15分钟。</li>
<li>淬灭：必须彻底淬灭所有未反应的NHS-生物素分子，以防止细胞裂解后其与胞内蛋白发生非特异性生物素标记。用淬灭溶液洗涤细胞3次，每次2 ml，并在2 ml淬灭溶液中轻柔振荡孵育两次，每次15分钟，4°C。</li>
<li>内化：若需测试药物处理效果，将适当浓度的药物加入PBS2+/g/BSA中。将对照组培养板保持在4°C，将内化实验组培养板移出冷室。用预热的PBS2+/g/BSA（含或不含药物）洗涤3次，每次2 ml，并将相同溶液（每孔2 ml）保留在孔中。向所有空孔中加入预热溶液，以确保培养板温度均匀。将细胞转移至37°C培养箱中孵育10分钟。在37°C孵育即将结束前，立即在NT缓冲液中配制新鲜的50 mM TCEP溶液（用于后续剥离步骤），置于冰上备用，每孔需1.0 ml。</li>
<li>剥离：立即将培养板转移至冰浴中并放回冷室。迅速用冰浴预冷的NT缓冲液洗涤细胞3次，每次2 ml，以终止内吞作用。同时用NT缓冲液洗涤剥离对照孔3次，每次2 ml。向每孔加入1.0 ml新鲜剥离溶液。在冰上4°C轻柔振荡孵育15分钟。更换为新鲜剥离溶液，继续在冰上4°C孵育15分钟。</li>
<li>裂解：用NT缓冲液洗涤所有经剥离溶液处理的孔，每次2 ml，共3次。然后用PBS2+洗涤所有孔（包括总蛋白对照孔），每次2 ml，共3次。每孔加入300 μl RIPA裂解缓冲液（或其他适用于目标蛋白的裂解缓冲液），其中含有新鲜配制的蛋白酶抑制剂（1.0 mM PMSF，每种leupeptin、aprotinin和pepstatin各1.0 μg/ml）。在4°C条件下振荡裂解20分钟。将裂解液转移至微量离心管中，在4°C以18,000 × g离心10分钟，去除细胞碎片。</li>
<li>蛋白浓度测定：使用与裂解条件兼容的蛋白定量方法（例如DC蛋白测定法，Bio-Rad），根据标准BSA曲线测定各裂解液的蛋白浓度。</li>
<li>链霉亲和素亲和层析：将各样品按等量蛋白分装至微量离心管中。加入裂解缓冲液，使各样品终体积为200 μl。剧烈涡旋使链霉亲和素琼脂糖珠充分混匀形成均匀悬液。使用剪去尖端的200 μl移液枪头将珠子加入各管中，推荐用量为每50 μg裂解蛋白使用20 μl珠子。在4°C旋转孵育过夜。</li>
</ol>
第3天：
<ol>
<li>珠子洗涤：将样品在18,000 × g离心2分钟，以收集珠子。小心吸除裂解液，避免吸头接触珠子沉淀。可在吸头末端使用塑料移液吸头以更好控制操作。向每管中加入0.75 ml裂解缓冲液，并涡旋振荡以洗涤珠子。再次于18,000 × g离心2分钟收集珠子，并重复吸除和洗涤步骤两次（共洗涤三次）。最后一次洗涤后，尽可能吸除缓冲液，但不要扰动珠子沉淀。将离心管朝向吸头倾斜有助于此步骤的进行。</li>
<li>样品洗脱：向每管中加入20–25 μl 2× Laemmli样品缓冲液（还原性）。还原剂将切割NHS-SS-生物素中的二硫键，使分离的蛋白质释放到溶液中。大多数膜蛋白在煮沸时极易发生聚集，因此在进行SDS-PAGE上样前不应加热。在开展这些实验之前，应先确定目标蛋白对热的耐受性。如果目标蛋白不能耐受煮沸或加热，则在进行SDS-PAGE分析前，于室温在旋转仪上孵育30分钟。此条件足以切割二硫键并洗脱蛋白质。</li>
<li>SDS-PAGE与免疫印迹：通过SDS-PAGE分离蛋白质。对于每个样品，建议按以下顺序上样：总表面蛋白（时间=0）、剥离组、内化条件#1、条件#2等。电转移至膜后，使用针对目标蛋白的特异性抗体进行免疫印迹。采用CCD相机凝胶成像系统捕获免疫反应条带，确保无像素饱和现象。使用凝胶分析/密度测定软件对各条带密度进行定量。</li>
</ol>
代表性结果：
图 2A 显示了一个典型的免疫印迹结果。“总”泳道（T）信号最强，代表内化前细胞表面蛋白的总量。“剥离”对照（S）理想情况下应接近空白，表明剥离步骤在实验中是高效的。剥离效率通过比较“剥离”泳道与“总”泳道的密度来计算（例如，该蛋白与剥离组同时进行了生物素标记，但既未在 37°C 下孵育，也未接触剥离溶液）。计算公式如下： [1-(剥离/总量)]*100%
根据此公式，图2中的条带效率为99.8%。最后，您将在内化泳道（I）中观察到强度低于总蛋白泳道的条带。在该示例（图2）中，细胞在10分钟的内化过程中分别用溶剂或1 μM佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）处理，并测量了多巴胺转运体在初始10分钟内化阶段的内化速率。内化速率的计算公式如下： 
内化量/总量×100
如图2B所示，在给予溶剂处理的条件下，10.4%的细胞表面DAT在10分钟内发生内化。PMA处理使DAT内化率增加至总表面DAT的23.2%。
<img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig1.jpg" alt="蛋白质内吞示意图；在不同温度下进行生物素标记、标记和分离的过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 实验方案示意图。 细胞在4°C下进行生物素标记，以特异性地标记细胞表面蛋白群体，随后转移至37°C以启动内吞过程。内吞完成后，细胞迅速冷却以终止内吞作用，残留的细胞表面生物素通过还原剂处理被去除。唯一保留下来的生物素化蛋白是那些在t=0时刻位于细胞表面并已被内吞的蛋白，因此它们免于被去除处理。通过链霉亲和素磁珠进行批量亲和层析分离生物素化蛋白，并利用免疫印迹检测目标蛋白。
<img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig2.jpg" alt="SDS-PAGE 凝胶和柱状图；PMA 处理对蛋白质内化影响的实验。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 图 2. PKC 激活增加 DAT 内吞速率。 内化实验。稳定表达 DAT 的 PC12 细胞在 4°C 下进行生物素标记，具体步骤见“详细方案”。将细胞迅速升温至 37°C，并在 ±1 μM PMA 条件下孵育 10 分钟（37°C）。通过还原法去除残留的生物素，随后裂解细胞，并利用链霉亲和素亲和层析分离生物素化蛋白。（A）代表性免疫印迹图显示在指定条件下 t=0 时的总表面 DAT（T）、漂洗对照（S）以及内化 DAT（I）。（B）使用 CCD 相机采集条带信号，并通过 Quantity One 软件（Bio-Rad）进行定量分析。数据以每 10 分钟内化 DAT 占总 DAT 的百分比表示。
<img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig3.jpg" alt="蛋白质电泳结果；TSI凝胶条带；分子量分离分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 显示生物素剥离效果不佳的免疫印迹示例。 内化实验。稳定表达DAT的PC12细胞在4°C下进行生物素标记，操作步骤详见“详细方案”。细胞迅速升温至37°C，并在37°C孵育10分钟。通过还原法去除残留生物素后，裂解细胞，并利用链霉亲和素亲和层析分离生物素化蛋白。该免疫印迹图显示了t=0时的总表面DAT（T）、剥离对照（S）以及内化DAT（I）。请注意剥离对照泳道中可见的条带，表明剥离效率较低。

<ol><li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li>
<li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li>
<li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+transporter+endocytic+determinants%3A+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li>
<li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li>
</ol>

常见问题：这些实验中最常见的问题是 stripping 效率低下。stripping 效率对于结果的解读至关重要。除非 stripping 效率非常高，否则无法得出内化泳道中任何生物素标记的蛋白质确实是从细胞表面内化的结论。stripping 效率 ≥90% 为最佳，若效率低于此水平，我们将舍弃所有结果。图 3 展示了一个低效 stripping 的示例。请注意，stripping 泳道中的条带非常明显，对应的 stripping 效率为 34%。如果出现 stripping 效率低下的情况，可能是在添加到细胞前未 freshly 配制 TCEP 溶液；或者 TCEP 已降解，需要购买新的试剂。使用 TCEP 粉末而非溶液形式，可能有助于避免此问题。
可能的修改： 在本报告中，我们测量了多巴胺转运体（DAT）内化在最初10分钟内的相对速率，并将其与蛋白激酶C（PKC）激活期间的DAT内化速率进行了比较。另一种方法是通过将细胞在不同时间点进行温育，以测定绝对内化速率。尽管这种方法可能实现，但根据我们的经验，早期时间点的信号水平较低，加之实验间的变异性，导...

通过可逆生物素化测定质膜蛋白内吞速率

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

质膜蛋白是一类庞大且多样的蛋白质，包括受体、离子通道、转运蛋白和泵。这些蛋白的活性介导多种关键的细胞事件，如营养物质的递送、细胞兴奋性以及化学信号传导。许多质膜蛋白通过内吞运输实现动态调控，这种调控通过改变蛋白在细胞表面的表达水平来调节其功能。介导蛋白内吞的机制十分复杂，目前对许多膜蛋白而言仍不完全清楚。为了全面理解调控特定蛋白内吞运输的机制，精确测定该蛋白的内吞速率至关重要。对于许多受体而言，通常可通过标记的受体配体直接测定其内吞速率。然而，对于转运蛋白、泵和离子通道等许多类型的膜蛋白，尚无便捷的配体可用于测定其内吞速率。在本报告中，我们描述了一种可逆生物素标记方法，用于测定多巴胺转运蛋白（DAT）的内吞速率。该方法为测量内化速率提供了一种简便的途径，并可广泛应用于大多数膜蛋白的运输研究。

受调控的内吞作用决定了大多数膜蛋白在细胞表面的表达水平。本文中，我们利用可还原且不能透过膜的生物素化试剂，测定多拓扑膜蛋白——多巴胺转运体（DAT）的内吞速率。该方法为测定大多数质膜蛋白内吞速率提供了一种简便直接的途径。

质膜蛋白是一类庞大且具有多样性的蛋白质，包括受体、离子通道、转运蛋白和泵。这些蛋白质的功能……

本方案提供了一种通用方法，通过使用可还原的膜不通透性生物素化试剂来测定大多数质膜蛋白的内吞速率。在此过程中，细胞表面含有胞外赖氨酸的蛋白质或在4°C下被磺基-NHS-SS-生物素（如图中绿色所示）共价标记的蛋白质。随后将细胞升温至37°C，以允许表面蛋白发生内吞。然后将细胞重新冷却至4°C以终止膜运输，并使用还原剂去除残留的表面生物素，该还原剂可断裂二硫键而保留内部标记。因此，唯一保留下来的生物素标记蛋白是那些起源于细胞表面、已被内化并免受剥离步骤影响的蛋白。最后，细胞被溶解，生物素标记的蛋白通过链霉亲和素亲和层析进行分离。大家好，我是来自马萨诸塞大学医学院精神病学系Heli Milk Ian实验室的Luke Gabriel。今天我们将向您展示一种利用可逆生物素洗脱技术来测量内吞或内化速率的实验方法。我们使用该方法来测定多巴胺转运体的内化速率。现在就开始吧。实验前一天，准备细胞和基质，供次日使用。细胞类型和培养基会有所不同，但如果实验用细胞贴壁不牢固，则应在每个六孔板上使用适当的细胞粘附基质，例如多聚赖氨酸包被的组织培养板。共标记四个孔，使用两个独立的六孔板。针对每种被测蛋白质，对照板上的两个孔将用于总表面蛋白和剥离对照。在实验板上为每种待测的内化条件准备一个孔。每孔接种一乘以十的六次方个细胞，加入两毫升细胞培养液，确保细胞在次日达到约80%的汇合度。细胞培养后，配制以下溶液，并于4摄氏度保存，供第二天使用。PBS 2+ 溶液由pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水配制而成，添加1.5毫摩尔/升氯化镁和0.2毫摩尔/升氯化钙；终止反应缓冲液（tonation quench solution）由PBS 2+ 溶液添加100毫摩尔/升甘氨酸配制而成；NT缓冲液含150毫摩尔/升氯化钠、1毫摩尔/升EDTA、0.2% BSA和20毫摩尔/升Tris，pH为8.6；RIPA缓冲液含10毫摩尔/升Tris（pH 7.4）、150毫摩尔/升氯化钠、1毫摩尔/升EDTA、0.1% SDS、1% Triton X-100和1%脱氧胆酸钠。接下来，将SULF N-H-S-S-S生物素溶解于SULFOXIDE或DMSO中，配制成浓度为200毫克/毫升的储备液。分装为500微升每份，于-20摄氏度保存。按照本三联方案，分装样品可经历多次冻融循环。将二硫苏糖醇磷酸盐盐酸盐（TCEP）配制成浓度为500毫摩尔的储备液，溶解于50毫摩尔的Tris溶液中，并将pH值调节至7.4。由于TCEP具有强酸性，需在加入TCEP后、于-20摄氏度保存前，将溶液pH值调节至7.4并用铝箔包裹避光。第二天，配制含有0.18%葡萄糖和0.2%蛋白酶无活性的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS 2+ GBSA），并在水浴中预热至37摄氏度。在室温下解冻SFO N-H-S-S-S生物素储备液。使用前立即配制新鲜的硫N-H-S-S-S生物素溶液，并充分涡旋振荡以溶解DMSO。将两块板置于冷室中的冰浴上，每孔用2毫升冰预冷的PBS 2+溶液清洗三次，保持板子略微倾斜，以确保缓冲液完全排出。最后一次洗涤后，每孔加入0.75毫升新鲜的磺基-NHS-SS-生物素溶液，在冰浴中4摄氏度孵育15分钟，并在平台摇床上剧烈振荡，孵育结束前即完成此步骤。另配制一份新鲜的SUHO N-H-S-S-S生物素溶液，并在15分钟时将旧溶液更换为新鲜溶液。第二次孵育后，在4°C下于摇床中剧烈振荡继续孵育额外15分钟，然后用2毫升淬灭缓冲液快速洗涤细胞3次，以淬灭所有未反应的NHS生物素分子。随后在2毫升淬灭缓冲液中孵育15分钟。15 分钟后更换为新鲜的淬灭溶液，并继续孵育 15 分钟。每次孵育时，将培养板置于平台摇床上，在 4 摄氏度条件下轻轻振荡；对照板则放置在冷室中工作台上的淬灭溶液内。在此时点，将实验板从冷室中取出，置于冰浴上。如果正在测试药物处理，将适当浓度的药物加入预热的含 GBSA 的 PBS 2 中。本实验中，我们使用乙醇溶剂或 1 µM 的佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）来激活 PKC 通路。每次用 2 mL 预热的含 GBSA 的 PBS 2 缓冲液洗涤实验板的每个孔，共洗涤三次，并在最后一次洗涤后加入含有相应药物处理的缓冲液。加入2毫升相应的PBS加GBSA溶液，并用预热的培养基填充所有空孔，以确保整块板温度均匀。在孵育结束前立即把细胞转移至37摄氏度培养箱中孵育10分钟。使用NT缓冲液中50毫摩尔的TCEP溶液配制新鲜的洗脱溶液，并置于冰上保存。每孔准备足量溶液，确保每孔1毫升。孵育10分钟后，迅速将实验板转移至冰浴中，并立即返回冷室。快速用冰冷的NT缓冲液每孔2毫升洗涤实验孔三次，以终止内吞作用。然后用两毫升冰冻的 NT 缓冲液将剥离对照孔洗涤三次。将总对照孔保留在淬灭溶液中。向每个实验孔和剥离对照孔中加入一毫升剥离溶液，并在冰上孵育 15 分钟。孵育结束前，在4°C条件下轻轻振荡。再次准备与之前相同体积的新鲜剥离溶液。15分钟后，将旧的剥离溶液更换为新鲜溶液，并在4°C条件下轻轻振荡继续孵育额外15分钟，以首先裂解细胞。用两毫升 NT 缓冲液将暴露于剥离液的所有孔清洗三次。然后用两毫升冷 PBS 将所有孔（包括总对照孔）清洗三次。最后一次清洗后，向每个孔中加入 300 微升含有新鲜蛋白酶抑制剂的 RIPPA 缓冲液，于 4 摄氏度摇动 20 分钟以裂解细胞。将裂解液转移至1.5毫升微量离心管中，在4°C条件下以18,000 ×g离心10分钟，去除细胞碎片。根据裂解条件选择相容的蛋白定量方法，例如使用Pierce公司的BCA蛋白检测试剂盒，以标准牛血清白蛋白曲线为参照测定裂解液中的蛋白浓度。随后，将裂解液制备用于链霉亲和素结合及亲和层析。用等量的每种样品蛋白填充1.5毫升微量离心管。本实验中，我们从50微克细胞裂解液中分离生物素标记的蛋白质。向每个样品中加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液，使最终体积达到200微升。接下来，在使用前将链霉亲和素包被的磁珠和琼脂糖珠充分涡旋振荡，用剪去尖端的200微升移液器吸取20微升链霉亲和素磁珠和琼脂糖珠加入每根离心管中。涡旋振荡各管，然后在4°C条件下于旋转仪上孵育过夜。次日，将样品在室温下以18,000 ×g离心2分钟收集磁珠，小心吸除上清液，避免吸头接触磁珠沉淀，随后加入0.75毫升室温的向每管中加入裂解缓冲液，高速涡旋振荡以洗涤磁珠。在18,000 ×g下离心2分钟。室温下收集磁珠，并重复此洗涤、涡旋、离心步骤两次，共完成三次洗涤。尽可能吸出缓冲液，注意不要扰动磁珠沉淀。随后，向每根管中加入 20 至 25 微升的 2× 还原性上样缓冲液。还原剂将裂解 N-H-S-S-S 生物素二硫键，使分离的蛋白质释放到溶液中。由于大多数膜蛋白不能耐受煮沸处理，因此在还原和变性后，需将离心管置于旋转仪上，室温孵育30分钟以分离蛋白质。使用标准SDS-PAGE凝胶，将蛋白质电转移至膜上进行免疫印迹，并用适当的抗体孵育。在本实验中，我们使用来自Checon编号3609的鼠抗DAT抗体，按1:2000稀释，通过CCD相机凝胶成像系统捕获免疫反应性条带，确保无饱和像素。在本实验中，我们采用BioRad VersaDoc成像系统配合Quantity One软件对每条条带的密度进行定量分析。此处展示的是多巴胺转运体可逆阻断实验中的一个代表性免疫印迹结果。最强信号为内化前表面蛋白的总量，见于“总蛋白”泳道（T）。理想情况下，“洗脱对照”泳道（S）应接近空白，表明洗脱效率高。洗脱效率通过以下公式计算，使用条带密度测量值：本实验中使用的条带效率为99.8%。效率大于或等于90%的条带为理想结果，低于该水平的结果应予以舍弃。此孔条带示例显示条带泳道中存在可见条带，其条带效率为34%。此处较弱强度的条带来自实验板的内化泳道。细胞在10分钟内化过程中，分别用溶剂溶液或1微摩尔PMA处理，并检测多巴胺转运体的内化速率。内化速率通过条带密度测量值计算，如下图所示，在溶剂处理条件下，10分钟内有10.4%的表面DAT发生内化。而PMA处理使DAT内化速率增加至总表面DAT的23.2%。至此，您已了解如何利用可逆生物素化技术测定质膜蛋白的内化速率。需要牢记两点：一是生物素化试剂和TCP必须在使用前新鲜配制；二是在实验过程中若发现细胞损失过多，可在培养板上使用细胞粘附基质。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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衡量可逆的生物素的血浆膜蛋白吞价格

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利用生物素标记进行体外生化实验研究蛋白质-核酸相互作用

本方案介绍了一种在细胞环境中实时测量腺嘌呤核苷酸与受体结合的方法。该结合过程通过三硝基苯基核苷酸衍生物与标记了非天然荧光氨基酸的蛋白质之间的荧光共振能量转移（FRET）进行检测。...

实时测量完整功能性膜蛋白的核苷酸结合

AviTag特异性定位限制性光照增强生物素化（ALIBi）是一种新型的光遗传学激活方法，用于标记和亲和纯化亚细胞区域的核糖体亚群，以进行后续的测序和蛋白质组学分析。...

基于重组肽标签特异性定位限制性光照增强生物素化的亚细胞核糖体亚群分离

本方案介绍了一种基于生物素连接酶与目标蛋白融合后，利用其邻近效应在活体（in...

体内邻近生物素化用于四膜虫（Paramecium tetraurelia）蛋白质相互作用研究

学习使用可还原生物素标记技术测量血浆膜蛋白的内吞速率。该方法通过温度控制和还原剂剥离表面标记，有效分离内化蛋白，适用于多巴胺转运体等膜蛋白动态研究。

通过可逆生物素化测定质膜蛋白内吞速率

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