未脱钙骨组织制备用于组织学、组织形态计量学及荧光标记分析

脱钙骨组织学可展示骨的微细结构，同时显示骨的矿化成分和细胞成分，为骨转换、骨形成与骨吸收提供重要信息。这在多种临床和科研应用中具有重要意义。该技术可获得清晰美观的图像，并可进行荧光评估和组织形态计量等技术分析。

进行骨组织脱钙切片在技术上具有挑战性，尤其是对于大尺寸标本。本视频将演示获取骨组织脱钙切片过程中遇到的技术难点及克服这些困难的方法。本视频不涉及对这些切片的组织形态计量学评估。

为此，我们向您推荐以下重要文献。本视频将涵盖组织采集后的标本制备与固定处理、包埋、切片（包括磨片和切片）、载玻片制备以及染色等步骤。标本。

在此情况下，将绵羊颈椎置于含有10%磷酸盐缓冲液配方溶液的密封不透光容器中。如果需要进行荧光染料分析，则应尽量避免光照。由于荧光染料对光敏感，随后将样本送至实验室并修整至合适尺寸，以提高固定效果，并确保其能够放入包埋块中。

此时需要明确组织在载玻片上的方向，以便以正确的平面制备组织块。安全至关重要，操作器械时应确保双手远离刀片。现在将其感兴趣的区域修整至合适大小。

随后使用较小的带锯进行最终修整，以减少组织损失。将切至合适大小的组织块放入装有新鲜固定液的密封不透光容器中，以完成固定。容器的容积应约为标本体积的10倍。

为了达到充分的固定效果，标本应根据其大小在固定液中浸泡一至两周，随后转移至70%乙醇。由于组织块较大且骨组织渗透性低，溶剂扩散缓慢，因此后续处理需缓慢进行。脱水过程采用梯度递增浓度的乙醇完成，然后使用丁醇进行透明处理。标本需避光保存，并持续震荡。

我们建议每种溶液中处理时间约为一周。因此，整个处理过程大约需要四到六周。此过程不应仓促进行，否则会影响切片的最终质量。

对于矿化骨组织，有多种包埋方案可供选择。树脂或甲基丙烯酸甲酯的选择取决于待检测的项目。例如，并非所有树脂都适用于免疫组织化学检测。

环氧树脂需要紫外线照射才能固化，但这会干扰荧光染料分析。我们建议在仔细选择前查阅制造商的技术规格。我们使用 TEVI 7, 100，因为它适用于光学显微镜和荧光染料分析的切片与磨片制备，且具有较高的性价比。

包埋时需要考虑的重要因素是骨组织的密度与包埋介质的密度应尽可能接近。这一点在后续切片过程中尤为重要，特别是进行显微断面切片时。混合液应根据制造商的说明配制，并剧烈振荡。可考虑先包埋少量裸样以优化实验方案。

与石蜡包埋不同，此步骤不可逆。将组织块切割面朝下放入模具中。模具应大于组织块，以提供支撑和强度。

甲基丙烯酸甲酯渗透应缓慢进行，以确保甲基丙烯酸甲酯充分渗入骨组织。同样，应尽量减少光照暴露。经过一周的渗透溶液处理后，更换新的渗透溶液，并加入硬化溶液。

然后制作背板。我们为此使用Tevit 30 40。接着将模具剥离，此时样品块已准备就绪。

磨切技术可产生厚度在20至50微米之间的较大切片。由于较厚的切片能产生更强的荧光信号，因此该方法适用于荧光分析。进行磨切需要使用切片机，最好配备金刚石刀片。我们采用0.6毫米弧形金刚石刀片。

润滑剂是必不可少的。我们更倾向于使用石油基润滑剂，尽管硅基润滑剂也同样有效。然后将组织块放入夹具中。

将其固定在宏端并推动块体靠近刀片。第一个切片暴露了切割面并确定了切片方向，应弃去。

研磨是一个缓慢的过程，不应操之过急。研磨切片时应确保充分润滑。然后将其放置在载玻片上。

可根据需要进行清洁和抛光。该切片容易卷曲，因此我们建议在其上方覆盖部分三明治袋，并用另一张载玻片压紧固定，使其保持平整。

然后将其放入60至80摄氏度的培养箱中孵育一小时。此步骤可软化甲基丙烯酸酯，有助于切片平整地附着在载玻片上。此处显示的是在每月间隔注射的三种不同荧光染料的复合荧光图像。

这可以实现对特定时间点矿化位点的识别。这些标记物的剂量和制备方法可在文中找到。micro term 可提供薄切片，最适合光学显微镜观察。

这是一个技术上具有挑战性的过程。我们建议使用滑橇式切片机，因为它在切割这些坚硬组织块时能提供更强的切割力。可以使用多种刀片，包括碳化钨刀片。

然而，我们推荐使用不锈钢刀片，因为这种刀片可以反复使用，并可根据需要轻松且频繁地进行修整和 sharpen。刀片应调整方向，使其与组织块形成45度角。甲基丙烯酸酯的密度受多种因素影响，包括室内环境湿度。

因此，应将组织块保存在干燥的表面上。如有需要，可通过在组织块上覆盖湿滤纸使其软化，可能需要切去数个切片后才能达到理想的切片条件，以获得高质量的切片。再次强调，将三明治袋和额外的载玻片夹紧，以压平切片，然后将其放入孵育箱中。

染色方法与常规石蜡包埋组织学相似，只是显然无需包埋石蜡。常用于骨组织的染色方法包括VSA联合番红O复染、单独使用番红O、固绿、以及Masson三色染色法。这些染色方法的具体操作步骤在文中已有引用。

使用前需选择并过滤试剂。Golden。该染色剂常用于组织光学检查。我们建议先在测试载玻片上优化染色条件。

每一步骤完成后，均可在显微镜下观察切片，以确保染色正确。这有助于确定每种染色成分所需的合适时间。一旦染色方案优化完成，实验中的所有切片均应使用相同的方案，在染色架中同时进行染色，以避免染色差异影响其热力学形态。

随后将以标准方式插入盖玻片。祝您的实验顺利成功。