光镜研究沉默突触的突触前
January 4th, 2010
谷氨酸突触主动模式可以切换到无声模式。我们证明，在啮齿类动物神经细胞的分离文化突触前的活动状态的可视化使用一个可修复的FM1 - 43染料形式活跃的突触形象化vGluT - 1抗体免疫可视化所有谷氨酸突触。
中枢神经系统中的一些突触前末梢看起来无功能或无声。在这里，我们提出了一种用于识别沉默突触前末梢的方案。该协议可用于识别怀疑沉默或唤醒终末的治疗和作。
该方案将神经元去极化过程中突触小泡的重要染料标记与随后用标记所有突触前末梢（包括沉默和活性）的抗体标记固定细胞相结合。突触。用染料和抗体共标记的抗体具有活性。仅由抗体标记的突触是沉默的。
嗨，我是来自华盛顿大学医学院精神病学系史蒂夫·米尼克博士实验室的阿曼达·泰勒 （Amanda Taylor）。我是 Shahin，也是来自 Manic Lab 的。今天，我们想展示您使用培养的海马神经元可视化沉默突触前末梢的程序。
我们在实验室中使用该程序来研究电活动和其他单一 noling 通路如何调节神经递质释放。那么让我们开始吧。在无菌层流罩中，使用 HIPA 不能购买从出生后第 0 天到三只大鼠或小鼠来制备解离的细胞培养物。
根据我们发布的方案，我们的培养物是混合神经胶质细胞来源的神经胶质细胞培养物应接种在无菌的 35 毫米培养皿中。每个都包含一个零号盖玻片，每毫升涂有 5 毫克胶原蛋白板。神经元的密度约为每平方厘米 500 个细胞。
12 只大鼠幼崽通常会产生 30 个 35 毫米的培养皿。让培养物在培养箱中生长 10 到 14 天。对于突触发育和成熟，在体外添加抗有丝分裂 a C 以阻止神经胶质细胞生长。
同样在体外第 5 天，用神经基础培养基加 B 27 补充剂进行半培养基交换，以提高此成熟期的神经元存活率。引入改变突触前沉默突触数量的治疗方法。我们发现，沉默大部分谷氨酸突触的一种便捷方法是用 30 毫摩尔钾处理 4 小时。
当培养物成熟时，神经元应具有相对较低的密度，具有分离良好且广泛的神经过程。从培养箱中取出培养物并将它们带到工作台上。用含有 45 毫摩尔氯化钾和 10 微摩尔 FM 1 43 FX 模具的缓冲盐水溶液替换培养基。
该解决方案还应包含 NBQX 和 A PV 以防止重复信号传输。重要的是将 FM 1 43 FX 储备溶液和实验保存在黑暗中以防止光漂白。因此，在所有后续的孵育步骤中，请用铝箔纸覆盖培养皿。
在室温下孵育整整 2 分钟。去除染料溶液，在含有 500 微摩尔逆药的缓冲盐水中洗涤 3 到 5 秒。七。在此步骤中去除非特异性染料时间至关重要。
由于长时间暴露于 adv 不利的 F 7 将去除所有 FM 43 FX 标签。然后洗涤细胞并堆缓冲盐水，无 adv 不利影响。7 次，5 次，间隔 2 分钟，在化学通风橱中。
将培养物在 4% paraldehyde 和 0.2% 戊二醛的 PBS 溶液中固定 10 分钟。用 PBS 短暂洗涤细胞。现在可以将细胞从通风橱中移出。
加入含有 4% 正常山羊血清和 0.04% tritton X 的封闭液以降低背景并渗透细胞以进行免疫染色。孵育 15 分钟。用在封闭溶液中稀释至 1 比 2000 的 vlu T one 抗体对细胞进行染色。
将培养物在抗体中轻轻摇动孵育 3 小时。用 PBS 洗涤细胞四次。用 Alexa 孵育细胞。
6 47 偶联的抗豚鼠抗体在封闭液中稀释至 1 比 500。轻轻摇动，将培养物保留在二抗中 30 分钟。用 PBS 再洗涤细胞四次。
使用镊子将一小滴地板量放在干净的载玻片上。拿起盖玻片，轻轻地将其降低到面向载玻片的地板量细胞液滴上。让载玻片干燥一夜。
在共聚焦激光扫描显微镜上准备 60 x 油物镜。将载玻片放在载物台上，使盖玻片面向物镜。找到一个不太密集且远离可以保留残留染料的胞体的神经突区域。
缩放到 51 x 51 微米的视场大小。使用图像采集软件。在 27 个步骤中采集覆盖 7.8 微米深度的 ZS 堆栈，每个步骤的 0.3 微米。
首先扫描 VLU T one 抗体，以识别现场中的所有谷氨酸能突触。然后重新扫描 FM 1 43 FX 荧光以分析采集后的图像。使用分析软件，根据每个像素集阈值处任何平面的最大强度读数，将 Z 定位转换为复合单平面图像。
为了减少背景，在不参考 FM 1 43 效应染色的情况下识别 VG glu T one 末端。并将这些点标记为感兴趣区域。我们通常为每个字段选择 10 个 UNTA。
在 FM 1 43 效果图像上重复阈值和点选择，并叠加图像以识别无声突触。绝对像素标准或百分比像素标准可用于区分活跃的 FM 1 43 阳性突触和非活跃的 FM 1 43 阴性突触。在我们的培养物中，我们发现 70% 至 80% 的由 V glut one 染色定义的谷氨酸突触在绿色 FM 1 43 荧光和红色 V glut one 染色的叠加图像中表现出可检测的 FM 1 43 染色。
这很明显，因为大量带有共定位标记物的黄色点状突触。这些由箭头指示。大约 20% 至 30% 的红色 V glut 一个阳性点将无法产生高于基线的绿色 FM 1 43 荧光。
这些是失活的突触前末端，箭头表示一个例子。还将观察到第三个突触群。这些对绿色 FM 1 43 荧光呈阳性，但没有红色 B glut one 染色。
这些是活跃的 GABA 能突触，一个例子用星号表示。这些被排除在我们的大多数分析之外，但可以使用囊泡 GABA 转运蛋白抗体进行明确研究。我们刚刚向您展示了如何使用 FM 1 43 和 VLU one 免疫染色来代替 VLU T one 抗体来观察突触前沉默
突触。执行此程序时，重要的是要记住 FM 1 43 FX 对 adver sub 7 洗涤的时间和封闭溶液中包含的处理 X 100 的浓度都敏感。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本研究提出了一种在中枢神经系统中识别无声突触前端的协议。通过结合活体染料标记和免疫染色，研究人员可以区分活跃和无声突触。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 突触功能
背景
- 一些突触前端是非功能性或无声的。
- 理解突触活动对神经科学研究至关重要。
- 识别无声端可以帮助研究各种治疗方法。
- 可视化突触活动可以提供神经元通信的洞察。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来识别无声突触前端。
- 探索治疗对突触活动的影响。
- 增强对神经网络中突触动态的理解。
使用的方法
- 神经元去极化期间突触小泡的活体染料标记。
- 用标记所有突触前端的抗体进行免疫染色。
- 联合标记技术以区分活跃和无声突触。
- 使用FM1-43染料来可视化活跃突触。
主要结果
- 可以使用FM1-43染料可视化活跃突触。
- 免疫染色揭示了所有突触前端，包括无声的。
- 该协议有效地区分活跃和无声突触。
- 研究结果有助于理解突触可塑性和功能。
结论
- 开发的协议是神经科学研究的有价值工具。
- 识别无声端可以为治疗策略提供信息。
- 该方法增强了对突触行为的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Identifying presynaptically silent synapses enables mechanistic de-risking in target validation by revealing functional heterogeneity in neuronal networks. This method supports predictive confidence in screening assays by distinguishing active from inactive glutamate release sites. It informs portfolio triage by linking synaptic plasticity mechanisms to disease-relevant systems in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying presynaptic silencing or activation states.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct visualization of vesicle release competence.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating cAMP signaling or electrical silencing with functional outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation using co-localization of FM1-43 FX and vGluT-1 signals.
- Quantitative Output: Enables standardized measurement of active synapse percentage via threshold-based image analysis.
- Reproducibility: Supports platform reuse through standardized fixation, staining, and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects presynaptic plasticity to hippocampal-dependent learning and memory pathways.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by monitoring synaptic adaptation to treatments.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying silent synapse populations under baseline and modulated conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a functional readout of presynaptic terminal activity prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of treatments that alter presynaptic silencing via potassium depolarization or cAMP activation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantification of glutamate release competence in dissociated hippocampal cultures.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., % FM1-43+/vGluT-1+ puncta) enabling condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling synaptic adaptation relevant to neuropsychiatric disorder mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for screening modulators of presynaptic function across neuronal models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct assessment of vesicle release probability.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via fixed-cell imaging and co-staining protocol.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in synaptic drug effects.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on functional synaptic modulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture, confocal microscopy, and fluorescence image analysis.
- Needs instrumentation including laser scanning microscope with 60x oil objective and Z-stack acquisition.
- Demands cross-team standardization of staining timing, dye concentration, and wash stringency.
- Involves adaptation considerations for non-hippocampal neuronal systems or alternative vesicle transporters.
- Includes practical limitations such as FM1-43 FX sensitivity to ascorbic acid wash duration and blocking solution composition.
