Name: 光镜研究沉默突触的突触前 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学习使用FM1-43染料与免疫染色技术识别中枢神经系统中的沉默突触前末梢。该方法结合活细胞染料标记与抗体染色，可区分活跃与沉默突触，为神经科学研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 DA018109 和 MH78823，以及 NIH 神经科学蓝图核心资助项目 P30NS057105（资助对象：华盛顿大学）。

培养物制备
<ol>
	<li>从出生后第0至第3天的大鼠或小鼠中制备海马细胞的离散细胞培养物1。我们的神经元附着在底层的星形胶质细胞单层上，而星形胶质细胞则附着在涂布于0号厚度盖玻片上的胶原层上。以每平方厘米约500个细胞的密度接种神经元。</li>
	<li>培养10至14天，以促进突触的发育和成熟。在体外培养第4天使用抗有丝分裂剂AraC处理，以抑制胶质细胞的进一步生长。在体外培养第5天，用Neurobasal培养基加B27补充剂进行半量换液，以提高神经元存活率。</li>
	<li>在培养期间，引入旨在改变功能沉默突触数量的处理方式。我们发现，一种简便的方法是使用30 mM钾处理4小时，可使大部分（约80%）谷氨酸能突触沉默。较长时间孵育但较弱的去极化刺激也可诱导类似的沉默效应2。使用50 μM forskolin（腺苷酸环化酶激活剂）刺激4小时，可用于唤醒基础状态下沉默的终末群体3。</li>
</ol>
可视化沉默突触
<ol>
	<li>体外培养第10至14天时，细胞应保持相对较低的密度，并具有清晰分离的神经突过程，以便通过荧光显微镜清晰观察到独立的突触终末。</li>
	<li>用蒸馏水配制5 mM FM1-43FX储备液。储备液需避光保存于4°C。所有使用FM1-43FX的实验也必须在避光条件下进行。</li>
	<li>用含45 mM氯化钾的HEPES缓冲盐溶液对培养物刺激2分钟，该溶液包含100 mM氯化钠、2 mM氯化钙、1 mM氯化镁、10 mM葡萄糖和10 μM FM1-43FX。此溶液还应含有1 μM NBQX和25 μM D-APV，以阻断突触后受体并防止重复信号传递。该刺激可标记具有胞吐和胞吞能力的突触终末。刺激时间和强度设计为诱导回收池中所有可利用囊泡至少完成一轮胞吐4。然而，该刺激强度不足以导致额外的突触终末沉默。</li>
	<li>仅用不含氯化钾但含500 μM Advasep-7的相同HEPES缓冲盐溶液洗涤培养物3至5秒，以去除非特异性染料5。请注意，此步骤的时间极为关键，因为长时间使用Advasep-7会导致所有FM1-43FX标记丢失。随后用不含Advasep-7的HEPES缓冲盐溶液洗涤五次，每次2分钟。</li>
	<li>用含4%多聚甲醛和0.2%戊二醛的PBS（pH 7.4）固定细胞10分钟。用PBS短暂洗涤一次后，再在封闭液（含4%正常山羊血清和0.04% Triton X-100的PBS）中孵育15分钟。需注意，FM1-43FX对本步骤及后续步骤中使用的Triton X-100用量非常敏感。通常情况下，不使用任何Triton X-100时FM1-43FX标记效果最佳，但为便于后续免疫染色所需的细胞通透，仍需使用少量去垢剂。我们通过经验确定，0.04% Triton X-100最适用于前突触沉默突触的检测。</li>
	<li>将vGluT-1一抗用封闭液按1:2500比例稀释。将细胞置于稀释后的一抗溶液中，在室温下轻轻振荡或旋转孵育3小时。务必用铝箔覆盖培养皿，防止FM1-43FX染料被漂白。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞两次，然后加入与FM1-43FX光谱特性不同的荧光染料偶联的抗豚鼠二抗，以区分两种染色信号。在本实验中，我们使用Alexa 555标记的抗豚鼠抗体，按1:500比例溶于封闭液中。将细胞在室温下振荡孵育30分钟。</li>
	<li>再用PBS洗涤四次，然后用少量Fluoromount-G将盖玻片封片于载玻片上。确保盖玻片朝向载玻片的一面为细胞所在面。让载玻片在室温下过夜干燥。</li>
	<li>现在可以开始采集活性与非活性突触的图像。在共聚焦激光扫描显微镜上安装60倍油镜（数值孔径1.4）。将载玻片置于载物台上，确保盖玻片一侧朝向物镜。聚焦后，选择一个神经突密度适中的视野。建议避免在细胞胞体附近成像，因为即使经过充分洗涤，FM1-43FX染料仍可能在该区域残留。在本实验中，我们通常将视野放大至51 × 51微米。</li>
	<li>对选定视野采集深度为7.8微米的z轴层扫图像，共27步，每步0.3微米。该范围足以覆盖本培养体系中神经突的厚度。在每一z轴层面，首先使用激发vGluT-1抗体免疫荧光的激光扫描，以识别显微镜视野中所有谷氨酸能突触。同一视野随后在同一层面重新扫描FM1-43FX荧光信号。在同一次实验的所有盖玻片中，中性密度滤光片和光电倍增管增益应保持一致，并避免信号饱和。我们通常在每个实验条件下采集≥5个视野。</li>
	<li>使用图像分析软件将z轴层扫数据合成为单平面复合图像。我们采用的最大强度投影法会基于每个像素点在所有层面中的最高强度生成图像。对复合图像进行阈值处理，并独立于FM1-43FX染色识别vGluT-1标记的突触终末用于分析。将染色区域（称为斑点）标记为感兴趣区域。我们通常在每个视野中选择10个斑点。随后对FM1-43FX通道进行阈值处理，并叠加感兴趣区域。利用分析软件量化每个信号的荧光强度及每个斑点的面积。可通过绝对像素标准或百分比像素标准区分活性与非活性突触。</li>
</ol>
代表性结果
<ol>
	<li>在我们的培养物中，发现70-80%的谷氨酸能突触（通过vGluT-1染色定义）表现出可检测到的FM1-43染色2, 6-8。在绿色FM1-43荧光与红色vGluT-1染色的叠加图像中，这表现为大量黄色斑点：即标志物共定位的突触。这些由箭头指示。</li>
	<li>约20-30%的（红色）vGluT-1阳性斑点不会显示出高于基线水平的（绿色）FM1-43荧光。这些为无活性的突触前终末，示例由箭头指示。</li>
	<li>还可观察到第三类突触群体。这类突触显示（绿色）FM1-43荧光阳性，但缺乏（红色）vGluT-1染色。这些为活跃的GABA能突触，示例由星号标记。这些突触在我们的大多数分析中被排除，但可通过使用囊泡GABA转运蛋白抗体替代vGluT-1抗体进行专门研究。</li>
</ol>

<ol><li>Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+synaptic+properties+of+hippocampal+neurons+grown+in+microcultures+and+in+mass+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures.</a> J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).</li>
<li>Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+activity+depresses+synaptic+function+through+an+effect+on+vesicle+priming%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiological activity depresses synaptic function through an effect on vesicle priming.</a> J. Neurosci. 26, 6618-6626 (2006).</li>
<li>Moulder, K. L., Jiang, X., Chang, C., Taylor, A. A., Benz, A. M., Conti, A. C., Muglia, L. J., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+role+for+Ca2%2B-dependent+adenylyl+cyclases+in+recovery+from+adaptive+presynaptic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing.</a> J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).</li>
<li>Sara, Y., Mozhayeva, M. G., Liu, X., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+vesicle+recycling+supports+neurotransmission+during+sustained+stimulation+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast vesicle recycling supports neurotransmission during sustained stimulation at hippocampal synapses.</a> J. Neurosci. 22, 1608-1617 (2002).</li>
<li>Kay, A. R., Alfonso, A., Alford, S., Cline, H. T., Holgado, A. M., Sakmann, B., Snitsarev, V. A., Stricker, T. P., Takahashi, M., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+lamprey%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 809-817 (1999).</li>
<li>Rosenmund, C., Sigler, A., Augustin, I., Reim, K., Brose, N., Rhee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+control+of+vesicle+priming+and+short-term+plasticity+by+Munc13+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential control of vesicle priming and short-term plasticity by Munc13 isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li>
<li>Altrock, W. D., tom Dieck, S., Sokolov, M., Meyer, A. C., Sigler, A., Brakebusch, C., Fassler, R., Richter, K., Boeckers, T. M., Potschka, H., Brandt, C., Loscher, W., Grimberg, D., Dresbach, T., Hempelmann, A., Hassan, H., Balschun, D., Frey, J. U., Brandstatter, J. H., Garner, C. C., Rosenmund, C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+inactivation+of+a+fraction+of+excitatory+synapses+in+mice+deficient+for+the+active+zone+protein+bassoon%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional inactivation of a fraction of excitatory synapses in mice deficient for the active zone protein bassoon.</a> Neuron. 37, 787-800 (2003).</li>
<li>Ting, J. T., Kelley, B. G., Lambert, T. J., Cook, D. G., Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+overexpression+depresses+excitatory+transmission+through+both+presynaptic+and+postsynaptic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 353-348 (2007).</li>
</ol>

意义
<ol>
	<li>通常认为，突触通过以可测量的概率释放递质来发挥作用。我们及其他研究者的工作表明，尽管某些突触具备完整的囊泡神经递质转运蛋白和其他关键的突触前标志物，但仍对神经递质的释放呈不应状态2, 6-8。我们先前已证明，神经元中的基础网络活动对于维持这类非活性突触群体至关重要。</li>
</ol>
关键步骤
<ol>
	<li>使用 500 μM Advasep-7 进行短暂洗涤可显著提高 FM1-43FX 染色的质量。然而，该洗涤步骤的时间即使略微超过 5 秒，也会导致 FM1-43FX 标记的丢失。</li>
	<li>FM1-43FX 对免疫染色步骤中所用 Triton X-100 的用量非常敏感。在完全不使用 Triton X-100 的情况下，FM1-43FX 标记效果最佳；但为了实现细胞通透以进行 vGluT-1 免疫染色，仍需使用一定量的去污剂。我们通过实验确定，0.4% Triton X-100 是检测突触前沉默突触的最佳浓度。</li>
</ol>
修改
<ol>...

<table><tbody><tr><td>FM1-43FX</td><td>Invitrogen</td><td>F-35355</td><td>红移的 FM4-64FX 也可获得，但其在突触前沉默检测中的适用性较差。</td></tr><tr><td>Advasep-7</td><td>CyDex</td><td>AR-0A7-001</td><td></td></tr><tr><td>vGluT-1</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5905</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647 标记的抗 GP 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A-21450</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr></tbody></table>

用光学显微镜研究突触前沉默突触

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

突触可塑性可能是神经系统具备学习与记忆能力的基础，也可能代表了一种适应性机制，可防止原本具有损伤性的刺激转变为神经毒性。我们一直在研究一种突触前可塑性形式，其引人关注的原因之一在于，它表现为突触前终末释放含神经递质谷氨酸囊泡能力的数字式开关调控。本文中，我们展示了一种用于可视化观察分离培养的啮齿类动物海马神经元中突触前终末活动状态的实验方案。该方法依赖于使用可固定的苯乙烯类染料FM1-43对活跃突触进行标记，该染料常用于标记突触囊泡。随后将该染色结果与使用抗囊泡谷氨酸转运体1（vGluT-1）抗体对相同突触前终末进行的免疫荧光染色进行比较，后者旨在标记所有谷氨酸能突触，而不论其激活状态如何。我们发现，去极化刺激可诱导突触前沉默。在基础条件下处于沉默状态的突触群体，可通过长时间的电沉默或激活cAMP信号通路而被唤醒。

谷氨酸能突触可从活动状态转换为沉默状态。我们证明了在分离培养的啮齿类动物神经元中，可通过可固定的FM1-43染料标记来显示活动性突触，同时结合vGluT-1抗体免疫染色以显示所有谷氨酸突触，从而可视化突触前活动状态。

突触可塑性很可能是神经系统学习和记忆能力的基础，也可能代表一种适应性机制，可防止原本……

中枢神经系统中的一些突触前末梢表现为无功能或静默状态。本文介绍了一种用于识别静默突触前末梢的实验方案。该方案可用于鉴定那些可能引起末梢静默或激活的处理方法和实验干预措施。该方案结合了神经元去极化过程中对突触小泡进行活体染料标记，随后对固定细胞使用抗体标记所有突触前终末（包括静息态和活跃态）。同时被染料和抗体标记的突触为活跃态，仅被抗体标记的突触为静息态。大家好，我是来自华盛顿大学医学院精神病学系Steve Minick博士实验室的Amanda Taylor。我叫Shahin，同样来自Manic实验室。今天我们将向您展示如何利用培养的海马神经元对静默的突触前终末进行可视化。我们在实验室中采用此方法研究电活动及其他单一信号通路如何调节神经递质的释放。现在开始操作。在无菌超净工作台中，使用HIPA，取出生后第0至第3天的大鼠或小鼠，制备分离的细胞培养物。根据我们已发表的实验方案，我们的培养物为混合胶质细胞培养物，应将来自同一解剖操作的细胞接种于无菌的35毫米培养皿中，每个培养皿内含一片经5毫克/毫升胶原蛋白包被的0号盖玻片，以每平方厘米约500个细胞的密度接种神经元。12只新生大鼠通常可获得30至35个毫米级培养皿。将培养物置于培养箱中培养10至14天。为促进突触发育与成熟，在体外培养第4天加入抗有丝分裂剂a C以抑制胶质细胞生长。同样在体外培养第5天，使用神经基础培养基（neurobasal medium）添加B27补充剂进行半量换液，以增强神经元在此成熟期的存活率。引入可改变突触前沉默突触数量的处理方法。我们发现，一种简便地使大量谷氨酸突触沉默的方法是用30毫摩尔氯化钾处理4小时。当培养物成熟时，神经元应具有相对较低的密度，且神经突起过程应充分分离并广泛延伸。将培养物从培养箱中取出，移至实验台。用含有 45 毫摩尔氯化钾和 10 微摩尔 FM 1-43 FX 染料的缓冲盐溶液替换培养基。该溶液还应含有NBQX和A PV，以防止反复信号传导。FM 1 43 FX储备液及实验过程需避光保存，以防止光漂白。因此，在后续所有孵育步骤中，均需用铝箔覆盖培养皿。在室温下准确孵育两分钟。移除染料溶液，并用含有500 µM Adversive.Seven的缓冲盐水洗涤，仅洗涤三至五秒。此步骤中，去除非特异性染料的时间控制至关重要。由于长期暴露于adv adverse F7会去除所有FM 43 FX标记，随后在化学通风橱中用不含adv adverse的七次缓冲盐水洗涤细胞，每次间隔5分钟，共洗两次。用含4%多聚甲醛和0.2%戊二醛的PBS溶液固定细胞，固定10分钟。用PBS短暂洗涤细胞。此时细胞可移出通风橱。加入含有4%正常山羊血清和0.04%Triton X的封闭液，以降低背景并通透细胞用于免疫染色。孵育15分钟。用封闭液将vlu T一抗稀释至1:2000，对细胞进行染色。将细胞在抗体中轻轻振荡孵育三小时。用 PBS 洗涤细胞四次。加入 Alexa 并孵育细胞。将647偶联的抗豚鼠二抗用封闭液按1:500稀释。将细胞在二抗溶液中轻轻振荡孵育30分钟。再用PBS洗涤细胞4次。使用镊子将少量地板样本液滴加到洁净的玻璃载片上。取一片盖玻片，将其缓缓倾斜放下，使盖玻片覆盖在载片上的样本液滴上。让载片在室温下过夜干燥。在共聚焦激光扫描显微镜上安装60倍油镜物镜。将载玻片放置于载物台上，使盖玻片朝向物镜。选择一个神经突较为稀疏且远离胞体的视野，以避免胞体残留染料的干扰。将视野调整为51 × 51微米。使用图像采集软件，采集Z轴堆栈图像，总深度为7.8微米，共27步，每步0.3微米。首先扫描 VLU T 一抗，以识别视野中所有的谷氨酸能突触。然后重新扫描 FM 1 43 FX 荧光，以便在图像采集后进行分析。使用分析软件，根据每个像素集阈值下各层面的最大强度读数，将 Z 轴序列转换为单层复合图像。为了降低背景信号，需在不参考FM 1-43染色效果的情况下识别VGluT1阳性神经末梢，并将这些信号点标记为感兴趣区域。我们通常每视野选择10个信号点。在FM 1-43效应图像上重复进行阈值设定和荧光点选择，并将图像叠加以识别静默突触。可采用绝对像素标准或百分比像素标准来区分FM 1-43阳性（有活性）与FM 1-43阴性（无活性）的突触。在我们的培养体系中，通过绿色FM 1-43荧光与红色Vglut1染色的叠加图像分析发现，由Vglut1染色所定义的谷氨酸能突触中有70%至80%表现出可检测到的FM 1-43染色信号。这表现为大量黄色斑点状突触与共定位标记物重叠，箭头所指即为此类结构。约有20%至30%的红色Vglut1阳性斑点在基线以上无绿色FM 1-43荧光信号。这些是无活性的突触前终末，箭头所示为一个示例。还会观察到第三类突触群体，它们呈现绿色FM 1-43荧光阳性，但缺乏红色Bglut1染色。这些是活跃的 GABA 能突触，星号所示为一个示例。这些突触被排除在我们大多数分析之外，但可通过囊泡 GABA 转运蛋白抗体进行专门研究。除了使用 VLU T1 抗体外，我们刚刚向您展示了如何利用 FM 1-43 和 VGLUT1 免疫染色来可视化突触前静默突触。进行此操作时，需要注意 FM 1 43 FX 对广告子七洗涤中的时间以及封闭液中所含 X 100 的浓度均敏感。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

presynaptically-silent-synapses-studied-with-light-microscopy

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

光镜研究沉默突触的突触前

本方案详细介绍了如何通过免疫细胞化学方法，在分离的神经元培养物和脑切片中定量突触数量。利用特定区室的抗体，我们标记突触前终末以及突触后特化位点。我们将突触定义为这些标记物产生的信号之间共定位的位点。...

量化突触：一种基于免疫细胞化学的突触数量检测方法

本报告展示了一种机械分离单个有活性神经元的技术，该神经元保留了附着的突触前末梢。经振动解离获得的神经元具有制备快速、药理学控制优良以及在无邻近细胞干扰的情况下改善空间钳制的优点。该方法可用于突触结构的成像及膜片钳记录。...

从啮齿类动物脑片中振动解离神经元以研究突触传递和成像突触前终末

本视频展示了在暗适应的小鼠视网膜组织切片标本中记录光诱发的突触后反应。将视网膜切片置于记录室中，使用记录电极与视网膜神经节细胞建立电学连续性。施加光脉冲以在神经节细胞中诱发兴奋性突触后电位，并由电极记录这些电位。...

小鼠视网膜切片中神经元的光诱发突触后反应

我们介绍了使用苯乙烯基FM染料对功能性神经末梢中的突触囊泡循环进行成像的方法。该方案不仅适用于诱发性突触活动，还可用于自发性和微小突触活动的检测。本方案拓展了可有效评估的突触事件类型。<br...

利用FM染料检测诱发性、自发性和微小突触活动期间的突触囊泡再循环

我们将演示如何从小鼠眼球制备视网膜切片，并记录视网膜神经元的光反应。整个操作均在暗适应条件下进行。...

使用膜片钳技术在暗适应小鼠视网膜切片制备中记录神经元的光诱发突触后反应

本视频展示了开颅手术操作，该手术可实现对小鼠压后皮层神经元的长期成像 体内 在 Thy1-GFP 转基因小鼠中进行双光子显微成像，并结合向背侧海马注射表达 mCherry...

双光子同步 在体 内 小鼠压后皮层突触输入与突触后靶标的成像

在此，我们展示了如何定量分析突触活性区的数量及其空间分布 果蝇...

分析长期光照后黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）感光细胞的突触调节

本方案展示了如何利用超分辨率显微镜研究原代神经元培养物中蛋白质的共定位。...

超高分辨率成像研究原代神经元中蛋白质与突触标志物的共定位

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

DetectSyn：一种快速、无偏倚的荧光方法用于检测突触密度的变化

本方案描述了使用透射电子显微镜（TEM）定量分析小鼠桶状皮层中昼夜节律变化的方法，主要关注突触数量和树突棘形态的变化。...

透射电子显微镜作为小鼠桶状皮层昼夜节律性突触可塑性分析的可视化技术

学习使用FM1-43染料与免疫染色技术识别中枢神经系统中的沉默突触前末梢。该方法结合活细胞染料标记与抗体染色，可区分活跃与沉默突触，为神经科学研究提供可靠工具。

用光学显微镜研究突触前沉默突触

探索更多视频