用光学显微镜研究突触前沉默突触

中枢神经系统中的一些突触前末梢表现为无功能或静默状态。本文介绍了一种用于识别静默突触前末梢的实验方案。该方案可用于鉴定那些可能引起末梢静默或激活的处理方法和实验干预措施。

该方案结合了神经元去极化过程中对突触小泡进行活体染料标记，随后对固定细胞使用抗体标记所有突触前终末（包括静息态和活跃态）。同时被染料和抗体标记的突触为活跃态，仅被抗体标记的突触为静息态。

大家好，我是来自华盛顿大学医学院精神病学系Steve Minick博士实验室的Amanda Taylor。我叫Shahin，同样来自Manic实验室。今天我们将向您展示如何利用培养的海马神经元对静默的突触前终末进行可视化。

我们在实验室中采用此方法研究电活动及其他单一信号通路如何调节神经递质的释放。现在开始操作。在无菌超净工作台中，使用HIPA，取出生后第0至第3天的大鼠或小鼠，制备分离的细胞培养物。

根据我们已发表的实验方案，我们的培养物为混合胶质细胞培养物，应将来自同一解剖操作的细胞接种于无菌的35毫米培养皿中，每个培养皿内含一片经5毫克/毫升胶原蛋白包被的0号盖玻片，以每平方厘米约500个细胞的密度接种神经元。

12只新生大鼠通常可获得30至35个毫米级培养皿。将培养物置于培养箱中培养10至14天。为促进突触发育与成熟，在体外培养第4天加入抗有丝分裂剂a C以抑制胶质细胞生长。

同样在体外培养第5天，使用神经基础培养基（neurobasal medium）添加B27补充剂进行半量换液，以增强神经元在此成熟期的存活率。引入可改变突触前沉默突触数量的处理方法。我们发现，一种简便地使大量谷氨酸突触沉默的方法是用30毫摩尔氯化钾处理4小时。

当培养物成熟时，神经元应具有相对较低的密度，且神经突起过程应充分分离并广泛延伸。将培养物从培养箱中取出，移至实验台。用含有 45 毫摩尔氯化钾和 10 微摩尔 FM 1-43 FX 染料的缓冲盐溶液替换培养基。

该溶液还应含有NBQX和A PV，以防止反复信号传导。FM 1 43 FX储备液及实验过程需避光保存，以防止光漂白。因此，在后续所有孵育步骤中，均需用铝箔覆盖培养皿。

在室温下准确孵育两分钟。移除染料溶液，并用含有500 µM Adversive.Seven的缓冲盐水洗涤，仅洗涤三至五秒。此步骤中，去除非特异性染料的时间控制至关重要。

由于长期暴露于adv adverse F7会去除所有FM 43 FX标记，随后在化学通风橱中用不含adv adverse的七次缓冲盐水洗涤细胞，每次间隔5分钟，共洗两次。

用含4%多聚甲醛和0.2%戊二醛的PBS溶液固定细胞，固定10分钟。用PBS短暂洗涤细胞。此时细胞可移出通风橱。

加入含有4%正常山羊血清和0.04%Triton X的封闭液，以降低背景并通透细胞用于免疫染色。孵育15分钟。用封闭液将vlu T一抗稀释至1:2000，对细胞进行染色。

将细胞在抗体中轻轻振荡孵育三小时。用 PBS 洗涤细胞四次。加入 Alexa 并孵育细胞。

将647偶联的抗豚鼠二抗用封闭液按1:500稀释。将细胞在二抗溶液中轻轻振荡孵育30分钟。再用PBS洗涤细胞4次。

使用镊子将少量地板样本液滴加到洁净的玻璃载片上。取一片盖玻片，将其缓缓倾斜放下，使盖玻片覆盖在载片上的样本液滴上。让载片在室温下过夜干燥。

在共聚焦激光扫描显微镜上安装60倍油镜物镜。将载玻片放置于载物台上，使盖玻片朝向物镜。选择一个神经突较为稀疏且远离胞体的视野，以避免胞体残留染料的干扰。

将视野调整为51 × 51微米。使用图像采集软件，采集Z轴堆栈图像，总深度为7.8微米，共27步，每步0.3微米。

首先扫描 VLU T 一抗，以识别视野中所有的谷氨酸能突触。然后重新扫描 FM 1 43 FX 荧光，以便在图像采集后进行分析。使用分析软件，根据每个像素集阈值下各层面的最大强度读数，将 Z 轴序列转换为单层复合图像。

为了降低背景信号，需在不参考FM 1-43染色效果的情况下识别VGluT1阳性神经末梢，并将这些信号点标记为感兴趣区域。我们通常每视野选择10个信号点。

在FM 1-43效应图像上重复进行阈值设定和荧光点选择，并将图像叠加以识别静默突触。可采用绝对像素标准或百分比像素标准来区分FM 1-43阳性（有活性）与FM 1-43阴性（无活性）的突触。在我们的培养体系中，通过绿色FM 1-43荧光与红色Vglut1染色的叠加图像分析发现，由Vglut1染色所定义的谷氨酸能突触中有70%至80%表现出可检测到的FM 1-43染色信号。

这表现为大量黄色斑点状突触与共定位标记物重叠，箭头所指即为此类结构。约有20%至30%的红色Vglut1阳性斑点在基线以上无绿色FM 1-43荧光信号。

这些是无活性的突触前终末，箭头所示为一个示例。还会观察到第三类突触群体，它们呈现绿色FM 1-43荧光阳性，但缺乏红色Bglut1染色。

这些是活跃的 GABA 能突触，星号所示为一个示例。这些突触被排除在我们大多数分析之外，但可通过囊泡 GABA 转运蛋白抗体进行专门研究。除了使用 VLU T1 抗体外，我们刚刚向您展示了如何利用 FM 1-43 和 VGLUT1 免疫染色来可视化突触前静默突触。

进行此操作时，需要注意 FM 1 43 FX 对广告子七洗涤中的时间以及封闭液中所含 X 100 的浓度均敏感。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。