Name: 使用单分子DNA拉伸含量直接观察DNA复制的酶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 3 s
Description: 了解使用宽场光学显微镜实时观察单分子DNA复制的方法。该技术利用Lambda DNA和层流拉伸技术，精确测定DNA复制的速率和过程，为研究DNA合成中的酶活性提供有力工具。

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DNA拉伸实验的开发得到了Paul Blainey、Jong-Bong Lee和Samir Hamdan的帮助。本工作由美国国立卫生研究院向Charles Richardson（资助号GM54397）和Antoine van Oijen（资助号GM077248）提供的基金支持。

1. DNA复制模板
反应所用的DNA是经过线性化的λ DNA，通过寡核苷酸退火形成复制叉结构。此外，生物素连接在λ DNA一条链的一端，而地高辛标记基团则连接在同一链的另一端1。
材料： 噬菌体λ DNA，寡核苷酸：生物素标记的叉状臂（A：5'-生物素-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC-3'），λ互补叉状臂（B：5'-GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAGATATGGCA-3'），叉状引物（C：5'-TGCCATATCTGAAATCCTCCCTGC-3'），λ互补地高辛标记末端（D：5'-AGGTCG CCGCCCAAAAAAAAAAAA-地高辛-3'），T4 DNA连接酶，T4多核苷酸激酶，加热金属块。
<ol>
 <li>使用T4多核苷酸激酶对寡核苷酸B和D的5'端进行磷酸化。</li>
 <li>将寡核苷酸A、B和C以一步法退火至λ DNA：在T4 DNA连接酶缓冲液中，加入过量10倍的寡核苷酸A和B，以及过量100倍的寡核苷酸C。</li>
 <li>将混合物置于加热块中加热至65 °C。加热完成后关闭加热块，使其缓慢冷却，以确保寡核苷酸正确退火。</li>
 <li>向混合物中加入T4 DNA连接酶，在室温下孵育2小时。T4 DNA连接酶将催化寡核苷酸A与B以及λ DNA之间的正确连接。</li>
 <li>最后，在T4 DNA连接酶缓冲液中，加入相对于λ DNA过量100倍的寡核苷酸D，使寡核苷酸D退火至DNA复制模板上。</li>
 <li>将混合物在加热块中于45 °C孵育30分钟，随后关闭加热块，使其缓慢冷却至室温。</li>
 <li>最终的DNA复制模板现已制备完成，可供使用。我们将模板以1.4 nM的浓度保存于4 °C，可稳定数周。</li>
</ol>
2. 磁珠
珠子上修饰有针对地高辛的Fab片段，随后可将其连接到DNA复制模板上2。
材料：Tosyl 活化微珠、抗地高辛 Fab 片段、缓冲液 A：0.1 M H3BO3 pH 9.5、缓冲液 B：0.1 M PBS pH 7.4，0.1% w/v BSA、缓冲液 C：0.2 M Tris-HCl pH 8.5（25 °C），0.1% w/v BSA、磁力分离器、旋转仪。
<ol>
	<li>重悬磁珠的储存液，并取少量分装至离心管中。将离心管放入磁力架的插槽中，孵育至溶液澄清，然后用移液器吸去上清液。</li>
	<li>加入缓冲液A，以活化甲苯磺酰基团用于抗体偶联。通过移液轻轻混匀，然后使用磁力架去除缓冲液。</li>
	<li>加入Fab片段，并再次用缓冲液A重悬磁珠，充分混匀后，在37 °C下旋转孵育16–24小时。孵育结束后，使用磁力架分离磁珠并去除缓冲液。</li>
	<li>加入缓冲液B进行洗涤，在4 °C下孵育5分钟，然后使用磁力架去除缓冲液。重复洗涤两次。</li>
	<li>加入缓冲液C，在37 °C下孵育4小时，以封闭未反应的甲苯磺酰基团。使用磁力架分离磁珠并去除缓冲液。</li>
	<li>用缓冲液B洗涤两次，分装后即可使用。磁珠可在4 °C下保存1年或更长时间而不会显著降低质量（我们的储存液浓度为1–2×109 个磁珠/mL）。</li>
</ol>
3. 功能化盖玻片
为了使DNA能够附着在玻璃盖玻片上，首先用氨基硅烷对玻璃进行功能化处理，然后将其与生物素化的PEG分子偶联。这种涂层有助于减少DNA和复制蛋白与表面的非特异性相互作用3,4。
材料： 玻璃盖玻片、染色缸、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、甲氧基-PEG5k-NHS酯、生物素-PEG5k-NHS酯、丙酮、1M KOH、乙醇、烘箱、水浴超声仪
<ol>
	<li>将玻璃盖玻片放入染色缸中，并用乙醇充满染色缸，彻底清洗盖玻片。超声处理30分钟，倒出乙醇并用1 M KOH充满染色缸。重复上述清洗步骤一次。</li>
	<li>进行第一次功能化反应前，必须去除所有残留水分。用丙酮充满染色缸并超声处理10分钟。倒空后再次用丙酮充满染色缸。</li>
	<li>在丙酮中配制体积分数为2%的硅烷试剂溶液。将该溶液加入染色缸中，振荡反应2分钟。此反应使氨基硅烷的烷氧基与玻璃表面结合，留下可用于下一步偶联反应的活性氨基。用大量水淬灭反应。</li>
	<li>将盖玻片置于110 °C烘箱中烘烤30分钟以干燥。</li>
	<li>在100 mM NaHCO3（pH 8.2）溶液中配制甲氧基与生物素化PEG比例为50:1的混合液，目标浓度约为0.2 % w/v的生物素化PEG。</li>
	<li>用移液器吸取100 μL PEG混合液滴加到干燥的硅烷化盖玻片上，再将另一片盖玻片覆盖其上。使用玻璃盖玻片作为间隔物可实现盖玻片之间的分离。</li>
	<li>将盖玻片在PEG溶液中孵育3小时，随后分开每对盖玻片，并用大量水充分洗涤。操作时需小心保持盖玻片的功能化面朝上，因为仅有一侧被PEG包被。</li>
	<li>用空气干燥盖玻片，并在干燥器中真空保存。表面功能化效果至少可稳定保存一个月，因此可一次性制备数十片盖玻片，按需使用。</li>
</ol>
4. 流动腔室的制备
实验使用一个简单的流动池进行，该流动池由经功能化的盖玻片、双面胶带、石英载片和管路构成。每次单分子实验均需准备一个独立的流动池2,4。
材料：双面胶带、剃刀刀片、带管孔的石英载玻片、快干环氧树脂、功能化盖玻片、链霉亲和素溶液（25 μL，1 mg/mL，溶于PBS中）、管路、封闭缓冲液（5X：20 mM Tris pH 7.5，2 mM EDTA，50 mM NaCl，0.2 mg/mL BSA，0.005% Tween-20）、工作缓冲液（1X：20 mM Tris-HCl pH 7.5，2 mM EDTA，50 mM NaCl）。
<ol>
	<li>首先将 5 mL 封闭缓冲液和 20 mL 工作缓冲液混合，并置于真空干燥器中，以去除后续步骤中可能存在的气泡。</li>
	<li>取一片 PEG 功能化的盖玻片，将 125 µL 用 PBS 稀释的链霉亲和素溶液均匀涂布于表面。在室温下孵育 20 分钟，同时准备流动池的其他部分，使链霉亲和素与表面的生物素结合。</li>
	<li>裁剪一段双面胶带，使其尺寸与石英载玻片匹配。在胶带上标记出管路孔的位置，以便在胶带上画出流动室的轮廓。</li>
	<li>在胶带上制作一个 3 mm 宽的中央通道，并包含两个孔的矩形区域。我们使用的流动室具有两个入口和两个出口的 Y 形通道。</li>
	<li>沿所画轮廓进行切割，确保切口平直、整齐，避免胶粘剂突入通道内。</li>
	<li>使用丙酮或乙醇彻底清洗石英载玻片，以去除先前构建流动池时残留的胶粘剂。</li>
	<li>找到通道轮廓的最佳对齐位置，撕去胶带一侧的背衬，小心地将胶带贴到石英载玻片上。注意对齐位置，确保入口和出口孔不被堵塞。</li>
	<li>为流动池的入口和出口裁剪适当长度的管路。将管路末端以约 30° 角斜切，有助于防止管路末端紧贴流动室底部。将管路放置在适当支撑物（如管架）上，以便在后续步骤中方便连接至流动池。</li>
	<li>用去离子水彻底冲洗已包被链霉亲和素的盖玻片，并用压缩空气吹干。注意仅一侧具有功能化修饰。撕去胶带另一侧的背衬，将石英载玻片贴合到盖玻片上。</li>
	<li>轻轻按压盖玻片，以排出胶粘剂中可能夹带的空气。这有助于避免气泡进入流动通道。</li>
	<li>用环氧树脂密封流动室的四周。将已裁剪的管路插入石英片的孔中，并用环氧树脂固定。此步骤需静置数分钟使其干燥。</li>
	<li>待环氧树脂干燥后，开始通过其中一根管路抽吸已脱气的封闭缓冲液，以封闭表面。21 号针头可完美插入 0.76 mm 的管路中。反复冲洗数次以去除气泡，并让流动室至少孵育半小时。</li>
</ol>
5. 单分子复制实验
一旦DNA模板和功能化微珠制备完成，并且流动池已准备就绪，便可进行单分子实验。
材料：制备好的流动腔室、封闭缓冲液（5X：20 mM Tris-HCl pH 7.5、2 mM EDTA、50 mM NaCl、1 mg/mL BSA、0.025% Tween-20）、工作缓冲液（1X：20 mM Tris-HCl pH 7.5、2 mM EDTA、50 mM NaCl）、含或不含10 mM MgCl2的T7复制缓冲液（1X：40 mM Tris-HCl pH 7.5、50 mM K-谷氨酸盐、2 mM EDTA、100 μg/mL BSA、10 mM DTT、600 μM dNTPs）、复制蛋白、配备10X物镜的倒置光学显微镜、CCD相机、永久性稀土磁铁、注射泵、空气弹簧、光纤照明器、装有图像采集软件的计算机。
<ol>
	<li>封闭流通池后，即可开始实验。</li>
	<li>取流通池并将其放置在显微镜载物台上。用载物台夹固定腔室，并确保流道与CCD相机对齐。</li>
	<li>使用较大直径的连接管或针头将流通池的出口管连接至气弹簧。气弹簧用于稳定任何流动不规则性。取一个50 ml塑料管，加入45 ml水，管盖用环氧树脂密封。在盖子上打三个孔，并插入三段管路。使用环氧树脂将管路与盖子密封，防止空气进入或逸出。将气弹簧连接至注射泵以及流通池的出口管。</li>
	<li>将流通池的入口管浸入封闭缓冲液中，并回拉注射器以去除管路中的空气。轻轻弹击出口管有助于清除流通池中滞留的气泡。</li>
	<li>待所有气泡清除后，用针头封闭其中一个入口管，再将其中一个出口管弯折180°并用胶带固定以封闭该管。</li>
	<li>将DNA模板储备液用脱气封闭缓冲液稀释至10 pM（总体积1 ml），以中等流速注入腔室，以实现良好的DNA表面覆盖率（建议流速为0.01–0.05 ml/min，持续20分钟）。可根据每批盖玻片表面的DNA分子数量或实验所需密度适当调整该参数。</li>
	<li>将磁珠储备液用脱气封闭缓冲液稀释至2–4×106 个珠/ml（总体积1 ml），以0.01–0.05 ml/min的流速注入腔室，持续15分钟。</li>
	<li>加入磁珠后，停止流动并让腔室达到平衡状态，随后关闭两个出口管。若在腔室未封闭时对管路进行操作，会引起压力波动，从而对磁珠施加较大作用力，导致连接的DNA分子被剪切。</li>
	<li>用针头封闭用于加载磁珠的入口管，然后通过第二个入口管用脱气的1×封闭缓冲液（溶于工作缓冲液）充分洗涤流通池，洗涤流速为0.01–0.05 ml/min。可通过轻敲载物台手动震荡，以去除非特异性吸附在表面的磁珠（<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1689/Tapping.avi">轻敲</a>）。</li>
	<li>当游离磁珠被充分去除后，停止流动并让腔室达到平衡。关闭未封闭的出口管，将入口储液瓶切换为蛋白溶液，并缓慢打开出口管，以避免压力骤变。</li>
	<li>可通过改变流动方向来检查磁珠是否与DNA连接（<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1689/DNA.avi">DNA</a>）。</li>
	<li>现在可进行酶促反应。对于前导链合成实验，将gp4解旋酶配制成20 nM溶液，并将gp5聚合酶（以与进程性因子硫氧还蛋白形成的复合物形式纯化）配制成20 nM溶液，均溶于不含MgCl2的脱气T7复制缓冲液中。</li>
	<li>以中等流速将蛋白溶液注入腔室，以促进其与DNA高效结合。我们通常采用0.037 ml/min流速持续8分钟，随后以0.012 ml/min流速持续7分钟。</li>
	<li>用不含MgCl2的脱气T7复制缓冲液洗涤腔室，以去除未结合的游离蛋白。建议使用0.037 ml/min流速洗涤3–10分钟。</li>
	<li>洗涤完成后，注入含MgCl2的T7复制缓冲液，并开始数据采集。使用0.012 ml/min的流速，该条件下DNA连接链所受拖拽力约为3 pN。</li>
	<li>成像前，在流通池上方放置一块稀土永磁体，以防止磁珠与表面之间的非特异性相互作用。</li>
	<li>使用10X物镜和CCD相机观察视野，并利用一个连接的磁珠进行调焦。</li>
	<li>将光纤照明器置于靠近显微镜的位置，入射角在10度至与显微镜载物台平行之间。采用暗场照明以提高磁珠成像的对比度。</li>
	<li>以较低帧率（通常为2–4 Hz）持续采集20至30分钟的数据。</li>
</ol>
6. 代表性结果
在一个成功的实验中，你应该能够同时观察到超过100个微珠（<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1689/Leading_strand_synthesis.avi">前导链合成</a>）。该实验应产生大量显示前导链DNA合成的轨迹数据。
数据分析：
为了测量DNA解旋和聚合的速率及持续性，必须精确确定微珠的位置。可通过将这些位置拟合为二维高斯函数来实现。随后，可使用追踪软件（例如DiaTrack）逐帧追踪微珠位置，从而提取轨迹。接下来，可利用任意绘图软件（例如Origin）将微珠位置随时间的变化绘制成图，以实现轨迹的可视化。为获得速率数据，需对曲线进行线性回归拟合并计算斜率。对于持续性，则需测定一次缩短事件从起始到结束时DNA的总长度（图3）。这两个数值均需转换为碱基对。将微珠移动距离转换为碱基对时，首先需要测量在反应流速下拉伸的λ DNA分子的长度。由于λ DNA的长度已知（48,502 bp），因此可在实验施加的力条件下校准每个像素所对应的碱基对数目。为提高准确性，应从目标轨迹中减去未发生酶促变化的微珠连接链的基线轨迹。汇总所有单次测量结果，并绘制速率和持续性的分布图。分别使用高斯函数和单指数函数对数据进行拟合（图3）。
<img src="/files/ftp_upload/1689/1689fig1.jpg" alt="DNA拉伸实验；微珠-DNA装置；力-伸长曲线；显微镜物镜；分子分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 单分子实验装置。（a）双链λ DNA（48.5 kb）通过其中一条链的5'端利用生物素-链霉亲和素相互作用固定在流动池表面，同一条链的3'端则通过地高辛-抗地高辛相互作用连接至微珠。在远离微珠的一端形成一个已引发的复制叉，以便聚合酶的加载。（b）利用缓冲液的层流拉伸微珠-DNA组装体，并通过宽场光学显微镜成像。通过在保持恒定拉伸力的同时追踪微珠位置随时间的变化，可监测DNA结构的长度。（c）单链DNA（实心圆）和双链DNA（空心圆）在低拉力条件下的伸长曲线。虚线表示完全双链λ DNA的晶体学长度，为16.3 μm。在约3 pN的拉力下，单链DNA与双链DNA之间显著的长度差异使得通过监测DNA长度变化直接观察单双链之间的转换成为可能。同时可视化大量与DNA连接的微珠，可在一次实验中研究多个独立的复制体。
<img src="/files/ftp_upload/1689/1689fig2.jpg" alt="显示噬菌体DNA和聚合酶复合物的DNA复制示意图，指示磁珠的相对位置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 噬菌体T7复制蛋白：DNA聚合酶（gp5与硫氧还蛋白的复合物）和DNA解旋酶（gp4）在脱氧核糖核苷酸和镁离子存在下合成前导链DNA。该过程伴随滞后链DNA因缠绕而缩短。双链DNA转化为单链DNA导致磁珠位置发生变化。通过测量磁珠的位置，可精确定量DNA复制的速率和持续性。
<img src="/files/ftp_upload/1689/1689fig3.jpg" alt="DNA复制持续性与时间关系图及速率直方图；动力学分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 单分子前导链合成实验中典型数据示例。DNA复制的持续性等于一次缩短事件从起始到结束所产生的DNA总长度。DNA复制速率通过线性回归拟合曲线并计算斜率获得。插图显示了通过整合多次测量数据得到的速率和持续性分布。数据分别采用高斯函数和单指数函数进行拟合。

<ol><li>Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+primase+acts+as+a+molecular+brake+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication.</a> Nature. 439, 621-624 (2006).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+Grafted+to+Silicon+Surfaces%3A+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+of+lambda+exonuclease+reveal+base+dependence+and+dynamic+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
</ol>

必须确保层流对珠子施加的拖拽力不会影响复制蛋白的酶活性。例如，对应于0.012 ml/min流速的3 pN力不会影响DNA前导链的复制。然而，该力会影响协调DNA合成过程中发生的酶活性，因此必须将其降低至1.5 pN。通过调节流速或流动通道的宽度即可轻松控制拖拽力5。
DNA拉伸实验利用双链DNA与单链DNA之间的长度差异。在本实验中，双链DNA向单链DNA的转化是由于前导链的合成所致（图2）。需要注意的是，只有在低于6 pN的低拉伸力条件下，单链DNA才比双链DNA更短（图1）。
该方法的一种可能改进是通过在复制模板的滞后链3'端连接第二个微珠来对其进行修饰。这种改变将能够直接观察发生在DNA两条链上的酶活性。
除了用于研究前导链合成和协调复制外，DNA拉伸实验还已成功用于检测λ外切核酸酶的单分子动力学，以及复制过程中聚合酶交换的动力学5,6。原则上，该方法可用于研究任何DNA加工酶。

<table><tbody><tr><td>噬菌体 &amp;#955; DNA</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>N3011L</td><td></td></tr><tr><td>DNA 寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-地高辛 Fab 抗体片段</td><td>罗氏集团</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>甲苯磺酰活化磁珠</td><td>英杰生命技术公司</td><td>142-03</td><td></td></tr><tr><td>磁力分离器</td><td>英杰生命技术公司</td><td>Dynal MPC</td><td></td></tr><tr><td>3-氨基丙基三乙氧基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td>可使用其他氨基硅烷，或与非氨基反应性硅烷混合以获得更稀疏的表面</td></tr><tr><td>琥珀酰亚胺基丙酸酯 PEG</td><td>Nektar</td><td></td><td>类似 PEG 产品可从 Nanocs、CreativePEGWorks 等公司购买</td></tr><tr><td>生物素-PEG-NHS</td><td>Nektar</td><td></td><td>类似 PEG 产品可从 Nanocs、CreativePEGWorks 等公司购买</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Grace Bio-Lab 公司</td><td>SA-S-1L</td><td>厚度为 100 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>石英载玻片</td><td>Technical Glass</td><td>20 mm (宽) × 50 mm (长) × 1 mm (高)</td><td>尺寸需适配盖玻片。使用金刚石钻头（DiamondBurs.net）钻孔</td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>BD 生物科学公司</td><td>427416</td><td>内径 0.76 mm，外径 1.22 mm&lt;br/&gt;可使用其他尺寸的管路替代</td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td>配制成 1 mg/mL 溶液，以 PBS（pH 7.3）分装为 25 &amp;#x03BC;L 每份</td></tr><tr><td>脱氧核糖核苷三磷酸混合溶液</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>配备 10X 物镜的倒置光学显微镜</td><td>奥林巴斯公司</td><td>Olympus IX-51</td><td></td></tr><tr><td>永久性稀土磁铁</td><td>国家进口公司</td><td>www.rare-earth-magnets.com</td><td></td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>QImaging</td><td>Rolera-XR Fast 139</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>哈佛仪器公司</td><td>11 Plus</td><td>以灌注模式运行，便于更换溶液</td></tr><tr><td>光纤照明器</td><td>Thorlabs 公司</td><td>OSL1</td><td></td></tr></tbody></table>

利用单分子dna拉伸实验直接观察酶复制dna

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

我们描述了一种通过噬菌体复制系统蛋白介导，实时观察单个DNA分子复制过程的方法。将线性化的λ DNA进行修饰，使其一条链的一端带有生物素，同一链的另一端连接地高辛分子。生物素化的一端与经功能化的玻璃盖玻片结合，地高辛化的一端则连接微小小球。将这些DNA-小球连接物组装在流动池表面，可施加层流以对小球产生拖拽力。由此产生的力使DNA几乎平行于盖玻片表面并被拉伸，其受力大小由流速决定（图1）。通过监测小球的位置来测量DNA的长度。利用单链与双链DNA之间的长度差异，可实时获取复制叉处复制蛋白活性的信息。通过测定小球位置的变化，可精确确定DNA解旋和聚合的速率及持续性（图2）。

我们描述了一种通过噬菌体复制系统蛋白介导，对单个DNA分子进行实时复制观察的方法。

利用单分子DNA拉伸实验直接观察酶复制DNA

我们描述了一种用于观察噬菌体复制系统蛋白介导的单个DNA分子实时复制的方法。

本视频演示了一种通过宽场光学显微镜观察线性化且化学修饰的λ-DNA复制过程的实验方案。将DNA固定在功能化的玻璃盖玻片上，DNA的游离末端用微珠标记，并通过层流拉伸DNA分子。当复制启动时，由于螺旋作用，前导链开始延长而滞后链则缩短。在低作用力下，双链DNA与单链DNA之间存在显著的长度差异，这使得DNA复制过程中的构型变化可被直接观察。通过追踪微珠的位置来监测DNA结构的长度，从而能够精确测定DNA复制的速率和过程。您好，我是来自哈佛医学院生物化学与分子药理学系的 Ari Ulrich，我们的实验室由 Anto one Vanian 和 Charles Richardson 教授领导。今天，我们将向您展示一种在单分子水平上对 DNA 复制进行成像的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究 DNA 合成过程中发生的酶学活性。那么，让我们开始吧。在此实验的起始阶段，将线性化的细菌噬菌体λDNA通过一段弯曲的寡核苷酸进行修饰，以形成一个复制叉，包括λ互补叉臂、生物素标记的叉臂以及叉状引物。该生物素标记的叉臂在其5'端连接有一个生物素分子，从而可将DNA模板固定于流动池的表面。通过退火进一步修饰λ DNA，即加入另一种含有地高辛（diggen）基团的寡核苷酸，该基团可作为高亲和力免疫标签，用于连接微珠。为构建复制叉，除λ DNA外，还需准备若干寡核苷酸，其序列可在本视频附带的书面实验方案中找到。这些寡核苷酸包括一条生物素化的复制叉臂、一条λ互补复制叉臂、一条复制叉引物以及一条λ互补的地高辛末端寡核苷酸；使用T4多核苷酸激酶对λ互补复制叉臂和λ互补地高辛末端寡核苷酸的5'端进行磷酸化处理。接下来，将磷酸化的λ互补叉臂、生物素标记的叉臂、叉形引物和λ DNA 按照10:10:100:1的摩尔比混合。在T4 DNA连接酶缓冲液中，将混合物于65摄氏度加热5分钟，随后关闭加热模块，使其缓慢冷却至室温，以促进寡核苷酸与T4 DNA连接酶在混合物中的正确退火，并在室温下孵育2小时。在此条件下，T4 DNA连接酶将催化寡核苷酸与λ DNA之间切口的连接。通过在T4连接酶缓冲液中加入磷酸化的λ互补地高辛末端，与DNA复制模板末端连接，将混合物在45摄氏度孵育30分钟，随后通过关闭加热模块使其缓慢冷却至室温。再向混合物中加入T4 DNA连接酶，将磷酸化的λ互补地高辛末端连接至DNA复制模板，于室温孵育两小时。最终的DNA复制模板现已制备完成，可供使用。为了将磁珠活化的tassel与DNA复制模板连接，必须使用针对地高辛的特异性FAB片段对磁珠进行功能化修饰。开始此操作时，重悬磁珠的储存液，并将 400 微升转移至一个离心管中。将试管放入磁力架中，孵育至溶液澄清。然后用移液器吸除上清液。为活化磁珠表面的羧基以进行抗体偶联，加入 1 毫升活化缓冲液，并用移液器轻轻混匀。再次使用磁力分离器去除上清液。接着，加入 240 微升 FAB 片段，并将磁珠重悬于 400 微升硼酸盐缓冲液中。充分混匀后，在 37 摄氏度下于旋转仪中孵育 16 至 24 小时。孵育后，使用磁力分离器分离磁珠并移除上清液。用一毫升洗涤缓冲液洗涤磁珠，并在四摄氏度下孵育五分钟，然后使用磁力分离器移除缓冲液。此洗涤步骤重复两次。为了封闭游离的甲苯磺酰基团，加入一毫升含有 Tris 缓冲液的 BSA，并在 37 摄氏度下孵育四小时。孵育结束后，使用磁力分离器从磁珠中移除缓冲液，用缓冲液洗涤两次并分装。使用时，将待复制的 DNA 连接到经氨基硅烷功能化的玻璃盖玻片上。Amil 试剂中的氧基团与玻璃结合，留下一个氨基可用于与生物素化的 PEG 分子结合。这种涂层有助于减少非特异性结合。为彻底清洁玻璃盖玻片，将其放入染色缸中，并用乙醇充满染色缸，进行超声处理。用一摩尔浓度的氢氧化钾超声处理液冲洗烧杯30分钟，然后重复清洗两次，每次30分钟。第一次功能化反应前必须彻底去除所有残留水分。用丙酮充满染色缸，并超声处理10分钟。倒空玻璃罐，并重新加入丙酮。随后向玻璃罐中加入西纳试剂，振荡两分钟。然后用大量过量的水淬灭反应。然后将盖玻片置于烘箱中，在110摄氏度下烘烤30分钟以干燥。接着配制浓度约为0.2%（重量/体积）的PEG混合液。使用生物素化PEG并加入玻璃盖玻片间隔物，可使盖玻片相互分离，将100微升该溶液滴加到干燥的硅化盖玻片上。在上方放置第二块盖玻片。将盖玻片在PEG溶液中孵育3小时。然后将每对盖玻片分开，并用大量水充分洗涤。注意保持盖玻片的功能化面朝上，因为只有一侧涂有聚乙二醇（peg）。最后用压缩空气吹干盖玻片，并在真空干燥器中保存，表面至少一个月内保持稳定。因此可一次性制备数十个盖玻片，按需使用。现在盖玻片已准备就绪，可以组装单分子实验用的流动池。单分子实验采用由功能化盖玻片、双面胶带、石英载玻片和管路构成的简易流动池进行。每次单分子实验均需制备一个流动池。首先将 5 毫升封闭缓冲液与 20 毫升工作缓冲液混合，并将混合液置于真空干燥器中以去除后续步骤中可能产生的气泡。接着，将 100 微升用 PBS 配制的 strp din 工作溶液均匀涂布于 peg 修饰的盖玻片表面，在室温下孵育 20 分钟，使 strp din 与表面的生物素结合。在此期间，裁剪一段双面胶带以匹配石英载片的尺寸，并在胶带上标记出管路孔的位置。用笔画出宽3毫米的中心通道以及包含两个孔的矩形，以标示流室的轮廓。流室的设计可采用两个Y形入口通道和两个Y形出口通道。现在沿所画轮廓裁剪标记好的胶带，裁切时需保持切口平直整齐，确保没有胶粘剂突入通道内。使用丙酮彻底清洁石英载玻片，以去除先前实验中流动池构建所用的粘合剂。找到通道轮廓的最佳对齐位置。移除粘合剂背衬的一侧，然后小心地将胶带贴到载玻片上。请注意正确对齐胶带，确保入口和出口孔保持畅通。接下来，准备内径为 0.76 毫米的管路，将其剪成适当长度，用于流路池的入口和出口。将管路末端以约 30 度角斜切，以防止管路末端紧贴腔室底部而被压平。将管路悬挂在试管架上，以便在后续步骤中方便地连接到流动池。此时，盖玻片的孵育应已结束。用清水彻底冲洗盖玻片，并用压缩空气吹干。注意不要将盖玻片翻转，因为只有一侧用 PEG 进行了功能化处理。通过移除胶带背衬的另一侧，并将石英载片放置在盖玻片上，完成流动池的组装。轻轻按压盖玻片，以排出粘合剂中可能夹带的空气，这有助于防止气泡进入流动通道。用环氧树脂密封腔室的侧面。将截断的管子插入石英管的孔中，并用环氧树脂固定。静置几分钟使其干燥。干燥后，使用21号针头将部分DGAs封闭缓冲液从其中一根管子中抽出，以封闭反应室表面。反复冲洗数次以去除气泡，并让反应室孵育至少30分钟，然后进行单分子复制实验。在DNA模板功能化磁珠和流动反应室制备完成后，即可开展单分子实验。首先，将流动池放置在显微镜载物台上。使用载物台夹固定流动池，并确保流动通道与CCD相机对齐。将先前构建的空气弹簧连接至注射泵以及流动池的出口管路。使用较大直径的连接管，将流动池的进样管插入封闭缓冲液中，并回拉注射器以去除管路中的任何气泡，轻轻弹动出样管以清除流动池中滞留的气泡。待所有气泡完全排除后，用针头堵住其中一根进样管，并将其中一根出样管弯折180度后用胶带密封固定。在向流动池中加入DNA之前，将储备DNA模板用1毫升DGA one x封闭缓冲液稀释至10皮摩尔。以适中的流速将模板溶液注入反应室，以确保DNA在表面充分覆盖。将储存的珠子溶液稀释至每毫升含有2×10⁶到4×10⁶个珠子。在1毫升DGA中加入一倍体积的封闭缓冲液。然后涡旋混合物并超声处理20秒。将稀释后的珠子溶液注入腔室。加入珠子后，关闭流体流动，使腔室达到平衡状态，然后关闭两个出口管。在未关闭腔室的情况下对管道进行任何改动，都会引起压力波动，从而对磁珠施加较大的作用力，并剪切固定在磁珠上的DNA分子。使用第二个入口管和针头堵住用于加载磁珠的入口管。开始用一倍浓度的封闭缓冲液对流动池进行DGA洗涤，并充分冲洗。通过轻敲来搅动载物台，以去除非特异性吸附在表面上的磁珠，并进行检查。磁珠通过DNA连接固定。尝试改变流动方向。在充分去除游离微珠后，关闭流体并让反应室达到平衡状态。根据文本方案中的说明，配制含有复制蛋白的新鲜反应混合液。关闭开放的出口管，并将入口储液槽切换至新配制的反应混合液。缓慢打开出口，避免压力快速变化，以继续进行酶促反应。首先，以适中的流速将蛋白质溶液流入反应室，以实现与DNA的高效结合。关闭流体流动，使反应室达到平衡状态。关闭出口管路，更换含有反应混合物的管路。使用含有 DGAs 的洗涤缓冲液管路，洗涤腔室以去除游离蛋白质。再次关闭流体流动，使腔室达到平衡状态。关闭出口管并更换含有洗涤缓冲液的管。将含有T7复制缓冲液的管放回，T7复制缓冲液中含有可启动复制反应的氯化镁。使用0.012毫升/分钟的流速，该流速在此方案所述条件下相当于对DNA锚定链施加3皮牛的拖拽力。成像前，将稀土永磁体置于流动池上方，以防止微珠与表面之间发生非特异性相互作用。将光纤照明器放置在靠近显微镜视场的位置，入射角在10度至与显微镜载物台平行之间，使用10倍物镜和CCD相机进行观察。采用暗场照明，通过连接的微珠提高微珠成像焦点的对比度。以较慢的帧率开始数据采集，持续 20 至 30 分钟。在成功的实验中，可同时观察到 100 个微珠。实验应产生大量显示前导链 DNA 合成的轨迹。为了测量DNA解旋和聚合的速率及过程性，必须精确定位磁珠的位置。使用二维高斯函数对这些位置进行拟合。通过跟踪软件追踪每帧图像中磁珠的位置，从而可视化其运动轨迹。然后使用任意图形软件将珠子位置对时间作图，以获得速率数据。对曲线进行线性回归拟合，并计算持续运动过程的斜率。确定在一次缩短事件中从起始到结束的DNA总长度。将所有单次测量结果合并，并分别使用高斯函数和单指数函数对速率和产物分布进行拟合。我们刚刚向您展示了如何在单分子水平上测量DNA复制的速率和持续性。在进行该实验时，重要的是确保层流产生的力和剪切力不会影响复制蛋白的酶活性。就这样了。感谢观看，祝你的实验顺利愉快。

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生物学

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