Name: PuraMatrix封装癌细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 了解如何使用PuraMatrix自组装肽凝胶封装卵巢癌细胞系CAR5，建立三维培养模型模拟体内微环境。该方法有助于研究癌症治疗反应和微转移结节形成。

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技术说明：
<ul>
 <li>凝胶化反应由盐的添加引发。因此，在尚未需要凝胶化时，盐类物质绝不可与 PuraMatrix 接触；暴露于离子强度极低的盐溶液（例如 &lt; 0.05 M）将导致不可逆的凝胶化。</li>
 <li>配制后剩余的储存液，只要未接触盐类，可在日后继续使用。无需担心重复进行超声处理。</li>
 <li>可通过将 PuraMatrix 分装至无菌离心管中并离心，以去除气泡。</li>
 <li>更换培养基时需格外小心，吸液操作可能轻易破坏 PuraMatrix 层。</li>
</ul>
材料：
BD PuraMatrix RAD16 肽水凝胶-1%（货号 # 354250）：未稀释混合物的总肽浓度为 10 mg/mL。
<ul>
<li>水浴超声波破碎仪或涡旋振荡器</li>
<li>96孔细胞培养板</li>
<li>细胞培养基</li>
<li>无菌过滤的 H2O</li>
<li>无菌过滤的 20% 蔗糖溶液</li>
<li>细胞（每孔 5,000 个细胞）：OVCAR-5</li>
</ul>
所有步骤都必须在无菌条件下进行。
实验步骤：
<ol>
	<li>使用水浴超声仪对1% PuraMatrix（RAD16）进行30分钟超声处理，以降低其黏度，便于后续使用。</li>
	<li>现在可将1% PuraMatrix溶液分装至无菌离心管中，以便简化后续实验。
	<ol class="lalpha">
		<li>避免产生气泡；若出现气泡，只需将含有PuraMatrix的无菌管在1000 rpm（300 × g）下离心5分钟即可。</li>
		<li>未稀释混合物的总肽浓度为10 mg/ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分别在两组4个孔中接种，使总肽浓度分别为2.5 mg/ml和1.25 mg/ml。</li>
	<li>用0.2 μm滤膜过滤的20%蔗糖和13.3%蔗糖分别稀释每组孔中的PuraMatrix，使总肽浓度达到5 mg/ml和2.5 mg/ml，从而获得在10%蔗糖中浓度为2×的BD PuraMatrix。
	<ol class="lalpha">
		<li>配制20%蔗糖：溶解10 g蔗糖，加水定容至50 ml。</li>
		<li>13%和10%蔗糖可通过稀释20%储备液制备。
		<ol class="lroman">
			<li>13%蔗糖（每10 ml）：6.5 ml 20%蔗糖 + 3.5 ml无菌H2O。</li>
			<li>10%蔗糖（每10 ml）：5.0 ml 20%蔗糖 + 5.0 ml无菌H2O。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
 </li>
	<li>根据拟接种的孔数，配制PuraMatrix肽的母液混合物。（见下文示例。）然后将母液分装至各单独离心管中，每管含25 ml母液。
	<ol class="lalpha">
		<li>母液应配制成目标最终总肽浓度的两倍，因为在接种时将与等体积的细胞悬液混合而被稀释。 <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig11.jpg" alt="用于科研实验的肽浓度示意图及PuraMatrix稀释流程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 1"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过胰蛋白酶消化单层细胞培养物来制备细胞悬液。
	<ol class="lalpha">
		<li>每个T-75培养瓶可使用2 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入含10%热灭活胎牛血清的细胞培养基以中和胰蛋白酶（每使用1 ml胰蛋白酶，至少加入2 ml培养基）。</li>
	<li>在1000 rpm（约300 × g）下离心5分钟，形成细胞沉淀。
 <ol>
		<li>用10%无菌过滤蔗糖重悬细胞。</li>
		<li>计数细胞后，再次在1000 rpm（约300 × g）下离心5分钟，以去除培养基中残留的微量盐分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将OVCAR-5细胞以2.0 × 105 个细胞/ml的密度重悬于10%蔗糖中，使每孔最终细胞数为5,000个细胞。 
以下步骤应迅速操作。 </li>
 <li>如上图所示，向第一个含有25 μl PuraMatrix母液的单独离心管中加入25 μl浓度为2.0 × 105 个细胞/ml的细胞悬液。
 <ol class="lalpha">
 <li>通过移液器轻轻吹打约5次（上下吹打），迅速混匀，注意不要引入气泡。</li>
 <li>然后将50 μl细胞悬液/PuraMatrix混合物移入96孔板的相应孔中。</li>
 <li>通过移液器沿孔壁轻轻加入150 μl细胞培养基（RPMI + 10% FBS），启动BD PuraMatrix的凝胶化过程 <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig12.jpg" alt="细胞悬液处理、稀释至PuraMatrix、实验装置示意图、试管分布。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 2"></li>
 </ol>
 </li>
 <li>重复第8步的操作，直至所有孔均完成接种。</li>
 <li>30分钟后，极其轻柔地使用200 μl移液器移除约2/3的培养基，以平衡水凝胶的pH值。
 <ol class="lalpha">
 <li>切勿使用真空抽吸器，否则会破坏基质结构 </li>
 <li>将移液器吸头放入孔中，确保不接触PuraMatrix凝胶层，轻柔地吸出培养基。 </li>
 <li>在PuraMatrix中培养细胞时，应特别注意避免扰动基质。 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>极其轻柔地沿含有包裹在PuraMatrix中细胞的孔壁加入150 μl新鲜细胞培养基。</li>
 <li>每隔48小时，通过仔细重复步骤10和11，更换每孔中的细胞培养基。 </li>
 </ol>
代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig1tmb.jpg" alt="细胞生长进程、显微镜图像，第1-7天，显示大小和结构变化，比例尺为10 µm。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. OVCAR-5 细胞按照上述方案进行包封。图像使用配备 Spectra-Physics DeepSee 钛宝石激光器（调谐至750 nm）的倒置 Olympus FV1000 显微镜采集。成像分别在接种后第1、3、5和7天进行。采用长工作距离水浸式40倍物镜（Olympus LUMPLFLN 0.8 NA）对PuraMatrix内部进行成像。通过以1.47 μm轴向步长采集图像堆栈，获得三维图像体积。两个非扫描探测器分别使用紫光（440-490 nm）和绿光（510-550 nm）带通滤光片收集自发荧光信号。最终图像及深度堆栈视频通过ImageJ软件合并两个探测通道的数据进行处理。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1692/1692_fig1.jpg">点击此处</a>查看图1的放大版本。

<ol><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+Peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS One. 1, e119-e119 (2006).</li>
</ol>

puramatrix 包封癌细胞

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

越来越多的证据表明，将癌细胞在三维条件下进行培养，能够更准确地模拟肿瘤生物学的复杂性。许多此类模型使用来源于动物的重建基底膜，其中含有可影响这些细胞培养模型生长的可变含量的生长因子和细胞因子。在此，我们详细描述一种 commercially available（商品化）自组装肽凝胶 PuraMatrix 的制备与使用方法。该材料不含动物源性成分和病原体，可用于包裹并培养卵巢癌细胞系 OVCAR-5。我们首先介绍如何在使用前对 PuraMatrix 进行准备。随后，我们演示如何正确混合 PuraMatrix 与细胞悬液，以将细胞包埋于水凝胶中。当加入细胞培养基或将其注入生理环境后，PuraMatrix 中的肽组分会迅速自组装形成一种三维水凝胶，该凝胶具有纳米级纤维结构，平均孔径为 5–200 nm。1此外，我们展示了如何扩增在封装的 PuraMatrix 中培养的细胞。当 OVCAR-5 细胞被封装在 PuraMatrix 中时，会自组装成三维腺泡样结构，其形态比传统的单层体外模型更接近临床中观察到的微转移结节。通过共聚焦显微镜，我们展示了接种后第 1、3、5 和 7 天，封装于 PuraMatrix 中的代表性 OVCAR-5 细胞的形态变化。使用 PuraMatrix 培养癌细胞将有助于加深我们对该疾病的理解，并使我们能够在更具临床预测价值的模型系统中评估治疗反应。

本视频演示了如何在 PuraMatrix（一种市售的自组装肽凝胶）中包封和培养癌细胞。

PuraMatrix 包封癌细胞

越来越多的证据表明，将癌细胞进行三维培养能更准确地模拟肿瘤生物学的复杂性。许多这些……

单层细胞培养模型在研究包括癌症在内的多种疾病方面一直是十分有用的工具。然而，这些模型无法重现体内所观察到的三维环境。本视频将演示使用一种市售的自组装肽凝胶——纯Matrixx，来包封并培养卵巢癌CAR five细胞系的方法。将细胞悬液与纯Matrixx及细胞培养基混合，加入培养基以启动纯Matrixx的活化过程。当细胞在纯Matrixx中被包封并培养时，Carv五种细胞会自组装成类似于微转移瘤形态的三维ASIN R结构。你好，我是Adnan Abbi。我是马萨诸塞州总医院女性光医学中心TBA Hassan博士实验室的一名研究学者。今天我们将向您展示一种在名为Pure Matrix的合成基质中包封和培养卵巢癌细胞系的实验方案。在我们的实验室中，利用该模型来评估卵巢癌的治疗反应。那么，让我们开始吧。BD 1%纯基质RAD 16肽水凝胶在使用前的总肽浓度为10毫克每毫升。将纯基质置于水浴中超声处理30分钟，以降低其黏度；超声处理后，需在保持无菌条件的情况下进行后续操作。将1%纯基质溶液分装至无菌管中。为简化后续实验，应避免产生气泡；若已形成气泡，可将含有纯基质的无菌管在1000 RPM条件下离心5分钟以去除。在本实验中，我们将分别以每毫升2.5毫克和每毫升1.25毫克的总肽浓度包被两组、每组四个孔。根据拟包被的孔数（本例中为8个孔），配制两种纯基质-肽的母液混合物。每种主混合液应配制为总肽最终浓度的两倍，因为在铺板时会与等体积的细胞混合，从而使主混合液将纯基质分别用无菌10%蔗糖和13.3%蔗糖稀释至总肽浓度为每毫升5毫克和每毫升2.5毫克，以获得在10%蔗糖中浓度为2×的纯Matrixx。随后将25微升主混合液分装至八个独立的离心管中。纯基质主混合液现已准备好用于包封细胞。本实验将包封并扩增卵巢癌CAR five细胞系。在胰蛋白酶孵育前，先将细胞与10毫升无钙、无镁的无菌PBS孵育15至20分钟。吸去 PBS，用胰蛋白酶消化单层细胞培养物，加入含有 10% 热灭活胎牛血清的细胞培养基以中和胰蛋白酶活性。每毫升之前步骤中使用的胰蛋白酶，需使用至少两毫升培养基。接着，将细胞转移至离心管中，在 1000 RPM 条件下离心 5 分钟，以形成细胞沉淀。离心后，将细胞沉淀重悬于10%无菌过滤的蔗糖溶液中。计数细胞，并以1000 RPM转速离心五分钟。为去除培养基中残留的微量盐分，将O car五细胞重悬于10%蔗糖溶液中，浓度为每毫升含2×10⁵个细胞，使每孔最终细胞数量为5,000个细胞/孔。细胞现已准备好进行纯基质（pure Matrixx）包封。以下包封细胞的步骤必须迅速进行：取25 µL先前制备的细胞悬液，加入到含有25 µL纯基质（pure Matrixx）预混液的单个离心管中。通过移液器在管内快速上下吹打约五次，充分混匀，注意避免引入气泡。然后将50 µL细胞悬液与纯Matrixx的混合物用移液器加入96孔细胞培养板的相应孔中。通过移液器沿孔壁轻柔加入150 µL细胞培养基，以启动BD纯Matrixx的凝胶化。对剩余各孔重复上述步骤，完成细胞的包封。请注意，这些步骤必须快速进行，且每个孔的整个包封过程需在进入下一个孔之前完成。八孔均接种完成后，将细胞孵育30分钟。30分钟后，使用200微升移液器，将吸头插入孔中，避免接触纯基质层，并极其轻柔地移除孔中的培养基。需移除约三分之二的培养基，以平衡水凝胶的pH值。请勿使用真空吸液器，因为这会破坏基质。接下来，非常轻柔地将 150 微升新鲜细胞培养基沿孔壁加入含有包埋于纯 Matrixx 中细胞的孔内。按照之前所示方法，移除三分之二的培养基，并向其余孔中加入新鲜培养基。每 48 小时用新鲜培养基更换每个孔中的细胞培养液。如前文所述，对 OR 五细胞进行了包封。图中展示了纯基质中包封并培养的 OR 五细胞在第 1、3、5 和 7 天的代表性 3D 成像结果。我们刚刚向您展示了如何在培养中将卵巢癌细胞系CAR five与一种名为Pure Matrixx的合成基质进行包封。因此，在使用Pure Matrixx时，需要注意的是，本实验方案已针对O Car five细胞系进行了优化。每位研究人员都需要根据自己所使用的特定细胞系对方案进行优化和精细调整。并且在进行培养基更换时，请记住非常重要的一点：不要扰动基质层，因为它非常脆弱，切勿使用抽吸法，务必始终使用移液器。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

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Biology

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