使用单分子DNA拉伸含量直接观察DNA复制的酶

本视频演示了一种通过宽场光学显微镜线性化和化学修饰 lambda 可视化 DNA 复制的方案。DNA 附着在功能化的玻璃盖玻片上。DNA 的自由端被磁珠标记，DNA 被层流拉伸。

当复制开始时，前导链开始变长，而滞后链由于卷曲而缩短。在低作用力下，双链 DNA 和单链 DNA 之间的长度差异很大，因此可以直接观察复制过程中的 DNA 转化。通过追踪磁珠的位置来监测 DNA 构建体的长度，从而可以精确确定 DNA 复制的速率和过程。

大家好，我是哈佛医学院生物化学和分子药理学系 Anto one Vanian 和 Charles Richardson 实验室的 Ari Ulrich。今天，我们将向您展示一种在单分子水平上对 DNA 复制进行成像的程序。我们在实验室中使用该程序来研究 DNA 合成过程中发生的酶活性。

那么让我们开始 在此过程开始时。线性化细菌噬菌体 Lambda DNA 被跪姿寡核苷酸修饰，形成复制叉、lambda 互补叉臂、生物素化叉臂和叉引物。生物素化的叉式前臂包含附着在其 5 个主要末端的生物素 t，这允许将 DNA 模板栓系到流动池表面。

lambda DNA 通过退火进一步修饰，退火是另一种寡核苷酸，其中包含一个 diggen 和部分，用作连接珠子的高亲和力免疫标签。要生成复制叉，除了几种寡核苷酸外，还应获得 lambda DNA，其序列可在本视频随附的书面方案中找到。这些寡核苷酸包括生物素化叉臂、λ 互补叉臂、叉引物和 λ 互补 diggen 并使用 T 4 多核苷酸激酶磷酸化 lambda 互补叉臂和 λ 互补 digo genin 末端的五个主要末端。

接下来，以 10 比 10 到 100 比 1 的摩尔比混合磷酸化 lambda 互补叉臂、生物素化叉臂、叉引物和 lambda DNA。在 T four DNA 连接酶缓冲液中，将混合物在 65 摄氏度下加热 5 分钟，然后关闭加热块缓慢冷却至室温，使寡核苷酸和 T 4 DNA 连接酶与混合物正确退火，然后孵育 2 小时。在室温下，T 4 DNA 连接酶将催化寡核苷酸和 lambda 之间的切口密封。

DNA 最后，通过添加磷酸化 lambda 互补 diggen 和 T 4 连接酶缓冲液，将 lambda 互补 diggen 和 DNA 复制模板结束，在 45 摄氏度下孵育混合物 30 分钟，然后再次关闭加热块缓慢冷却至室温，连接磷酸化 Lambda 互补 dig 氧，并通过向混合物中加入 T 4 DNA 连接酶结束 DNA 复制模板，然后在室温下孵育 2 小时。最终的 DNA 复制模板现在可以使用了。为了将流苏激活的磁珠连接到 DNA 复制模板上，它们必须用 digo genin 特异性的 FAB 片段进行功能化。

要开始此过程，请重悬珠子储备液并将 400 μL 转移到 einor 管中。将试管放入磁性分离器中孵育，直到溶液澄清。然后通过移液去除上清液为了激活抗体偶联的 toal 基团，加入 1 毫升 boid 缓冲液并通过移液轻轻混合。

同样，在磁力分离器的帮助下去除上清液。接下来，加入 240 μL FAB 片段，并将微珠重悬于 400 μL 硼酸盐缓冲液中。充分混合，并在 37 摄氏度下在旋转器上孵育 16 至 24 小时。

孵育后，使用磁分离器分离珠子并去除上清液。用 1 毫升洗涤缓冲液洗涤珠子，并在 4 摄氏度下孵育 5 分钟，使用磁力分离器去除缓冲液。这种洗涤重复两次。

为了封闭游离的 tosil 基团，加入 1 毫升含有 tris 缓冲液的 BSA，并在 37 摄氏度下孵育 4 小时。孵育后，使用磁力分离器从磁珠中取出缓冲液，用缓冲液洗涤两次，然后分装。使用时，将要复制的 DNA 连接到用 Amil 泳道功能化的玻璃盖玻片上。

Amil 泳道的氧基团与玻璃结合，留下可与生物素化 peg 分子结合的 amin。这种涂层有助于减少与表面的非特异性结合。要彻底清洁玻璃盖玻片，请将它们放入染色罐中，并在罐中加入乙醇超声处理液。

冲洗罐子 30 分钟，用 1 摩尔氢氧化钾超声处理液填充 30 分钟，然后重复两次洗涤。对于第一个官能团化反应，需要去除所有痕量的水。用丙酮填充染色瓶并超声处理 10 分钟。

清空罐子并再次装满丙酮。继续将正弦试剂加入染色缸中并搅拌 2 分钟。然后用大量过量的水淬火。

然后在烤箱中以 110 摄氏度烘烤 30 分钟来干燥盖玻片。接下来，以每体积约 0.2% 重量准备钉子混合物。生物素化的钉子，包括玻璃盖玻片垫片，将允许分离盖玻片，将 100 微升移液到干燥的孤立盖玻片上。

将第二个盖玻片放在顶部。将盖玻片在 PEG 溶液中孵育 3 小时。然后将每对盖玻片分开，并用水充分清洗。

小心保持盖玻片功能面朝上，因为只有一侧会涂有钉子。最后，用压缩空气干燥盖玻片并将其存放在真空干燥物中，表面保持稳定至少一个月。因此，可以批量制作数十个盖玻片并根据需要使用。

现在盖玻片已经准备好了，可以组装用于单分子实验的流动室。单分子实验使用简单的流通室进行，该流动室由功能化盖玻片、双面胶带、夸脱载玻片和管道构成。为每个单分子实验准备一个流动室。

首先混合 5 毫升封闭缓冲液和 20 毫升工作缓冲液，然后将混合物放入干燥液中，以去除任何气泡，以便进行后续步骤。接下来，将 100 微升 strp din 在 PBS 中的工作溶液涂抹在钉子功能化的盖玻片表面，在室温下孵育 20 分钟，以使 strp din 结合表面生物素。同时，剪下一块与石英幻灯片尺寸相匹配的双面胶带，在胶带上标记油管孔的位置。

通过绘制一个 3 毫米宽的中心通道和包含两个孔的矩形来勾勒出流动室的轮廓。流通室可以设计有两个入口和两个出口 y 形通道。现在沿着绘制的轮廓剪下标记的胶带，进行笔直干净的切割，以确保没有粘合剂伸入通道。

使用丙酮彻底清洁石英载玻片，以去除先前实验中使用的流通池结构中的粘合剂。找到通道轮廓的最佳对齐方式。撕下背胶的一侧，小心地将胶带放在球场滑轨上。

小心地正确对齐胶带，因为入口和出口孔需要保持畅通。接下来，为流通池的入口和出口准备 0.76 mm 内径管的管路切割长度。以大约 30 度角切割管子的末端，这样管子就不会平压在腔室底部。

管路悬挂在试管架上，以便在后续步骤中轻松连接到流通池。到现在为止，盖玻片孵育应该已经完成。冲洗盖子，用水彻底滑入，然后用压缩空气吹干。

小心不要将盖玻片翻转过来，因为只有一侧用钉子功能化。通过去除胶带背衬的另一侧并将石英载玻片放在盖玻片上来完成流通室的组装轻轻按压盖玻片以推出粘合剂中滞留的任何空气。这将有助于防止任何气泡进入流道。

用环氧树脂密封腔室的侧面。将切割好的管插入石英的孔中，并用环氧树脂密封到位。晾干几分钟。

干燥后，使用 21 号针头将一些 DGA 封闭缓冲液拉过其中一根管，以堵塞腔室表面。冲洗几次以去除气泡，并让腔室孵育至少 30 分钟，然后再进行单分子复制实验。一旦 DNA 模板功能化的磁珠和流动室准备好，就可以进行单分子实验。

首先，将流通池放在显微镜载物台上。用载物台夹将腔室固定到位，并确保流道的位置与 CCD 相机对齐。连接到注射泵和流通池的出口管的先前构建的空气弹簧。

使用更大直径的连接器管，将流通池的入口管放入封闭缓冲液中，然后拉回注射器以去除管中的任何气泡，轻轻轻弹出口管以清除残留在流通池中的任何气泡。去除所有气泡后，用针头塞住其中一根入口管，并将其弯曲 180 度并用胶带固定以密封其中一根出口管。在将 DNA 添加到细胞中之前，将储备 DNA 模板稀释至 10 皮摩尔，溶于 1 毫升 DGA 1 x 封闭缓冲液中。以中等流速将模板流入腔室，以使 DNA 具有良好的表面覆盖率。

将储备珠子溶液稀释至每毫升 10 个 6 个珠子的 2 到 4 倍。在 1 mL DGA 中，1 x 封闭缓冲液。然后涡旋混合物并超声处理 20 秒。

将稀释的微珠溶液流入腔室。添加磁珠后，关闭液流并让腔室达到平衡。然后关闭两个出口管。

在腔室未关闭的情况下对试管进行任何更改都会引起压力波动，从而对磁珠施加强大的力并剪切栓系的 DNA 分子。使用第二根进样管用针头塞住用于加载珠子的进样管。开始用 DGA 一 x 封闭缓冲液溶液广泛洗涤流通池。

通过敲击来搅动载物台，以去除任何非特异性粘附在表面上的珠子以检查它。珠子与 DNA 相连。尝试改变流向。

充分去除游离微珠后，关闭液流并让腔室达到平衡。如文本方案所示，制备含有复制蛋白的新鲜反应混合物。关闭打开的出口管，将入口储液槽切换到新鲜制备的反应混合物。

缓慢打开出口以避免压力快速变化以进行酶促反应。首先，以中等流速将蛋白质溶液流入腔室，以便与 DNA 有效结合。关闭液流，让腔室达到平衡。

关闭出口管并更换含有反应混合物的管子。使用由 DGA 洗涤缓冲液组成的试管，洗涤后洗涤腔室以去除游离蛋白质。再次关闭液流，让腔室达到平衡。

关闭出口管并更换含有洗涤缓冲液的管子。对于含有 T 7 复制缓冲液的试管，T 7 复制缓冲液含有氯化镁，可触发复制反应的开始。使用每分钟 0.012 毫升的流速，相当于使用本协议中描述的条件对 DNA 系绳施加 3 皮秒 Newin 阻力。

成像前，将稀土永磁体放在流通池上方，以防止磁珠与表面之间的非特异性相互作用。将光纤照明器放置在 10 度之间的入射角处，并平行于显微镜视场附近的显微镜载物台，配备 10 倍物镜和 CCD 相机。暗场照明用于使用系留微珠增加微珠成像焦点的对比度。

以较慢的帧速率开始数据采集 20 到 30 分钟。在一次成功的实验中，可以同时观察到 100 个珠子。实验应产生大量显示前导链 DNA 合成的痕迹。

为了测量 DNA 解旋和聚合的速率和过程，必须确定磁珠的精确位置才能实现这一目标。用二维高斯函数拟合这些位置。通过使用跟踪软件跟踪每帧中的拉延筋位置来可视化轨迹。

然后使用任何图形软件绘制胶条位置随时间的变化，以获得速率数据。用线性回归拟合图，并计算 progressive 的斜率。确定 DNA 从缩短事件开始到结束的总长度。

合并所有单个测量值，并分别使用高斯和单个指数函数绘制速率和生产率分布拟合数据。我们刚刚向您展示了如何在单个分子水平上测量 DNA 复制的速率和过程。在执行此程序时，重要的是要确保层流的力和一定的赌注不会影响复制蛋白的酶活性。

就是这样。感谢您的观看并享受您的实验。