Name: 脱钙骨组织学，形态计量学和荧光染料分析制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 学习不脱钙骨组织学技术，用于分析骨微结构、矿化成分及细胞组成。本视频演示大样本切片制备、包埋、磨片与染色方法，帮助研究人员克服技术难点并获得高质量骨切片。

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作者谨此感谢 Sue Connell 女士在树脂包埋方面的专业协助，以及 Stephania Tombs 女士在实验室技术方面的专业支持。作者谨向 Frank Kandziora 教授和 Marie-Anne Polboth 博士致以诚挚谢意，感谢他们提供的宝贵建议。

<ol>
 <li>将组织置于含有10%磷酸盐缓冲甲醛溶液的密封容器中3确保尽量减少光照暴露，如果要进行荧光染料分析，因为荧光染料对光敏感。 </li>
 <li>确定组织所需的方向。 </li>
 <li>使用带锯按照正确的方向将标本修剪至所需尺寸，注意遵守安全操作规范。随后将标本放入不透明容器中，容器体积应约为标本体积的十倍，以确保充分固定。标本在福尔马林溶液中固定时间应为一至两周，具体时长根据标本大小而定。建议使用对照组织进行测试和优化。</li>
 <li>检查组织是否能放入包埋模具中，然后将组织置于装有70%乙醇的密封不透明容器内。 </li>
 <li>将组织置于梯度浓度的乙醇中进行处理，避光并持续振荡。
 <ol class="lalpha">
 <li>70 % 乙醇 1 周</li>
 <li>80 % 乙醇 1 周</li>
 <li>90% 乙醇，1 周</li>
 <li>100% 乙醇 1 周</li>
 </ol>
</li> 
 <li>组织随后在正丁醇中透明处理1周，期间需避光并持续振荡。</li>
 <li>树脂与骨的密度应尽可能接近。 树脂的密度可以调整（见步骤8），我们建议先包埋一个测试样本以确保密度合适。我们使用Technovit 7100（Heraeus Kulzer）进行光学显微镜观察和荧光染料分析。如果需要进行免疫组织化学染色，则必须使用其他树脂，例如Technovit 9100（Heraeus Kulzer）。 </li>
 <li>Technovit 7100 制备液可根据需要与试剂盒中提供的软化液少量混合，但软化液的体积不得超过制备液总体积的5%；根据我们的经验，通常很少需要使用软化液。将等体积的无水乙醇与Technovit 7100基础液混合，作为预浸液用于组织处理，避光并持续振荡处理24小时。</li>
 <li>然后使用1克硬化剂I（=1袋）溶于100毫升基础液中配制浸润溶液。该溶液替换预浸溶液，并在持续振荡条件下浸润1周。 </li>
 <li>将组织放入模具中，切面朝下。组织周围应留出一定边缘（理想情况下至少5毫米）以容纳树脂，从而确保包埋块的强度。取15 ml Technovit 7100 配制液与1 ml 固化剂II混合，倒入模具中环绕标本，并完全覆盖标本，覆盖厚度至少5毫米。固化将在2小时内开始，但需过夜方可完全完成。</li>
 <li>然后使用Technovit 3040（Heraeus Kulzer）制备背衬块进行包埋。按2份粉末与1份液体的体积比混合Technovit 3040，得到黏稠液体。将Technovit 3040倒入模块背面的凹槽中，液面至少高出模块底部2 mm。约10分钟后，可剥离模具，包埋块即制备完成。</li>
 <li> 甲基丙烯酸甲酯树脂的密度及其相应的切片性能受室内环境湿度的影响。因此，树脂包埋块应保存在干燥器中。</li>
 <li>磨切法可产生厚度在20–50微米之间的较大切片。该方法适用于荧光染料分析（见下文），因为较厚的切片可产生更强的荧光信号。将金刚石刀片固定至切片机上，并向切片机的储液槽中加入润滑剂（如石油醚）。将组织块固定于夹具中，并调整其相对于刀片的方向。缓慢进行研磨（每张切片约需20–30分钟），确保充分润滑。第一张切片用于暴露切割面并确定切片方向，应予以弃去。</li>
 <li>接下来将切片置于Superfrost Plus载玻片上。由于切片容易卷曲，建议在其上覆盖一小块三明治袋，再用另一张载玻片压紧固定，以保持平整。随后将其放入60–80摄氏度的孵育箱中孵育1小时。此步骤可软化甲基丙烯酸酯，有助于切片平整地贴附于载玻片上。 </li>
 <li>可根据需要使用细粒砂纸以轻柔的方式对切面进行清洁和抛光。</li>
 <li>滑动式切片机可切出用于光学显微镜观察的最佳薄切片。应使用滑动式切片机，因其具有额外的刚性，适合切割此类较硬的包埋块。也可选用电动旋转切片机。使用锋利的不锈钢刀片，建议准备两把刀片，以便在使用其中一把时可对另一把进行磨利。刀片与包埋块之间应呈45度角。如需要，可通过在包埋块表面贴附湿滤纸实现软化处理。可能需要连续切片多次，才能达到理想的切片状态以获得高质量切片。随后将切片漂浮于水浴中，并按上述第16步操作转移至载玻片上。</li>
 <li>染色试剂列于下方材料部分。方案基于Bancroft4 等人。由于组织厚度存在差异，建议先在测试切片上优化染色条件。使用染色架可能导致组织从载玻片上脱落，因此可能需要直接将染色液加至平放的载玻片上。为获得组织形态计量学所需的稳定染色结果，必须采用完全相同的染色方案或使用染色架进行染色。
 <ol class="lalpha">
 <li>苏木精和伊红
 <ol class="lroman">
 <li>苏木精染色5-10分钟</li>
 <li>用Scott的自来水充分清洗</li>
 <li>用伊红染色5分钟</li>
 <li>用自来水冲洗</li>
 <li>二甲苯透明</li>
 <li>安装</li>
 <li>结果 
 <ol>
 <li>类骨质 = 粉红色</li>
 <li>钙化骨 = 紫褐色</li>
 <li>细胞核 = 蓝色</li>
 </ol></li>
 </ol></li>
 <li>Von Kossa
 <ol class="lroman">
 <li>置于硝酸银溶液中，并暴露于强光下，直至矿化骨变黑（约10分钟）</li>
 <li>用蒸馏水洗涤三次</li>
 <li>用硫代硫酸钠处理 5 分钟</li>
 <li>用蒸馏水清洗</li>
 <li>用藏红O复染</li>
 <li>二甲苯透明</li>
 <li>安装</li>
 <li>结果
 <ol>
 <li>矿化骨 = 黑色</li>
 <li>类骨质 = 红色/粉红色</li>
 </ol></li>
 </ol></li>
 <li>马松-戈德纳三色染色法
 <ol class="lroman">
 <li>用碱性酒精洗涤（80%乙醇90毫升与25%氨水10毫升混合，作用20分钟）</li>
 <li>用水冲洗</li>
 <li>用蒸馏水冲洗</li>
 <li>用Weigert苏木精染色10分钟</li>
 <li>用蒸馏水冲洗</li>
 <li>用Ponceau-Fuchsin终染液染色5分钟</li>
 <li>用1%乙酸冲洗15秒</li>
 <li>在磷钼酸-橙G溶液中染色5分钟</li>
 <li>用1%乙酸冲洗15秒</li>
 <li>用亮绿色染色5分钟</li>
 <li>用1%乙酸冲洗，换液3次</li>
 <li>用蒸馏水冲洗</li>
 <li>安装</li>
 <li>结果
 <ol>
 <li>矿化骨 = 绿色</li>
 <li>类骨质 = 红色/橙色</li>
 <li>细胞核 = 蓝灰色</li>
 <li>软骨 = 紫色</li>
 </ol></li>
 </ol></li>
 </ol></li>
 <li>荧光染料制备：</li>
 <li>通过缓慢静脉注射给药，间隔至少两周。</li>
 <li>剂量
 <ol class="lalpha">
 <li>钙黄绿素绿 10 mg/kg 静脉注射</li>
 <li>土霉素 50 mg/kg 静脉注射</li>
 <li>茜素络合酮 30 mg/kg 静脉注射</li>
 </ol></li>
 <li>荧光素绿的制备
 <ol class="lalpha">
 <li>1 克荧光素绿用 1 M NaOH 滴定至溶解。 </li>
 <li>用1% NaOH调节pH至7.1–7.2。</li>
 <li>过滤并避光保存</li>
 </ol></li>
 <li>茜素络合酮的制备
 <ol class="lalpha">
 <li>将3克茜素复合酮用1 M NaOH滴定至溶解。 </li>
 <li>然后用1% HCl或NaOH调节pH至7.1–7.2。</li>
 <li>过滤并避光保存</li>
 </ol>
 </li>
 <li>土霉素的制备
	<ol class="lalpha">
 <li>土霉素是一种现成的抗菌药物，无需配制。</li>
 </ol>
 </li>
 </ol>

<ol><li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerr%2C+J+%22Atlas+of+Functional+Histology%22">Atlas of Functional Histology</a>. , Harcourt Publishing. Melbourne, Australia. 164-168 (2000).</li>
<li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+histomorphometry%3A+standardization+of+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li>
<li>An, Y. H., Martin, K. l <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAn%2C+YH+%22Handbook+of+histology+methods+for+bone+and+cartilage%22">Handbook of histology methods for bone and cartilage</a>. , Humana Press Inc. New Jersey, USA. (2003).</li>
<li>Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingston. Nottingham, United Kingdom. 352-360 (2008).</li>
</ol>

未脱钙骨组织制备用于组织学、组织形态计量学及荧光标记分析

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

未脱钙骨组织学可展示骨的微细结构，同时显示骨的矿化成分和细胞成分，从而提供有关骨转换、骨形成与骨吸收的重要信息。该技术在多种临床和科研应用中具有重要意义，能够获得精美的图像1，并可进行荧光标记分析和骨组织形态计量学等技术2。荧光标记分析是一种在特定时间点注射可与钙结合的荧光染料的技术，从而实现对该时间点矿化程度的定量分析。骨组织形态计量学则是在显微水平上对骨进行定量分析的方法。
进行未脱钙骨组织学研究在技术上具有挑战性，尤其是对于大尺寸标本而言。该技术与常规石蜡包埋组织学方法存在差异。本视频展示了如何制备高质量切片，并演示了其中的技术难点及克服这些困难的方法。标本的制备、固定和处理方式与其他软组织类似，但由于骨组织密度高、通透性低，所需的固定和处理时间显著延长，通常需要数周时间。包埋需使用硬度和密度与骨组织相似或相等的支撑介质，例如甲基丙烯酸甲酯类树脂；但与石蜡浸润和包埋不同，此步骤不可逆。切片可通过研磨方式完成，所得切片较厚，适用于荧光染料分析等研究，最好使用大组织切片机上的金刚石刀具进行。或者，也可使用滑动式切片机配合极锋利的刀片制备更薄的切片，用于光学显微镜观察。滑动式切片机能为大而坚硬的组织块提供所需的额外强度和稳定性。树脂包埋切片可用多种染色剂染色，本视频对此进行了演示。

未脱钙骨组织学为多种临床和科研应用提供了重要信息。该技术操作上具有挑战性，尤其是对于大尺寸标本。本视频展示了制备高质量切片的过程，并演示了其中的技术难点及克服这些困难的方法。

未脱钙骨组织学可展示骨的微细结构，同时显示骨的矿化成分和细胞成分，从而提供……

脱钙骨组织学可展示骨的微细结构，同时显示骨的矿化成分和细胞成分，为骨转换、骨形成与骨吸收提供重要信息。这在多种临床和科研应用中具有重要意义。该技术可获得清晰美观的图像，并可进行荧光评估和组织形态计量等技术分析。进行骨组织脱钙切片在技术上具有挑战性，尤其是对于大尺寸标本。本视频将演示获取骨组织脱钙切片过程中遇到的技术难点及克服这些困难的方法。本视频不涉及对这些切片的组织形态计量学评估。为此，我们向您推荐以下重要文献。本视频将涵盖组织采集后的标本制备与固定处理、包埋、切片（包括磨片和切片）、载玻片制备以及染色等步骤。标本。在此情况下，将绵羊颈椎置于含有10%磷酸盐缓冲液配方溶液的密封不透光容器中。如果需要进行荧光染料分析，则应尽量避免光照。由于荧光染料对光敏感，随后将样本送至实验室并修整至合适尺寸，以提高固定效果，并确保其能够放入包埋块中。此时需要明确组织在载玻片上的方向，以便以正确的平面制备组织块。安全至关重要，操作器械时应确保双手远离刀片。现在将其感兴趣的区域修整至合适大小。随后使用较小的带锯进行最终修整，以减少组织损失。将切至合适大小的组织块放入装有新鲜固定液的密封不透光容器中，以完成固定。容器的容积应约为标本体积的10倍。为了达到充分的固定效果，标本应根据其大小在固定液中浸泡一至两周，随后转移至70%乙醇。由于组织块较大且骨组织渗透性低，溶剂扩散缓慢，因此后续处理需缓慢进行。脱水过程采用梯度递增浓度的乙醇完成，然后使用丁醇进行透明处理。标本需避光保存，并持续震荡。我们建议每种溶液中处理时间约为一周。因此，整个处理过程大约需要四到六周。此过程不应仓促进行，否则会影响切片的最终质量。对于矿化骨组织，有多种包埋方案可供选择。树脂或甲基丙烯酸甲酯的选择取决于待检测的项目。例如，并非所有树脂都适用于免疫组织化学检测。环氧树脂需要紫外线照射才能固化，但这会干扰荧光染料分析。我们建议在仔细选择前查阅制造商的技术规格。我们使用 TEVI 7, 100，因为它适用于光学显微镜和荧光染料分析的切片与磨片制备，且具有较高的性价比。包埋时需要考虑的重要因素是骨组织的密度与包埋介质的密度应尽可能接近。这一点在后续切片过程中尤为重要，特别是进行显微断面切片时。混合液应根据制造商的说明配制，并剧烈振荡。可考虑先包埋少量裸样以优化实验方案。与石蜡包埋不同，此步骤不可逆。将组织块切割面朝下放入模具中。模具应大于组织块，以提供支撑和强度。甲基丙烯酸甲酯渗透应缓慢进行，以确保甲基丙烯酸甲酯充分渗入骨组织。同样，应尽量减少光照暴露。经过一周的渗透溶液处理后，更换新的渗透溶液，并加入硬化溶液。然后制作背板。我们为此使用Tevit 30 40。接着将模具剥离，此时样品块已准备就绪。磨切技术可产生厚度在20至50微米之间的较大切片。由于较厚的切片能产生更强的荧光信号，因此该方法适用于荧光分析。进行磨切需要使用切片机，最好配备金刚石刀片。我们采用0.6毫米弧形金刚石刀片。润滑剂是必不可少的。我们更倾向于使用石油基润滑剂，尽管硅基润滑剂也同样有效。然后将组织块放入夹具中。将其固定在宏端并推动块体靠近刀片。第一个切片暴露了切割面并确定了切片方向，应弃去。研磨是一个缓慢的过程，不应操之过急。研磨切片时应确保充分润滑。然后将其放置在载玻片上。可根据需要进行清洁和抛光。该切片容易卷曲，因此我们建议在其上方覆盖部分三明治袋，并用另一张载玻片压紧固定，使其保持平整。然后将其放入60至80摄氏度的培养箱中孵育一小时。此步骤可软化甲基丙烯酸酯，有助于切片平整地附着在载玻片上。此处显示的是在每月间隔注射的三种不同荧光染料的复合荧光图像。这可以实现对特定时间点矿化位点的识别。这些标记物的剂量和制备方法可在文中找到。micro term 可提供薄切片，最适合光学显微镜观察。这是一个技术上具有挑战性的过程。我们建议使用滑橇式切片机，因为它在切割这些坚硬组织块时能提供更强的切割力。可以使用多种刀片，包括碳化钨刀片。然而，我们推荐使用不锈钢刀片，因为这种刀片可以反复使用，并可根据需要轻松且频繁地进行修整和 sharpen。刀片应调整方向，使其与组织块形成45度角。甲基丙烯酸酯的密度受多种因素影响，包括室内环境湿度。因此，应将组织块保存在干燥的表面上。如有需要，可通过在组织块上覆盖湿滤纸使其软化，可能需要切去数个切片后才能达到理想的切片条件，以获得高质量的切片。再次强调，将三明治袋和额外的载玻片夹紧，以压平切片，然后将其放入孵育箱中。染色方法与常规石蜡包埋组织学相似，只是显然无需包埋石蜡。常用于骨组织的染色方法包括VSA联合番红O复染、单独使用番红O、固绿、以及Masson三色染色法。这些染色方法的具体操作步骤在文中已有引用。使用前需选择并过滤试剂。Golden。该染色剂常用于组织光学检查。我们建议先在测试载玻片上优化染色条件。每一步骤完成后，均可在显微镜下观察切片，以确保染色正确。这有助于确定每种染色成分所需的合适时间。一旦染色方案优化完成，实验中的所有切片均应使用相同的方案，在染色架中同时进行染色，以避免染色差异影响其热力学形态。随后将以标准方式插入盖玻片。祝您的实验顺利成功。

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脱钙骨组织学，形态计量学和荧光染料分析制备

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本方案包含针对钙化血管样本的逐步操作流程：组织处理、脱钙、RNA 验证、钙化水平检测，以及在 Nanostring GeoMx...

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学习不脱钙骨组织学技术，用于分析骨微结构、矿化成分及细胞组成。本视频演示大样本切片制备、包埋、磨片与染色方法，帮助研究人员克服技术难点并获得高质量骨切片。

未脱钙骨组织制备用于组织学、组织形态计量学及荧光标记分析

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