Name: 毒素诱导和蛋白质提取镰刀 SPP。文化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-16T15:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 了解镰刀菌毒素诱导与蛋白质提取的标准化流程，用于蛋白质组学研究。该方法遵循MIAPE指南，通过SDS和TCA提取高质量蛋白，减少实验偏差，提高结果可重复性。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢Servane Contal和Boris Untereiner提供的技术协助。本研究得到FNR“FUTOX”项目的支持。

完成该方案需要16天。时间安排详见图1。
缓冲液配制的详细步骤
<ul>
 <li>裂解缓冲液的配制（每份样品3 mL）。</li>
 <li>洗涤缓冲液的配制（每份样品50 mL）。该缓冲液应预先冷却，并在-20°C冰箱中保存至后续分析使用，整个操作过程中需置于冰上。</li>
 <li>沉淀缓冲液的配制（每份样品20 mL）。该缓冲液应预先冷却，并在-20°C冰箱中保存至使用前，整个操作过程中需置于冰上。</li>
 <li>实验操作最好在4°C的冷室中进行。</li>
</ul>
真菌物种
用于蛋白质组学分析的三个菌株根据其形态特征和翻译延伸因子α-1分析（O'Donnell 等，1998）被归类为Fusarium graminearum
这些菌株属于CRP-Gabriel Lippmann保藏 collection，保存于含15%甘油的-80°C环境中。
菌丝体的制备
真菌在V8培养基上于25°C条件下培养4天，光照与黑暗周期各12小时交替进行。使用无菌刀片将菌丝体切割成碎片，并取这些碎片接种于含有100 mL产毒诱导培养基的250 mL锥形瓶中。培养10天后收集菌丝体，通过无菌滤膜过滤将菌丝体与培养基分离。用无菌水洗涤菌丝体3次，以去除残留的培养基成分及其他化合物。随后立即加入液氮速冻细胞，并将样品保存于-80°C条件下。
蛋白质提取的总体描述
采用图3A和3B中所述方法提取蛋白质样品。Fusarium样品在液氮中研磨后，将粉末收集至10 ml聚四氟乙烯（Teflon）管中。样品随后与裂解缓冲液在室温下孵育30分钟，煮沸10分钟，再于室温下离心两次（12000g，每次15分钟）。收集上清液，加入沉淀缓冲液于-20 °C孵育过夜。在4°C、30000g条件下离心45分钟后，收集沉淀的蛋白沉淀物，并用含DTT的冷丙酮洗涤3次。最后，将沉淀物空气干燥，并用标记缓冲液重新溶解蛋白，调节pH至8.0。取30 ml分样用于总蛋白定量，其余上清液于-20°C保存，直至进行蛋白质电泳。
<img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig1.jpg" alt="时间框架示意图：V8 培养基培养、毒素培养基培养、蛋白质提取的时间线。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 实验流程时间线。
<img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig2.jpg" alt="显示菌株和操作员的生物重复多操作员流程图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 多操作员样本处理流程示意图。
<img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3atmb.jpg" alt="镰刀菌属蛋白质提取流程图；离心；裂解缓冲液及沉淀步骤。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3a"> 图 3a。 <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3btmb.jpg" alt="离心过程示意图，洗涤缓冲液步骤，沉淀物干燥，重悬，-20°C 保存。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3b"> 图 3b。 请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1690/1690fig3a.jpg">点击此处</a>查看图 3a 的放大版本，或<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1690/1690fig3b.jpg">点击此处</a>查看图 3b 的放大版本。
图3a-b。 蛋白质提取流程图（A：第一天；B：第二天）。
<img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig4tmb.jpg" alt="电泳凝胶示意图；DNA分离过程；指示分子量的条带。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 蛋白质提取物的一维图谱。蛋白质电泳至蓝色染料迁移至凝胶末端为止，凝胶使用Lava Purple染色。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1690/1690fig4.jpg">点击此处</a>查看图4的放大版本。

<ol><li>Bridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Extraction+from+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Purification+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protein Extraction from Fungi.</a> Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).</li>
<li>Jiao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+carbon+sources+on+trichothecene+production+and+Tri+gene+expression+by+Fusarium+graminearum+in+liquid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture.</a> FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).</li>
<li>Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Proteomics of filamentous fungi.</a> Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).</li>
<li>Milles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+proteomic+approach+to+monitor+protein+synthesis+in+mycotoxin+producing+moulds%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotoxin+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds.</a> Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).</li>
<li>Morrison, N., Field, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+sample+in+OMICS+technology%5BTitle%5D)+AND+%22OMICS%22%5BJournal%5D)">Concept of sample in OMICS technology.</a> OMICS. 10, 127-137 (2006).</li>
<li>O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+evolutionary+origins+of+the+fungus+causing+Panama+disease+of+banana%3A+Concordant+evidence+from+nuclear+and+mitochondrial+gene+genealogies%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies.</a> PNAS. 95, 2044-2049 (1998).</li>
<li>Paper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+of+extracellular+proteins+in+vitro+and+in+planta+from+the+pathogenic+fungus+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum.</a> Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).</li>
<li>Pasquali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+in+science.+Protocol+videos%3A+the+implications+for+research+and+society%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Video in science. Protocol videos: the implications for research and society.</a> EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).</li>
<li>Taylor, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+about+a+proteomics+experiment+%28MIAPE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE).</a> Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).</li>
<li>Taylor, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analyses+of+Fusarium+graminearum+grown+under+mycotoxin-inducing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions.</a> Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).</li>
</ol>

近年来，蛋白质组学方法在真菌生物学领域的应用日益受到关注，使用该技术的研究发表数量显著增加（参见 Kim et al., 2007 年的综述）。蛋白质提取方法依赖于多种提取步骤的组合，但这些方法在实验方法部分通常描述得较为简略，且需要研究者具备处理潜在问题的技术经验。
与其他“组学”研究方法一样，建立样本和数据处理的标准对于生成可靠的科学信息至关重要。此外，必须充分描述样本及操作流程，以便在不同“组学”实验之间实现结果的共享解读。这对于充分挖掘基因组学、蛋白质组学、代谢组学等跨数据挖掘的潜力至关重要（Morrison et al., 2006）。目前已起草了关于蛋白质组学实验的最低信息要求，并成立了多个工作组，以解决实验中的各个方面问题（凝胶电泳、质谱分析、分子相互作用、蛋白质修饰、蛋白质组学信息学、样本处理）。然而，目前尚无针对样本处理流程的明确定义信息。鉴于蛋白质提取步骤对蛋白质组学研究最终质量具有重要影响，为了在MIAPE指南框架内推进标准化操作（Taylor et al., 2007），我们提出采用视频协议详细展示样本处理过程。实验的视频描述可显著增加样本处理相关信息的透明度，从而提高“组学”实验的可重复性（Pasquali, 2007）。
事实上，实验室之间的可重复性是确保蛋白质组学结果有效性的基本要求（http://www.fixingproteomics.org）。跨实验室的可重复性受两个因素影响：不同的仪器设备以及不同操作人员对样本的处理。
在本方案中，我们建议进行涉及多名操作人员的生物学重复实验（图2和视频），以提高数据的可靠性（即考虑了结果的技术变异）。
所述蛋白质提取方法基于SDS和加热处理。此前已证明该方法可保证获得较高纯度和产量的蛋白质（Bridge 1996）。SDS与煮沸结合可溶解细胞壁、疏水性蛋白质，并防止形成导致蛋白质沉淀中止的寡聚体。煮沸还可使蛋白酶失活。EDTA、PMSF和完全迷你蛋白酶抑制剂也能产生相同的抑制效果。DTT可断裂蛋白质内部及蛋白质之间的二硫键，从而促进蛋白质的溶解。
为了在等电聚焦（IEF）前去除SDS，需使用丙酮/三氯乙酸（TCA）/二硫苏糖醇（DTT）对蛋白质进行沉淀。此外，当存在脂质、核酸、盐类和/或酚类化合物时，丙酮/TCA/DTT沉淀还可去除这些部分污染物。与SDS类似，这些分子会阻碍IEF过程中的良好迁移。在完成该沉淀步骤后，必须使用丙酮/DTT洗涤沉淀的蛋白质，以去除可能干扰IEF的TCA。
良好的样品制备是获得理想结果的关键。为此，还必须避免环境中的蛋白质污染，操作时应佩戴无粉手套，并严格遵守良好的实验室规范。从技术角度来看，在本方案所述的流程中，获得足量且高纯度蛋白质的最关键步骤有两个阶段：首先是研磨阶段，彻底破坏细胞对于释放蛋白质至关重要；其次是总蛋白质的纯化阶段，该阶段需去除大部分脂质、DNA及其他可能干扰蛋白质迁移的污染物。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;培养基与溶液&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;u&gt;马铃薯葡萄糖琼脂&lt;/u&gt;：39 g 马铃薯葡萄糖琼脂（Difco）；1 L 蒸馏水。&lt;br/&gt;&lt;u&gt;V8 琼脂&lt;/u&gt;：200 ml V8（金宝汤）&amp;rsquo;s，美国）、2 g CaCO3（Sigma）、16 g 琼脂（DIFCO）、800 ml 蒸馏水&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;u&gt;产毒诱导培养基&lt;/u&gt;：1克 K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，0.5 g KCl，0.5 g MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、10 mg FeEDTA、2 g L-谷氨酸、10 g蔗糖溶于1 L蒸馏水中。&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;u&gt;裂解缓冲液&lt;/u&gt;:&lt;/p&gt;&lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt;&lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;100 mL&lt;/td&gt; &lt;td&gt;终浓度 &lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Tris-HCl pH8&lt;/td&gt; &lt;td&gt;5 mL&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM &lt;/td&gt; &lt;td&gt;1 M&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;十二烷基硫酸钠&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2克或10毫升&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2%&lt;/td&gt; &lt;td&gt;20%&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;DTT&lt;/td&gt; &lt;td&gt;500 mL&lt;/td&gt; &lt;td&gt;10 mM&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2M&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;EDTA&lt;/td&gt; &lt;td&gt;20 mL&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.1 mM&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.5 M&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;PMSF&lt;/td&gt; &lt;td&gt;200 mL&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;完全型迷你蛋白酶抑制剂&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1片&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;水&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Qsp&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p&gt;&lt;u&gt;沉淀缓冲液&lt;/u&gt;:&lt;/p&gt;&lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt;&lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;100 mL&lt;/td&gt; &lt;td&gt;终浓度&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;三氯乙酸 &lt;/td&gt; &lt;td&gt;20 mL&lt;/td&gt; &lt;td&gt;20%&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;DTT &lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.1 mL&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.1%&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;丙酮&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Qsp&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p&gt;&lt;u&gt;洗涤缓冲液：&lt;/u&gt;&lt;/p&gt;&lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt;&lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;100 mL&lt;/td&gt; &lt;td&gt;终浓度&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;DTT &lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.1 mL&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.1%&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;丙酮&lt;/td&gt; &lt;td&gt;100 mL&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p&gt;&lt;u&gt;标记缓冲液（于 -18°C 保存）&amp;#x00B0;C，分装成小份：&lt;/u&gt;&lt;/p&gt;&lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt;&lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1 mL&lt;/td&gt; &lt;td&gt;终浓度 &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;尿素 &lt;/td&gt; &lt;td&gt;140 mg&lt;/td&gt; &lt;td&gt;7M &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;硫脲 &lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mg&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2M &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;CHAPS&lt;/td&gt; &lt;td&gt;40 mg&lt;/td&gt; &lt;td&gt;4% &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Tris&lt;/td&gt; &lt;td&gt;30 &amp;#x03BC;L&lt;/td&gt; &lt;td&gt;30 mM &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;水&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1 mL&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;</td></tr></tbody></table>

用于蛋白质组学研究的fusarium spp.培养物毒素诱导与蛋白质提取

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria 是能够产生多种毒素的丝状真菌。镰刀菌霉菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol）、雪腐镰刀菌烯醇（nivalenol）、T2毒素、玉米赤霉烯酮（zearelenone）、镰刀菌酸（fusaric acid）、单端孢霉烯（moniliformin）等，对人类和动物健康具有不良影响，其中一些还被认为是致病因子。蛋白质组学研究已被证明在解析Fusaria毒素产生机制（Taylor et al., 2008）以及鉴定潜在致病因子（Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007）方面行之有效。因此，建立可靠的方法以实现不同蛋白质组学研究之间的比较变得至关重要，从而确保实验、菌株及实验室之间所观察到的蛋白质表达差异是真实存在的。本文所描述的实验流程将从两个方面促进蛋白质组学操作的标准化水平提升。视频化操作协议可用于精确描述更详尽的操作细节；此外，采用标准化流程处理生物学重复样本，有助于提高数据的稳健性，同时也能将人为因素对提取步骤技术可重复性的影响纳入考量。
本方案完成需要16天：其中14天用于培养，2天用于蛋白质提取（图1）。
简而言之，Fusarium 菌株在固体培养基上培养 4 天后，经人工剪碎并转移至改良的产毒诱导培养基（Jiao et al., 2008）中继续培养 10 天。菌丝体通过 Miracloth 滤布过滤收集。研磨操作在低温室中进行。为消除技术操作差异带来的偏差，由不同操作人员独立完成提取重复实验（n=3）（图 2）。蛋白提取基于 Taylor 等（2008）所述的 SDS/DTT 缓冲液方法，并进行了轻微修改。总蛋白提取需使用丙酮/TCA/DTT 缓冲液在 4°C 过夜沉淀蛋白，并用丙酮/DTT 溶液洗涤（图 3a, 3b）。最终将蛋白重新溶解于蛋白标记缓冲液中并进行定量。提取结果通过一维凝胶电泳（图 4，SDS-PAGE）进行可视化检测，随后进行二维凝胶电泳（IEF/SDS-PAGE）。该方法同样适用于其他培养基及其他丝状真菌的蛋白质组学分析（Miles et al., 2007）。

为了符合蛋白质组学实验最低信息标准（MIAPE）指南，对真菌物种进行蛋白质组学分析所需的蛋白质提取必须实现高度标准化。我们提供了一个视频方案，其中包含在毒素诱导及从Fusarium spp.中提取蛋白质过程中减少实验偏差的操作步骤。

用于蛋白质组学研究的Fusarium spp.培养物毒素诱导与蛋白质提取

镰刀菌属（Fusaria）是能够产生多种毒素的丝状真菌。镰刀菌产生的霉菌毒素包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol）、雪腐镰刀菌烯醇（nivalenol）、T2毒素、玉米赤霉烯酮（zearelenone）、镰刀菌酸（fusaric acid）等。

本视频介绍了一种用于诱导某些真菌物种产毒的方法（本案例中用于），以及本实验室用于蛋白质组学研究的全蛋白质提取方案。整个实验流程耗时16天，包括真菌培养4天、产毒10天和蛋白质提取2天。培养4天后，菌落仍处于向培养皿边缘活跃生长的阶段。典型的气生菌丝形成后，在层流罩中用无菌刀片轻轻刮取平板表面收集。将菌丝切成五个小片，加入含有25毫升毒素诱导培养基的早代培养瓶中。毒素诱导效率高于暗色孢子。锥形瓶用铝箔封口。培养物在25摄氏度下以每分钟150转的速度振荡培养10天。培养基为SAPH，含有高浓度的S row溶液。床铺与黑暗环境相结合已知可促进 ria 中毒素的合成。随后通过 MI 密闭组织过滤将菌丝体与含毒素的液体分离。该液体可用于测定毒素含量，而菌丝体则用于蛋白质提取。为避免培养基残留，菌丝需用无菌水清洗三次。随后应去除多余水分，加入液氮，样品可保存在-80°C或直接用于蛋白质提取。蛋白质提取过程基于SDS和TCA的使用，包含多个裂解步骤。他将提出一种可由多名操作人员共同执行的方法。同时，在提取生物学重复样本时，每个重复样本由不同的操作人员独立完成。该流程考虑到了不同操作人员在处理重复样本时可能引入的提取步骤差异。因此，在比较生物学重复时，由于操作者变量已被纳入重复中，该方法应表现出更高的稳健性。同时，使用多名操作者可缩短样品处理时间。样品需在无菌研钵中使用液氮研磨，直至菌丝成为细粉。此步骤对蛋白质的质量和产量至关重要。将菌丝体以占特氟龙管总体积五分之二的比例收集到10毫升特氟龙管中，随后加入含有SDS和多种蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液。然后振荡试管直至获得均一溶液。随后，样品在低温室中振荡30分钟以进一步均质化，之后将样品煮沸，以溶解细胞壁和疏水性蛋白质。SDS的存在可防止形成导致蛋白质沉淀中止的寡聚体。离心步骤可分离出三个相。蛋白质悬浮于透明溶液中，将该溶液收集至新的预冷离心管中并置于冰上。随后使用沉淀物进行第二次裂解步骤，重复涡旋、煮沸和离心操作。将两次裂解所得的上清液合并，以便使用含乙酸、三氯乙酸和 DTT 的冰冻沉淀缓冲液进行沉淀。然后将样品在 -20 °C 下储存过夜（16 小时），以促进蛋白质沉淀。蛋白质沉淀物位于管底，有助于提高沉淀效果。将试管以高速离心45分钟。此时沉淀已清晰可见。可使用5毫升移液管吸头弃去上清液。然后加入 25 毫升含有丙酮和 DTT 的冰冻洗涤缓冲液以去除 TCA，并充分剧烈振荡。接着进行新的离心步骤。蛋白质凝胶现在处于漂浮状态，因此应注意消除皱褶。进行第二次洗涤步骤，加入洗涤缓冲液，振荡并离心。去除上清液，使用速干仪将样品干燥。当样品干燥后，蛋白质呈粉末状。用于储存时，应将样品蛋白质从管中取出，以减少塑料产生的静电干扰。使用静电枪，并用金属刮刀收集蛋白质粉末。随后将蛋白质直接重悬于标记缓冲液中。在800 ×g 条件下用于二维电泳30分钟。足以用于溶解蛋白质，然后再进行成本较高的二维标记。蛋白质质量可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳一维凝胶进行检测，结果如图所示。泳道边缘无明显拖尾现象表明样品质量良好。

toxin-induction-protein-extraction-from-fusarium-spp-cultures-for

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

毒素诱导和蛋白质提取镰刀 SPP。</em蛋白质组学研究>文化

为了研究禾谷镰刀菌子囊孢子的发育过程，本实验拍摄了在无菌条件下收集子囊孢子的操作流程，以期为实验方案的描述提供尽可能详尽的信息。这将有助于提高实验的可重复性，尤其是在进行全基因组表达谱检测时，这一点至关重要。...

玉米赤霉菌子囊孢子的产生与收集用于微阵列实验

种子感染性真菌对谷类作物造成的破坏已促使大量研究致力于深入理解植物与病原体之间的相互作用。为了在实验室条件下研究种子与真菌的相互作用，我们开发了一种可靠的方法，通过籽粒生物测定来定量分析真菌繁殖、生物量及真菌毒素污染情况。...

利用籽粒生物测定法量化真菌定殖、产孢及真菌毒素的产生

伯克霍尔德菌属（Burkholderia）成员是具有重要临床意义的病原体。本文介绍一种利用机械破碎法进行细菌总蛋白提取，并结合二维凝胶电泳进行后续蛋白质组学分析的方法。...

总蛋白提取与二维凝胶电泳方法 伯克霍尔德菌属 物种

我们展示了一种用于分析花生种子中黄曲霉毒素及转基因表达的方法，这些花生种子含有针对真菌Aspergillus...

通过RNAi控制花生中的黄曲霉毒素：分析花生中霉菌毒素产生及转基因表达的方法曲霉属 病理系统

本文介绍了一种用于分析表达抗真菌蛋白的玉米籽粒中Aspergillus flavus生长及黄曲霉毒素产生的实验方案。  利用表达GFP的A.

抑制 Aspergillus flavus 表达α-淀粉酶抑制剂的转基因玉米中的生长及黄曲霉毒素产生 Lablab purpureus L.

本实验方案的目的是在未使用厌氧培养箱的情况下，检测本地采购食品中不同类型的产气荚膜梭菌（Clostridium...

富集与检测 产气荚膜梭菌 零售食品样品中的毒素型

本文介绍了一种基于质谱蛋白质组学的方法，用于在感染过程中分析宿主与病原体之间的相互作用。该方法通过非标记定量技术，在单次实验中同时检测宿主（例如巨噬细胞）和病原体（例如Cryptococcus...

基于无标记定量蛋白质组学的工作流程用于发现驱动型宿主-病原体相互作用

本文介绍一种利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间-飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF）及自主开发的软件进行自上而下蛋白质组学分析，快速鉴定基因组测序的致病菌所产生蛋白质的实验方案。由于天冬氨酸效应，亚稳态蛋白质离子发生断裂，该特异性被用于蛋白质鉴定。...

抗菌免疫蛋白的鉴定 大肠杆菌 使用 MALDI-TOF-TOF-MS/MS 和自上而下蛋白质组学分析

本文介绍了一种基于 黄粉虫（Tenebrio...

从土壤样品中分离与筛选昆虫病原真菌及其对害虫的致病力评估

从热带土壤样品中分离昆虫病原真菌菌落 Tenebrio 诱饵， 大蜡螟 诱饵，以及选择性人工培养基，即.添加氯霉素、噻苯咪唑和环己酰亚胺的酵母提取物增强马铃薯葡萄糖琼脂（CTC...

土壤样品中昆虫病原真菌分离方法的比较

本文旨在提供详细的实验方案，用于分离植物相关内生真菌、长期保存分离物、形态学表征，以及提取总DNA，以用于后续的分子鉴定和宏基因组分析。...

分离、鉴定及全基因组DNA提取以鉴定菌根异养植物中的内生真菌

了解镰刀菌毒素诱导与蛋白质提取的标准化流程，用于蛋白质组学研究。该方法遵循MIAPE指南，通过SDS和TCA提取高质量蛋白，减少实验偏差，提高结果可重复性。

用于蛋白质组学研究的Fusarium spp.培养物毒素诱导与蛋白质提取

探索更多视频