Name: KLRG1四聚体的生产协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 学习KLRG1四聚体的生产方法，通过细菌培养、IPTG诱导表达、包涵体纯化和复性等步骤制备KLRG1四聚体。该方案可用于免疫学研究中分析KLRG1配体相互作用。

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感谢 Naidenko 博士在优化复性条件方面提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）研究基金 AI58181 支持，授予 Laurent Brossay。Cindy Banh 由 NIH NRSA F31 AI080230 基金资助。
Stephanie Terrizzi 和 Cindy Banh 对本研究工作贡献相同。

包涵体的制备
<ol>
 <li>将表达KLRG1质粒构建体的细菌过夜培养物接种至4个500 ml的TB培养基中，每个培养基含有50 μg/ml羧苄青霉素和氯霉素。当600 nm处的OD值达到0.6 Å时，加入0.4 M IPTG进行诱导，并在37°C下继续振荡培养4小时。</li>
 <li>用重悬缓冲液（pH=8.0，含50 mM Tris-HCl、25% (W/V) 蔗糖、1 mM EDTA、10 mM DTT）重悬收集的菌体。注意：此步骤的菌体沉淀可在此阶段冷冻保存。</li>
 <li>将不超过60 ml的菌体重悬液汇集至一个聚丙烯烧杯中。如有必要，用pH 8.0的TE缓冲液调整体积至60 ml，并以半速搅拌混合物。</li>
 <li>在搅拌过程中逐滴加入以下成分：溶菌酶（终浓度=1 mg/ml）、MgCl₂（终浓度=5 mM）、含75 mM NaCl的50%甘油中的2 mg DNA酶I、Triton-X100（终浓度=1%）、DTT（终浓度=10 mM）。</li>
 <li>将溶液在冰上超声处理1.5分钟，然后在4°C下以5,000 RPM离心10分钟。
 <ol class="lalpha">
 <li>倾去上清液。</li>
 <li>加入15 ml洗涤缓冲液（pH=8.0，含50 mM Tris-HCl、0.5% Triton X-100、100 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT）。</li>
 <li>在冰上将溶液超声处理1.5分钟，直至沉淀完全重悬。</li>
 <li>在4°C下以5,000 RPM离心10分钟。</li>
 <li>重复洗涤5次。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>使用不含Triton X-100的洗涤缓冲液重复步骤5b，离心后重悬于4 ml TE缓冲液中。</li>
 <li>称取湿重的包涵体悬液，并以30至100 mg/ml的浓度保存在TE缓冲液中。</li>
</ol>
KLRG1 的复性
<ol>
 <li>配制1 L pH=8.0的复性缓冲液（0.4 M Arginine-HCl、0.1 M Tris pH 8–8.3、2 mM EDTA、0.2 mM PMSF、3片不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂、5 mM GSH和0.5 mM GSSG），在搅拌的同时冷却至4°C。</li>
 <li>准备用于注入复性混合液的包涵体：理想情况下进行5–10次注入，每次注入浓度为0.25–0.5 μM，使蛋白最终浓度达到2–3 μM。
 <ol class="lalpha">
 <li>将含50 mg包涵体的浆液溶于7 M GnHCl并加入10 mM β-巯基乙醇中，使其完全溶解。</li>
 <li>将包涵体/GnHCl混合物在37°C下保温30–40分钟，每5分钟涡旋振荡一次，以确保完全溶解（完全溶解后浆液将变得澄清）。</li>
 <li>在4°C下以最大转速离心30分钟，将上清液转移至15 ml离心管中。注意不要转移任何少量黑色沉淀。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>用注射缓冲液（3 M GnHCl、10 mM NaAcetate、pH 4.2、10 mM EDTA）调节体积。</li>
 <li>每小时注入1 ml稀释后的包涵体溶液。注入时高速搅拌，逐滴加入1 ml稀释包涵体，每滴间隔2秒。注射完成后改为低速搅拌。</li>
 <li>在4°C下继续低速搅拌过夜。</li>
</ol>
复性反应的浓缩
<ol>
 <li>按照 Millipore 的方案，使用 Amicon 搅拌式超滤池和 YM10 NMWL 10K 超滤膜（Millipore），将 1 L 预过滤（0.22 μm 滤膜过滤）的复性反应液浓缩至约 10 ml。</li>
 <li>使用 Centriplus YM-10 10K MWCO（Millipore）进一步浓缩至 ≤2 ml。</li>
</ol>
KLRG1四聚体的纯化
<ol>
 <li>根据 GE Healthcare 的操作手册，在 4°C 下设置 AKTAFPLC 系统。</li>
 <li>使用 Sephacryl S-200 16/60 高分辨率柱（GE Healthcare），在 20 mM HEPES 和 150 mM NaCl 缓冲液中通过尺寸排阻色谱法纯化 KLRG1 的单体形式。（见图 1）。</li>
 <li>使用 Centriplus YM-10 10K MWCO（Millipore）将样品浓缩至 1 ml。</li>
 <li>按照 Avidity 公司的实验方案，使用 BirA 酶对 KLRG1 单体进行生物素标记。</li>
 <li>通过与步骤 2 相同的尺寸排阻色谱法去除游离生物素。</li>
 <li>通过将 KLRG1 单体与 4 倍摩尔过量的 PE 标记链霉亲和素（BD Biosciences）混合，使 KLRG1 分子形成四聚体。</li>
</ol>
代表性结果
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="色谱图；化合物分离峰；分析化学；标注保留时间。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"></a> 图1. 重折叠KLRG1蛋白经AKTA FPLC凝胶过滤层析获得的典型阳性结果。该图显示了重折叠KLRG1的单体（83.52 ml）、二聚体（56.36 ml）和多聚体（36.26 ml）形式的分离情况。94.25 ml处的峰代表缓冲液置换组分。

<ol><li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li>
<li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li>
<li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li>
<li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li>
<li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+%28KLRG1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

本方案展示了如何纯化、生物素标记并四聚化KLRG1。KLRG1四聚体可用于通过流式细胞术标记KLRG1配体。尽管每种蛋白质的复性条件需通过实验经验确定，但其他C型凝集素可采用类似方案进行四聚化。利用四聚化的蛋白质作为探针，有望鉴定孤儿C型凝集素受体的配体。

<table><tbody><tr><td>BirA 酶和缓冲液</td><td>生物素化试剂盒</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini 蛋白酶抑制剂片剂，无 EDTA</td><td>试剂</td><td>Roche 集团</td><td>11 836 170 001</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>Amicon 搅拌式超滤池</td><td>设备</td><td>EMD Millipore</td><td>型号 #8400</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>YM10 NMWL 10K 超滤膜</td><td>过滤耗材</td><td>EMD Millipore</td><td>13642</td><td></td></tr><tr><td>15 ml YM10 浓缩管</td><td>过滤耗材</td><td>EMD Millipore</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>AKTAFPLC</td><td>设备</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-200 16/60 高分辨率柱</td><td>设备</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素 PE</td><td>试剂</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>或同等产品</td></tr></tbody></table>

klrg1 四聚体的制备方案

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

杀伤细胞凝集素样受体G1（KLRG1）是一种属于C型凝集素样超家族的II型跨膜糖蛋白抑制性受体。KLRG1以单体和二硫键连接的同源二聚体两种形式存在。这种高度保守的受体表达于最成熟且近期被激活的自然杀伤细胞上，同时也表达于一部分效应/记忆T细胞亚群中。
利用KLRG1四聚体及其他方法，已鉴定E-、N-和R-钙黏蛋白为KLRG1的配体。这些依赖Ca2+的细胞间黏附分子包含一个胞外结构域，该结构域含有五个介导细胞间相互作用的钙黏蛋白重复序列，以及一个跨膜结构域和一个与肌动蛋白细胞骨架相连的胞质结构域。
KLRG1四聚体的制备对于鉴定KLRG1配体至关重要。KLRG1四聚体也是一种独特的工具，可用于阐明钙黏蛋白与KLRG1在调控免疫应答及组织完整性中所发挥的作用。

本方案描述了KLRG1四聚体的制备方法，这是一种用于分析KLRG1配体的有力工具。

KLRG1 四聚体的制备方案

杀伤细胞凝集素样受体G1（KLRG1）是一种属于C型凝集素样超家族的II型跨膜糖蛋白抑制性受体。

大家好，我是来自布朗大学分子微生物学与免疫学系Lauren Parce实验室的Stephanie Resi。今天我们将向您展示一种制备K LRG one四聚体的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究K LRG one的协同相互作用。让我们开始。首先，将表达 K LRG1 质粒构建物的细菌接种至四瓶含有适当抗生素的 500 毫升 TB 缓冲液中，于 37 摄氏度振荡培养。当 OD600 达到 0.6 时，通过加入 0.4 摩尔的 IPTG，利用 T7 启动子诱导表达，并继续在 37 摄氏度振荡培养 4 小时。培养 4 小时后，将菌液转移至离心管中，在 4 摄氏度、3000 转/分钟条件下离心 20 分钟，沉淀菌体。如有需要，可将沉淀在-80摄氏度冷冻保存，以备后续使用。将收获的细胞重悬于30毫升重悬缓冲液中。随后，在聚丙烯烧杯中合并细菌重悬液，总体积可达60毫升。如有必要，用额外的 pH 8 的 TE 缓冲液将总体积调至 60 毫升，并在加热板上以半速搅拌混合物，同时池化后的重悬液正在搅拌。将溶菌酶、氯化镁、DNase I、Triton X-100，最后加入 DTT，逐滴加入该混合物中。使用配备超声波转换器的探头在30%振幅下将溶液转移至超速离心管中。在冰上超声处理溶液1.5分钟，然后在4°C下以5,000 RPM离心裂解液10分钟，倾去上清液并加入15毫升洗涤缓冲液。重复上述超声处理步骤，直至沉淀完全重悬，再次重复离心步骤，并重复洗涤和沉淀过程共五次。最后，使用不含 Triton X-100 的洗涤缓冲液重悬沉淀。再次离心后，用 4 毫升 TE 缓冲液重悬。这些即为包涵体。通过湿重定量包涵体。包涵体悬液可在4°C下保存于浓度为30至100毫克/毫升的缓冲液中。准备好包涵体后，即可进行复性准备。开始复性步骤时，先配制一升新鲜的复性缓冲液，并在4摄氏度下低速搅拌以冷却。接下来，准备七份包涵体样品用于注入复性缓冲液中。首先，在37摄氏度水浴中将包涵体悬液原液融化，该悬液最终体积为1.4毫升，溶于含7摩尔/升盐酸胍和10毫摩尔/升β-巯基乙醇的溶液中，孵育30至40分钟。每五分钟涡旋一次。当混悬液变得澄清时，表明融化已完全。将融化的混合物在4°C条件下，于微量离心机中以最大速度离心30分钟。然后小心操作，避免收集到任何少量的黑褐色沉淀。将上清液转移至15毫升离心管中。用注射缓冲液将体积调至七毫升以进行注射。首先，将复性混合物的搅拌速度调至高速，然后加入一毫升稀释的包涵体。每次仅逐滴加入，每滴之间间隔两秒。每次加入一毫升稀释后的包涵体，每次注射之间间隔一小时。加样结束后，将搅拌速度调回低速 o。在4°C下低速继续搅拌过夜。随后蛋白质即可进行浓缩和纯化。开始浓缩复性后的KLRG1四聚体。首先使用孔径为0.22微米的滤器对反应液进行预过滤。然后根据生产商说明书，使用密理博（Millipore）Amicon搅拌式超滤池和标称分子量截留值为10千道尔顿的超滤膜，将1升反应液浓缩至约10毫升。接着，使用密理博10千道尔顿分子量截留的超滤膜进一步浓缩至小于或等于2毫升。根据制造商的说明设置好色谱系统。我们使用 GE Healthcare ACTA 快速蛋白液相色谱系统，在 4 °C 下采用高分辨率柱，通过尺寸排阻色谱法纯化 K lrg 的单体形式，缓冲液为 20 mmol/L HEPES 和 150 mmol/L 氯化钠。上样体积应小于柱子凝胶总体积的2%。再次使用Millipore 10千道尔顿分子量截断的超滤膜，按照制造商说明将样品浓缩至最终体积为1毫升，得到KLG单体。通过之前所述的尺寸排阻色谱法进行纯化，去除游离生物素，从而获得四聚体。将KL LRG1单体与摩尔过量四倍的FICO偶联链霉亲和素四聚体混合，现可用于标记受体配体。该图显示了从左到右通过尺寸排阻色谱分离复性KLRG1蛋白的阳性结果。峰形展示了KLRG1的多聚体、二聚体和单体形式。最右侧的峰代表缓冲液置换。尽管每种蛋白质的复性条件都需要通过实验经验进行优化，但其他C型凝集素受体也应能够使用类似方案形成四聚体，从而有助于发现其他配体。我们刚刚向您展示了在此操作过程中如何制备KLRG1四聚体。务必记住检查诱导水平，并严格遵守复性条件。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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