使用单分子DNA拉伸含量直接观察DNA复制的酶

本视频演示了一种通过宽场光学显微镜观察线性化且化学修饰的λ-DNA复制过程的实验方案。将DNA固定在功能化的玻璃盖玻片上，DNA的游离末端用微珠标记，并通过层流拉伸DNA分子。

当复制启动时，由于螺旋作用，前导链开始延长，而后随链则缩短。在低作用力下，双链DNA与单链DNA之间存在显著的长度差异，这使得DNA复制过程中的结构转换可被直接观察。通过追踪微珠的位置来监测DNA构建物的长度，从而能够精确测定DNA复制的速率和过程。

您好，我是来自哈佛医学院生物化学与分子药理学系的 Ari Ulrich，我们的实验室由 Anto Vanian 和 Charles Richardson 领导。今天我们将向您展示一种在单分子水平上对 DNA 复制进行成像的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究 DNA 合成过程中发生的酶活性。

现在开始实验。在此操作的起始阶段，线性化的细菌噬菌体λ DNA通过弯曲的寡核苷酸进行修饰，形成复制叉，包括λ互补叉臂、生物素标记的叉臂以及叉形引物。生物素标记的叉臂在其5'端连接有一个生物素分子（biotin），该结构可将DNA模板锚定在流动池表面。

通过退火进一步修饰λ DNA，即加入另一种含有地高辛（diggen）基团的寡核苷酸，该基团可作为高亲和力免疫标签，用于连接微珠。为构建复制叉，除λ DNA外，还需准备若干寡核苷酸，其序列可在本视频配套的书面方案中找到。这些寡核苷酸包括一条生物素化的复制叉臂、一条λ互补复制叉臂、一条复制叉引物以及一条λ互补的地高辛末端寡核苷酸；使用T4多核苷酸激酶对λ互补复制叉臂和λ互补地高辛末端寡核苷酸的5′端进行磷酸化处理。

接下来，将磷酸化的λ互补叉臂、生物素标记的叉臂、叉形引物和λDNA按10:10:100:1的摩尔比混合。在T4 DNA连接酶缓冲液中，将混合物于65摄氏度加热5分钟，随后关闭加热模块，使其缓慢冷却至室温，以促进寡核苷酸与T4 DNA连接酶在混合物中的正确退火，并在室温下孵育2小时。在此条件下，T4 DNA连接酶将催化寡核苷酸与λDNA之间切口的连接。

通过在T4连接酶缓冲液中加入磷酸化的λ互补地高辛末端，与DNA复制模板末端连接，将混合物在45摄氏度孵育30分钟，随后通过关闭加热模块使温度缓慢降至室温。再向混合物中加入T4 DNA连接酶，将磷酸化的λ互补地高辛末端连接至DNA复制模板，于室温孵育两小时。最终的DNA复制模板现已制备完成，可供使用。为了将磁珠活化的tassel与DNA复制模板连接，必须使用针对地高辛的特异性FAB片段对磁珠进行功能化修饰。

开始此操作时，重悬磁珠的储存液，并将400微升转移至一个离心管中。将该管放入磁力架中，孵育至溶液澄清。然后用移液器吸除上清液。为活化用于抗体偶联的羧基基团，加入1毫升活化缓冲液，并用移液器轻轻混匀。

再次使用磁力分离器去除上清液。接着，加入 240 微升 FAB 片段，并将磁珠重悬于 400 微升硼酸盐缓冲液中。充分混匀后，在 37 摄氏度下于旋转仪中孵育 16 至 24 小时。

孵育后，使用磁力分离器分离磁珠并移除上清液。用一毫升洗涤缓冲液洗涤磁珠，并在四摄氏度下孵育五分钟，然后使用磁力分离器移除缓冲液。此洗涤步骤重复两次。

为了封闭游离的甲苯磺酰基团，加入一毫升含有 Tris 缓冲液的 BSA，并在 37 摄氏度下孵育四小时。孵育结束后，使用磁力分离器从磁珠中移除缓冲液，用缓冲液洗涤两次并分装。使用时，将待复制的 DNA 连接到经氨基硅烷功能化的玻璃盖玻片上。

Amil试剂中的氧基团与玻璃结合，留下一个氨基可用于与生物素化的PEG分子结合。这种涂层有助于减少非特异性结合。为彻底清洁玻璃盖玻片，将其放入染色缸中，并用乙醇充满染色缸后进行超声处理。

用一摩尔浓度的氢氧化钾超声处理液冲洗烧杯30分钟，然后注满该溶液超声处理30分钟，重复上述清洗步骤两次。第一次功能化反应前必须彻底去除所有残留水分。将烧杯中注满丙酮，超声处理10分钟。

倒空玻璃罐，并重新加入丙酮。随后向玻璃罐中加入西纳试剂，振荡两分钟。然后用大量过量的水淬灭反应。

然后将盖玻片置于烘箱中，在110摄氏度下烘烤30分钟以干燥。接着配制浓度约为0.2%（重量/体积）的PEG混合液。使用生物素化PEG并加入玻璃盖玻片间隔物，可使盖玻片彼此分离，将100微升该溶液滴加到干燥的硅化盖玻片上。

在上方放置第二块盖玻片。将盖玻片在PEG溶液中孵育3小时。然后将每对盖玻片分开，并用大量水充分洗涤。

注意保持盖玻片的功能化面朝上，因为只有一侧涂有聚乙二醇（peg）。最后用压缩空气吹干盖玻片，并在真空干燥器中保存，其表面至少一个月内保持稳定。因此可一次性制备数十个盖玻片，按需使用。

现在盖玻片已准备就绪，可以组装单分子实验用的流动池。该单分子实验采用由功能化盖玻片、双面胶带、石英载玻片和管路构成的简易流动池进行。每次单分子实验均需制备一个流动池。

首先，将5毫升封闭缓冲液与20毫升工作缓冲液混合，并将混合液置于真空干燥器中以去除后续步骤中可能产生的气泡。接着，取100微升链霉亲和素包被的PBS工作液均匀涂布于PEG功能化的盖玻片表面，在室温下孵育20分钟，使链霉亲和素（strp din）与表面的生物素结合。在此期间，裁剪一段双面胶带以匹配石英载片的尺寸，并在胶带上标记出管路孔的位置。

用笔画出流室的轮廓，包括一个三毫米宽的中央通道以及包含两个孔的矩形区域。流室可设计为具有两个入口和两个出口的Y形通道。现在沿所画轮廓裁剪标记好的胶带，裁切时保持直线且切口整齐，确保没有胶粘剂突入通道内。

使用丙酮彻底清洁石英载玻片，以去除先前实验中流动池构建所用的粘合剂。找到通道轮廓的最佳对齐位置。移除粘合剂背衬的一侧，并小心地将胶带贴到载玻片上。

请注意正确对齐胶带，确保入口和出口孔保持畅通。接下来，准备内径为 0.76 毫米的管路，将其剪成适当长度，用于流路池的入口和出口。将管路末端以约 30 度角斜切，以防止管路末端紧贴腔室底部而被压平。

将管路悬挂在试管架上，以便在后续步骤中方便地连接到流动池。此时，盖玻片的孵育应已结束。用清水彻底冲洗盖玻片，并用压缩空气吹干。

注意不要将盖玻片翻转，因为只有一侧用 PEG 进行了功能化处理。通过移除另一侧的胶带背衬，并将石英载片放置在盖玻片上，完成流动室的组装。轻轻按压盖玻片，以挤出粘合剂中可能夹带的空气，这有助于防止气泡进入流动通道。

用环氧树脂密封腔室的侧面。将切割好的管子插入石英片的孔中，并用环氧树脂固定。静置几分钟使其干燥。

干燥后，使用21号针头将部分DGAs封闭缓冲液从其中一根管子中抽出，以封闭反应室表面。反复冲洗数次以去除气泡，并让反应室孵育至少30分钟，然后进行单分子复制实验。在DNA模板功能化磁珠和流动反应室制备完成后，即可开展单分子实验。

首先，将流动池放置在显微镜载物台上。使用载物台夹固定流动池，并确保流动通道与CCD相机对齐。将先前构建的空气弹簧连接至注射泵以及流动池的出口管路。

使用较大直径的连接管，将流动池的进样管插入封闭缓冲液中，并回拉注射器以去除管路中的气泡，轻轻弹动出样管以清除流动池中滞留的气泡。待所有气泡完全排除后，用针头堵住其中一根进样管，并将其中一根出样管弯折180度后用胶带密封固定。在向流动池中加入DNA之前，将储备DNA模板用1毫升DGA one x封闭缓冲液稀释至10皮摩尔。以中等流速将模板溶液注入反应室，以确保DNA在表面充分覆盖。

将储备珠溶液稀释至每毫升含2×10⁶到4×10⁶个微珠。在1毫升DGA中加入一倍体积的封闭缓冲液。然后涡旋混合，并超声处理20秒。

将稀释后的微珠溶液注入腔室。加入微珠后，关闭流体流动，使腔室达到平衡状态。随后关闭两个出口管。

在未关闭腔室的情况下对管道进行任何改动，都会引起压力波动，从而对磁珠施加较大的作用力，并剪切固定在磁珠上的DNA分子。使用第二个入口管和针头堵住用于加载磁珠的入口管。开始用一倍浓度的阻断缓冲液对流动池进行充分洗涤，以去除未结合的DNA和杂质。

通过轻敲来搅动载物台，以去除非特异性吸附在表面的磁珠并检查其情况。磁珠通过DNA连接固定。尝试改变液体流动方向。

一旦充分去除游离的珠粒，关闭流液，使反应腔室达到平衡状态。根据文本方案中的说明，配制含有复制蛋白的新鲜反应混合液。关闭敞开的出口管，将入口储液器切换至 freshly prepared reaction mixture。

缓慢打开出口，以避免压力快速变化，从而继续进行酶促反应。首先，以适中的流速将蛋白质溶液流入反应室，以实现与DNA的高效结合。关闭流体流动，使反应室达到平衡状态。

关闭出口管路，更换含有反应混合物的管路。使用含有 DGAs 洗涤缓冲液的管路，洗涤腔室以去除游离蛋白质。再次关闭流体流动，使腔室达到平衡状态。

关闭出口管并更换含有洗涤缓冲液的管。将含有T7复制缓冲液的管放回，T7复制缓冲液中含有可启动复制反应的氯化镁。使用0.012毫升/分钟的流速，该流速在此方案所述条件下对应于对DNA锚定链施加3皮牛的拖拽力。

成像前，将稀土永磁体置于流动池上方，以防止磁珠与表面之间发生非特异性相互作用。将光纤照明器放置在靠近显微镜视场的位置，入射角在10度至与显微镜载物台平行之间，使用10倍物镜和CCD相机。采用暗场照明，通过连接磁珠提高磁珠成像焦点的对比度。

以较慢的帧率开始数据采集，持续 20 至 30 分钟。在成功的实验中，可同时观察到 100 个微珠。实验应产生大量显示前导链 DNA 合成的轨迹。

为了测量DNA解旋和聚合的速率及过程性，必须精确定位磁珠的位置。使用二维高斯函数对这些位置进行拟合。通过跟踪软件逐帧追踪磁珠位置，以可视化其运动轨迹。

然后使用任意图形软件将珠子位置对时间作图，以获得速率数据。对曲线进行线性回归拟合，并计算持续运动过程的斜率。确定一次缩短事件从开始到结束的DNA总长度。

将所有单次测量结果合并，并分别使用高斯函数和单指数函数对速率和产物分布进行拟合。我们刚刚向您展示了如何在单分子水平上测量DNA复制的速率和持续性。在进行该实验时，重要的是要确保层流产生的力和剪切力不会影响复制蛋白的酶活性。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利愉快。