Name: 一个可逆的，非侵入性方法，气道阻力测量和支气管肺泡灌洗小鼠流体取样 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学习一种可重复的小鼠口腔插管方法，用于测量气道高反应性和采集气道炎症细胞。该技术通过机械通气、压力传感器监测及生理盐水灌洗，实现呼吸系统生理学的深入研究。

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感谢 W. Mintzer 博士提出进行纤维光学经口插管的建议。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助编号为 U19AI070973、R01AI057696、K02HL75243 和 R01HL082487。

变应原激发试验：
<ol>
	<li>将4至8周龄的C57BL/6小鼠置于密闭的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）麻醉舱内，以3.2%异氟烷与氧气的混合气体进行麻醉，持续10分钟，以达到深度全身麻醉状态。</li>
	<li>每周二、周四和周日通过鼻内途径给予过敏原激发（45 μL OVA（22.5 μg）和7 μL 米曲霉（A. Oryzae）（7 μg），溶于PBS中），共连续给予七次。</li>
</ol>
麻醉：
<ol start="3">
	<li>每次过敏原激发前以及第7次激发后，小鼠需在置于避光容器前接受腹腔注射48 mg/kg依托咪酯（2 mg/ml）。</li>
	<li>将小鼠置于容器内直至对其后肢施加压力时未观察到神经反应（5-10分钟）。</li>
</ol>
插管：
<ol start="5">
	<li>在整个操作过程中，应使用辐射加热灯，保持适当距离以确保动物核心体温维持在约37°C，防止低体温。无论使用何种热源，均应至少在初期使用直肠温度计确认动物体温正常。 关键步骤 实验动物所接触的所有液体和器械均应无菌；操作应在严格的无菌条件下进行。麻醉期间长时间低体温将导致数据异常和/或动物死亡。在对活体动物进行操作前，应先使用尸体动物练习并掌握所有侵入性操作技术。应使用眼科润滑剂防止全身麻醉动物发生角膜擦伤。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠从容器中取出，置于体积描记仪台面上，呈仰卧位（腹侧朝上），台面调整为45°角。</li>
	<li>将环绕台面的橡胶带插入上门齿后方，以固定动物位置。右手持镊子夹住舌头，将其拉出并提起，随后用左手的金属压舌板固定，从而为插管提供畅通的气道。</li>
	<li>将一根直径为0.8 mm的光纤丝连接至光源，经套管针插入，并使其超出尖端10 mm。左手稳定压舌板的同时，右手将光纤丝的发光端经口腔和咽部引导前进，直至观察到声带。然后在直视下，趁声带充分张开时，将光纤丝穿过活动的声门进入气管。</li>
	<li>随后沿光纤丝将套管针推入气管，直至导管尖端位于气管中段。对于17–22克的小鼠，此时导管连接端与下颌最前端之间应有约10 mm的导管段可见。实际插入深度应通过直接观察2–3只相应体型和遗传背景的已插管小鼠的气管来确定。</li>
	<li>移除光纤丝后，通过观察规律而深长的呼吸（胸腹部节律性运动）来确认插管成功；当用拇指封闭连接端时，呼吸应立即停止。若出现呛咳反应（无论是否封闭连接端）、呼吸不规则或其他呼吸困难迹象，提示套管针位置不当，通常为食管插管。 关键步骤 若未能迅速纠正食管插管，可能导致动物死亡。一旦怀疑发生食管插管，应立即拔出导管，待动物恢复规律呼吸后再重新插入。依托咪酯是首选麻醉剂，因为在所有可用的啮齿类动物麻醉剂中，该药物引起的心血管毒性（低血压、心律失常、心脏骤停）最小。</li>
	<li>将体积描记仪台面降至与工作台平行，并将动物旋转180°，使其面向通风机接口。连接呼吸机前，先将动物侧放。</li>
	<li>当建立密闭连接并启动呼吸机（工作参数为150次/分钟，潮气量9 ml/g，100%氧气）后，若观察到胸腹部运动与呼吸机节律同步，则进一步证实插管成功。</li>
</ol>
静脉输液管：
<ol start="13">
	<li>通过熔化分离的方式将一根10 mm、27号针头从其注射器连接端取下，然后使用无菌镊子和止血钳在针头中点处将其弯曲90°，使针尖斜面朝向弯角内侧。将无斜面的一端连接至通向静脉注射端口的PE10导管。</li>
	<li>为防止可能致命的空气栓塞，需使用1 ml注射器将37°C、0.9% NaCl溶液注入导管和针头中进行冲洗排气。注射端口由一根27号针头组成，该针头穿过钻有孔洞的15 ml离心管盖插入，管盖内充满生理盐水，以确保针头末端始终浸没在液面下，从而降低空气被吸入针头并经静脉注射入体内的风险。</li>
	<li>在小鼠仍置于加热灯下的情况下，将针头对准尾部末端，与侧静脉平行并位于其上方。将针头略刺入皮下，沿静脉走向向头侧方向推进，直至到达弯曲处。通过轻微回拉注射器活塞并观察是否有血液回流至静脉导管中，以确认静脉置管成功。此外，向尾静脉内注射50–100 μl生理盐水时，应能顺畅无阻地通过静脉通路。部分小鼠的尾静脉难以稳定插管。在此类情况下，可将小鼠旋转180度至另一侧，通常可顺利建立对侧尾静脉通路。</li>
	<li>从装置上移除加热灯后，将实验动物放入体积描记仪中，并使用4个夹子将其密封，确保系统“气密”。 关键步骤 若继续保留加热灯开启状态，会导致体积描记仪腔内空气受热，进而可能影响后续RRS测量结果。静脉用针头及溶液必须保持无菌。针头的灭菌可通过浸入并用70%乙醇冲洗完成，随后在静脉插入前用无菌生理盐水冲洗并润洗。此外，在静脉穿刺前应使用70%乙醇或异丙醇对尾部进行清洁。</li>
</ol>
气道阻力测量：
<ol start="17">
	<li>气道峰阻力通过在相同肺容积点（潮气量的70%）持续定量计算DPt/V的商值来确定（其中DPt为气管压力的变化，V为气流）。DPt通过连接至气管套管的压强传感器测定。为测定V，将体积描记仪的压力变化在校准后对应于所研究生理范围内的容积变化。由前置放大模块计算得到的体积描记仪容积随时间的变化率即为V。在建立稳定的基线R后RS (&lt;3分钟内5%的变异），连续五次给药（体积= 2 μl/g 按体重注射浓度递增的氯化乙酰胆碱（0.058、0.18、0.59、1.58 和 5.8 mg/kg 体重，溶于 pH 7.4 的 0.9% 生理盐水中，置于冰上保存，每次注射前用手预温），通过静脉在 1 秒内完成注射，每次后续剂量在 R 恢复后给予RS 至基线水平，直至阻力达到基线值的三倍（约12 cm H2O x ml-1 x 秒，即气道阻力较约 4 cm H₂O 的典型基线水平增加 200%2O x ml-1 x 秒）达到。引起 R 增加 200% 的乙酰胆碱（Ach）激发浓度，单位为 mg/g 体重。RS 从基线值（称为PC）200），通过数学插值法对乙酰胆碱-R进行计算RS 剂量-反应曲线</li>
	<li>一旦PC200 数值达到后，松开固定装置并拆卸体积描记仪。最多给予5个递增剂量的乙酰胆碱（Ach）。上述提供的Ach浓度范围适用于达到PC200 大多数幼稚小鼠品系的数值。 关键步骤 当基线达到约4 cm H₂O时2O x ml-1 在电阻监测仪上设定 x 秒，持续 30 秒，a 60 μL 可静脉注射生理盐水以确认是否已达到适当的麻醉深度。在完全麻醉状态下，阻力不会发生显著变化；若阻力增加，或出现肢体或尾巴的运动，则提示存在身体不适，表明需要追加麻醉药物。</li>
	<li>从尾静脉移除静脉导管，然后将动物与呼吸机断开，同时保留气管插管以维持气道通畅。部分动物可能无法立即恢复自主呼吸。在此情况下，可通过轻柔按摩胸壁来促进呼吸。 关键步骤 在转移至恢复室之前，必须建立自主呼吸，否则将导致死亡。</li>
	<li>自主呼吸恢复后，将仍带有气管插管的小鼠转移至充满100% O₂的密闭 chamber 中2 并维持在 37°C 使用加热灯。15-20分钟内，小鼠呼吸有力并开始活动四肢，此时可移除气管导管，并将动物安全转移至常规饲养笼中。 关键步骤 无意识小鼠的气道容易因乙酰胆碱诱导的过度流涎而发生阻塞，这是麻醉小鼠在进行气道生理学测量后发生窒息相关死亡的主要原因。因此，气管插管必须保留在原位，即使未进行支气管肺泡灌洗的小鼠也应如此，直至小鼠恢复知觉，并且应在过度流涎停止后方可拔除。</li>
</ol>
支气管肺泡灌洗：
<ol start="21">
	<li>当小鼠在恢复室中充分恢复其咽反射（约20分钟后）时，收集支气管肺泡灌洗液是安全的。通过轻轻将套管向内和向外滑动来评估咽反射；明显的咳嗽或挣扎表明咽反射已恢复。 关键步骤 恢复时间过长会显著降低单只小鼠的灌洗液回收效率；因此，在建议的20分钟休息期后，必须每隔几分钟监测一次咽反射。如果小鼠因部分苏醒而无法耐受灌洗操作，可使用3.2%异氟烷蒸气麻醉。</li>
	<li>将一根金属气管插管导丝（外径0.5 mm），其前端呈约30°连续弯曲并朝向左肺叶，插入套管中。导丝与套管一起推进至左肺叶，使套管（不包括接头部分）仅比门齿前端多伸出1 mm。 关键步骤 若未能成功隔离左肺，将显著降低回收产量，并增加动物死亡风险。操作时需注意确保导丝尖端不从套管开口端穿出。若金属尖端外露时继续推进套管，可能导致气管撕裂，进而因气管破裂致死。</li>
	<li>保持套管位置固定，取出导丝后，通过1 ml注射器将300 μL PBS（pH 7.4，无菌）注入左肺。随后立即回抽注射器活塞以产生负压，同时用力按摩肺部，并缓慢（3秒）撤出套管。预期可回收100–200 μL的灌洗液。</li>
	<li>灌洗后立即将小鼠放回37°C、100% O2的恢复室中，并持续按摩胸壁。将小鼠置于左侧卧位直至完全恢复（约20分钟），之后将其放回饲养笼中。</li>
</ol>
时间安排：
每只小鼠的整个操作过程不应超过1小时：步骤3-4需5-10分钟；步骤5-21需10分钟；步骤22需20-30分钟；步骤23-24需10分钟。随着操作熟练度的提高，并通过在实验流程中交错处理不同样本，每小时最多可处理3只小鼠。
代表性结果：
由PC值测定的小鼠气道高反应性200 值，是T细胞被激活并募集到肺部以及分泌细胞因子IL-135-7的结果。因此，气道高反应性并非过敏原激发气道后的必然结果，而是依赖于完整的T细胞免疫系统以及在反复暴露于过敏原条件下T细胞应答所需的发育时间。如图2a所示，气道高反应性定义为PC200 与基线值相比显著降低的数值，在经过5次过敏原激发后出现，且在第六次激发后未再出现进一步的显著升高。由于尚未完全明确的原因，气道反应性下降（PC200 在首次过敏原激发后，气道高反应性（AHR）值升高（图2a）。通过比较同一批小鼠的乙酰甲胆碱（Ach）剂量-反应曲线也可观察到类似趋势（图2b）。然而，从图中可以明显看出，完整的气道高反应性在第五次过敏原激发后迅速形成，表现为小鼠在第四次与第六次激发之间对Ach的敏感性增加超过30倍。综上所述，这些结果表明，在经过六次过敏原激发（12天）后获得的AHR测量值最为可靠；而在较早时间点进行的测量可能产生高度可变的数据。经鼻内反复给予溶剂（生理盐水）的小鼠未出现气道高反应性，在所有给予的Ach剂量下，RRS 测量值与基线值相比无显著差异（图3及未显示数据）。
在气道高反应性（AHR）明显出现之前，过敏原诱导的气道中占主导地位的细胞类型是中性粒细胞（图4）。然而，与AHR的变化趋势相似，随着反复的过敏原激发，嗜酸性粒细胞增多逐渐增强，在第六次激发后，嗜酸性粒细胞成为支气管肺泡灌洗液（BAL）中数量占优势的细胞类型，与此同时，中性粒细胞数量显著下降（图4）。巨噬细胞在最初几次过敏原激发后数量增加，随后其丰度出现波动。无论过敏原激发次数如何，淋巴细胞的丰度均未发生显著变化；尽管淋巴细胞在该模型中具有关键作用，但矛盾的是，它们通常是支气管肺泡灌洗液中数量最少的细胞。
在未接受过敏原激发或支气管肺泡灌洗（BAL）取样的小鼠中，气道阻力在17天的实验期间未发生显著变化。在不进行气道生理学检测或过敏原激发的情况下，单独重复进行BAL液取样也显示，仅有中性粒细胞和巨噬细胞向气道的募集增加，且该变化未持续超过5天（数据未显示）。这些结果表明，在接受过敏原激发的小鼠中观察到的显著中性粒细胞增多主要是由操作过程本身引起，而非抗原所致。
在对照组中，经PBS激发的小鼠，其气道阻力随时间变化无明显差异。这些小鼠支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞和中性粒细胞的募集增加，但嗜酸性粒细胞未见增加，与仅接受重复支气管肺泡灌洗液取样的小鼠所观察到的变化相似（图4 b, d）。综上，这些数据强调了变应原在诱导过敏性（嗜酸性粒细胞型）气道炎症和气道高反应性中的关键作用，而非气道操作本身的影响。
使用与本研究中所用蛋白酶类似的鼻内过敏原，也可获得相似的结果。然而，许多研究者采用卵清蛋白来诱导过敏性肺部疾病。在使用铝盐沉淀的卵清蛋白进行适当的皮内或腹腔初次致敏（1-2周）后，单次鼻内给予可溶性卵清蛋白，24小时内即可观察到明显的哮喘表型，包括气道高反应性。
<img src="/files/ftp_upload/1720/1720fig1.jpg" alt="用于呼吸测量的小鼠体积描记室示意图，包含静脉输液管路和夹具。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 啮齿类动物体积描记仪在进行气道生理学测量前的实景图。
<img src="/files/ftp_upload/1720/1720fig2.jpg" alt="不同通道中呼吸系统阻力（R&lt;sub&gt;RS&lt;/sub&gt;）与乙酰胆碱剂量的关系图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 气道阻力测量结果。A) 为统计分析目的，报告的是antilog PC200值。注意首次激发后antilog PC200显著升高，随后在多次激发后逐渐下降。B) 呼吸系统阻力（RRS）：注意第六次和第七次激发后乙酰胆碱-RRS剂量-反应曲线斜率明显增加。误差线表示标准误（SEM）。
<img src="/files/ftp_upload/1720/1720fig3.jpg" alt="显示阻力变化的剂量-反应研究曲线；随时间变化的剂量1-5；呼吸分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 来自未经处理的小鼠（A）和经6次过敏原激发的小鼠（B）在连续静脉注射乙酰甲胆碱（Ach）后，实时呼吸系统阻力（RRS）的代表性记录。剂量值以mg/kg为单位表示。
<img src="/files/ftp_upload/1720/1720fig4.jpg" alt="显示支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞类别的细胞丰度及总细胞数的柱状图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 图 4. 经连续7次鼻内激发处理的小鼠左肺支气管肺泡灌洗液样本中不同免疫细胞计数。经过敏原（A）或磷酸盐缓冲液（PBS）（B）处理小鼠的免疫细胞百分比（%）丰度。经过敏原（C）或PBS（D）处理小鼠的免疫细胞总数。数据以均值 ± 标准误表示。

<ol><li>Hamelmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+measurement+of+airway+responsiveness+in+allergic+mice+using+barometric+plethysmography%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156, 766-775 (1997).</li>
<li>Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestrained+plethysmography+is+an+unreliable+measure+of+airway+responsiveness+in+BALB%2Fc+and+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice.</a> J. Appl. Physiol. 97, 286-292 (2004).</li>
<li>Bates, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+and+misuse+of+penh+in+animal+models+of+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The use and misuse of penh in animal models of lung disease.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 373-374 (2004).</li>
<li>Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reevaluation+of+the+validity+of+unrestrained+plethysmography+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice.</a> J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).</li>
<li>Grunig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+IL-13+independently+of+IL-4+in+experimental+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma.</a> Science. 282, 2261-2263 (1998).</li>
<li>Corry, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+allergen-induced+airway+hyperreactivity+in+T+and+B+cell-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Requirements for allergen-induced airway hyperreactivity in T and B cell-deficient mice.</a> Mol. Med. 4, 344-355 (1998).</li>
<li>Corry, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4%2C+but+not+interleukin+5+or+eosinophils%2C+is+required+in+a+murine+model+of+acute+airway+hyperreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4, but not interleukin 5 or eosinophils, is required in a murine model of acute airway hyperreactivity.</a> J. Exp. Med. 183, 109-117 (1996).</li>
<li>Amdur, M. O., Mead, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+respiration+in+unanesthetized+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanics of respiration in unanesthetized guinea pigs.</a> Am J Physiol. 192, 364-368 (1958).</li>
</ol>

哮喘及各种其他气道阻塞性疾病的研究构成了生物医学研究中一个活跃且不断扩展的领域。与哮喘相关的实验研究中一个重要组成部分是能够在不同条件下测量气道大小变化的能力。在激发性刺激下出现过度的气道狭窄，是哮喘及相关肺部疾病的典型特征，这一气道特性被称为气道高反应性，也是临床上显著发作的主要组成部分，可导致呼吸困难及其他症状，甚至死亡。
在本研究中，我们建立了一种新方法，用于测量小鼠气道高反应性，同时采集募集至气道的炎症细胞。结果显示，在15天内连续给予7次变应原激发的过程中，气道高反应性并不会在首次激发后立即出现，甚至在最初的数次激发后仍未明显产生。相反，气道高反应性仅随着变应原激发次数的增加而逐渐增强，直至第6次激发（即第12天）后，才相对于假性激发动物出现高度显著的升高。这种明显的气道生理改变大致与肺部炎症细胞的浸润程度平行，其中最显著的特征是嗜酸性粒细胞的大量出现，这些细胞在气道灌洗液中首次大量检出的时间点也大致与此相符&gt;106在第5次过敏原激发后（/ml）。
这些发现与先前的研究结果一致，即...

<table><tbody><tr><td>气道生理学测量软件（Rescomp）</td><td>Millenium Premier Group; 415-519-4371</td><td></td><td>定制制备</td></tr><tr><td>配备Pentium III CPU、运行Windows XP的PC工作站</td><td>Intel</td><td></td><td>数据分析</td></tr><tr><td>17针模拟-数字信号转换器</td><td>National Instruments</td><td>PC-LPM16)</td><td></td></tr><tr><td>外径0.5 mm、连接光源的光纤丝</td><td>Cole-Parmer</td><td>41722系列</td><td></td></tr><tr><td>呼吸机</td><td>Harvard Apparatus</td><td>687</td><td></td></tr><tr><td>10 mm、27号针头</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>加热灯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>4个弹簧夹</td><td>Pony</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>用于插管引导的0.5 mm外径金属丝</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost/plus显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Shandon滤纸卡</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>5991022</td><td></td></tr><tr><td>差异细胞染色片试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>122911</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 3</td><td>Shandon, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20号、1.25英寸ProtectIV静脉导管</td><td>Smiths Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm聚合物光纤</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT02-532</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">小型动物气道生理学工作站，由Millenium Premier Group使用以下组件定制组装：</td></tr><tr><td>商用压力传感器</td><td>Buxco Research Systems</td><td>TRD5700</td><td></td></tr><tr><td>商用压力传感器</td><td>Buxco Research Systems</td><td>TRD4510</td><td></td></tr><tr><td>前置放大模块</td><td>Buxco Research Systems</td><td>MAX2270</td><td></td></tr><tr><td>机箱</td><td>Buxco Research Systems</td><td>MAX1320</td><td></td></tr><tr><td>定制的小型动物体积描记仪</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种可逆、非侵入性的小鼠气道阻力测量与支气管肺泡灌洗液采集方法

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

气道高反应性（AHR）测量与支气管肺泡灌洗（BAL）液采集对于实验性哮喘模型至关重要，但在同一动物体内重复进行这些操作通常难以实现。本文展示了在小鼠中重复获取AHR测量值及支气管肺泡灌洗液样本的实验方案。小鼠在14天内通过鼻内途径接受七次强致敏原激发或假处理。在首次激发前以及每次鼻内激发后的24小时内，对同一动物实施麻醉、经口插管并进行机械通气。通过比较假处理组与致敏原激发组小鼠在静脉注射递增剂量的乙酰胆碱（Ach）氯化物后呼吸系统阻力（RRS）的剂量反应曲线，评估AHR。随后，通过同一插管途径对左肺进行灌洗，以完成气道细胞的分类计数。研究表明，在同一动物体内可重复进行AHR测量和BAL液采集，且气道高反应性及气道嗜酸性粒细胞增多在开始致敏原激发后7–10天内达到峰值。该新型技术显著减少了纵向实验所需的动物数量，且适用于多种啮齿类动物、疾病模型及气道生理学检测仪器。

重复测量啮齿类动物呼吸生理参数并采集气道炎症细胞是理想的研究手段，但通常难以实现。本文介绍一种可重复的小鼠经口插管方法，该方法允许对气道高反应性进行多次测量，并可重复采集气道炎症细胞。

气道高反应性（AHR）测量和支气管肺泡灌洗（BAL）液采集是实验性哮喘模型中的关键步骤，但反复...

开始此操作前，需通过腹腔注射番茄碱对动物进行麻醉。随后将动物置于操作台上，并经口插入20号导管至气管。气管插管后的小鼠连接机械通气机，并在尾静脉建立静脉通路。随后将小鼠置于连接两个压力传感器的啮齿类动物SIGGRAPH装置中。该电子系统能够在乙酰胆碱激发过程中持续测量呼吸系统阻力。在断开呼吸机和静脉导管后，将气管导管插入左肺，并通过该导管注入并回抽生理盐水进行灌洗。您好，我是来自贝勒医学院医学系的Simone Phar。今天我们将向您展示如何对小鼠进行经口插管，以便反复采集气道力学数据和支气管肺泡灌洗液。我们利用这一操作来研究实验性过敏性疾病，即哮喘的实验模型，该操作也可根据需要调整用于其他应用。那么我们开始吧。首先，通过腹腔注射每千克48毫克的ate，使小鼠深度麻醉。然后将小鼠放入一个柔和光照的箱体中，以保持其安静。可用于此目的的清洁小鼠笼具应覆盖布单。五到十分钟之后，通过脚趾夹捏确认动物已完全麻醉，然后将其置于仰卧位，腹部朝上，放在调整为45度角的小桌上。为固定实验动物，将一根橡胶带环绕桌子后方并卡入上排牙齿后方。应使用加热灯，用右手保持小鼠温暖。用镊子夹住舌头，将其从口中拉出并抬起。然后用左手轻轻插入金属压舌板。这将有助于保持气道通畅，并便于观察声带以进行插管。接下来，将一根直径为0.8毫米、连接光源的光纤丝通过血管造影导管插入，并使其超出导管尖端10毫米。用左手固定 depressor 的同时，用右手引导光纤丝的发光端穿过口腔和咽部，直至观察到声带。然后在直视下观察，并在声带完全张开时，将线穿过活动的声带并进入气管。接着将血管导管沿光纤导丝送入气管，直至导管尖端位于气管中段。对于17至22克的小鼠，此时应有10毫米长的导管段留在口腔外。移除光纤线以确认插管成功。观察到规律的深呼吸，并在用拇指阻塞连接器后呼吸立即终止。降低体积描记仪台面，直至其与工作台面平行，然后将受试对象旋转180度，使其面向通风口。将动物侧卧，再连接呼吸机。确保气密性连接后启动呼吸机。后续观察到腹部起伏与呼吸机节律同步时，可进一步确认插管成功。为静脉输液管路准备针头时，从注射器连接器上取下一段10毫米长的27号针头，并在其中点处弯曲90度，使斜面朝向弯角内侧。将无斜面的一端连接至通向静脉注射端口的PE-10导管。以防止可能发生致命的空气栓塞。使用1 mL注射器通过37摄氏度的0.9%氯化钠溶液冲洗管路和针头。注射端口由一根27号针头穿过15 mL离心管管盖上的钻孔构成。管盖内充满生理盐水，使针头末端始终浸没在液面下，从而降低针头内混入空气并静脉注射的风险。将针头对准尾部的尾端极端位置，与侧静脉平行并位于其上方。在推进针头时，使其略微位于皮肤下方。沿静脉方向将导管在皮下推进至弯曲处。为确认静脉输液导管放置成功，轻轻回抽注射器活塞，应可见血液回流至输液管中。此外，在向尾静脉注射 50 至 100 微升生理盐水时，静脉输液管路应保持通畅无阻。移除实验装置中的加热灯后，将受试动物放入容积描记仪（plasmo graph）中，并使用四个夹子将其密封固定，确保密闭性。移除加热灯至关重要，可防止加热容积描记仪腔室内的空气，从而避免对后续呼吸系统阻力（RRS）的测量结果造成影响。呼吸系统阻力（RRS）通过持续定量计算压力与流量的商值得出。在肺容积相等的点，气道压随气流的变化，即 delta P 与 V 的比值。Delta P 通过连接至气管血管导管 V 的压力换能器测定。血浆移植物体积对时间的微分由前置放大模块计算。在建立稳定基线后，RRS 经静脉在 1 秒内依次注射五剂浓度递增的氯化乙酰胆碱或 CH。每次后续给药均在呼吸系统阻力（RRS）恢复至基线水平后进行，直至气道阻力增加200%为止。从尾静脉移除静脉插管，并将小鼠与呼吸机断开。保持气管插管原位以维持气道通畅，确保小鼠恢复自主呼吸。如果未恢复呼吸，可通过轻柔按摩胸部来促进呼吸。一旦小鼠恢复自主呼吸，应将其连同气管插管一起转移至充满100%氧气的密闭舱内，并使用加热灯维持舱内温度为37摄氏度。在动物苏醒前，必须保持气管插管在位，以防止因乙酰胆碱诱导的过度流涎导致的窒息性死亡。支气管肺泡灌洗液（BAL 液）仅可在小鼠充分恢复咽反射后采集，通常在放回复苏箱约 20 分钟后发生。为评估咽反射，可轻轻将血管导管向内和向外滑动，若小鼠出现明显咳嗽或挣扎，则表明咽反射已恢复，此时可采集 BAL 液。将一根金属气管插管导丝插入血管导管中，该导丝具有约 30 度的连续弯曲，方向朝向左肺叶。将G型导丝与血管导管一同推进至左肺叶，使导管接头端仅超出门齿1毫米。确保G型导丝尖端不从血管导管的开口端穿出。为避免在固定血管导管时造成气管撕裂或破裂，需立即通过1毫升注射器向左肺注入300 µL pH 7.4的无菌PBS，同时回抽注射器活塞。为产生负压，在移除血管导管时需缓慢操作并用力按摩肺部。预计支气管肺泡灌洗液回收量为 100 至 200 微升。立即将灌洗小鼠放回 37 摄氏度、100% 氧气的培养箱中。将动物置于其左侧，直至约20分钟后完全恢复，然后将其放回笼中。我们在此展示气道阻力测量的代表性结果，气道高反应性定义为：在第四次乙酰胆碱剂量时，经五次过敏原激发后测得的RRS值显著高于未致敏对照值；然而，在第六次激发后观察到更显著的气道高反应性，且反应性未再进一步增加。在第七次激发时，由于阻力（RRS）值已从基线值增加至三倍，停止了 a CH 的给药；否则剂量进一步增加将导致致命性支气管痉挛。经鼻内给予载体的小鼠未出现气道高反应性，且在给予任何剂量 a CH 后，其 RRS 测量值与基线值相比均无显著差异，这一点可通过来自未经处理小鼠及经六次过敏原激发后小鼠的代表性实时 RRS 曲线得到证实，后者在出现明显气道高反应性（A HR）前连续接受了静脉注射 a CH。过敏原诱导的气道中占主导的细胞类型为中性粒细胞，这与 a HR 的趋势相似。然而，随着反复的过敏原激发，嗜酸性粒细胞增多逐渐增强，并在支气管肺泡灌洗液（BAL）中成为数量上占优势的细胞类型，这一变化发生在第六次激发后，同时伴随中性粒细胞数量的显著下降。在对照PBS攻击的小鼠中，气道阻力的测量值随时间推移也未发生显著变化。这些小鼠支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞和中性粒细胞的募集增加，但嗜酸性粒细胞未增加，该变化模式与仅接受重复支气管肺泡灌洗液取样的小鼠中观察到的变化相似。我们刚刚向您展示了如何可逆性地经口对小鼠进行气管插管，并建立静脉通路以采集气道生理数据和支气管肺泡灌洗液。在对活体动物实施这些技术之前，必须先在死亡动物上分别练习并熟练掌握每一项技术。严格而轻柔的操作至关重要，且必须始终严格执行无菌技术。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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