Name: 内淋巴管闭塞手术诱导的内淋巴积水 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-22T16:52:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 学习豚鼠内淋巴管闭塞手术技术，建立内淋巴积水动物模型用于研究梅尼埃病相关耳科病理。该方法通过阻断内淋巴管导致蜗管扩张和波动性听力损失，为耳科疾病机制研究提供重要实验基础。

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本工作部分得到了美国耳科学会向 CAM 提供的资助，以及凯斯医疗中心大学医院向 KNA 和 CAM 提供的资助。我们感谢位于俄亥俄州欣克利的 Focus Medical Group, Inc. 的 Jeff Churney 为我们提供了显微镜相机。视频制作服务由佐治亚州瓦尔多斯塔的 Fusion Creative Marketing, Inc. 慷慨提供。我们感谢克利夫兰凯斯西储大学的 Jonathan Frankel 和 Alex Levitt 在视频准备过程中提出的宝贵意见。

第1部分：麻醉与手术准备
<ol>
 <li>一只成年雌性Duncan-Hartley豚鼠（购自查尔斯河国际实验室公司，Wilmington，MA）通过肌内注射给予氯胺酮60 mg/kg和赛拉嗪12 mg/kg进行麻醉。</li>
 <li>在动物眼睛上涂抹石油润滑剂，以防止因干燥导致的角膜损伤。</li>
 <li>从头顶到肩部以及两耳之间区域进行剃毛。</li>
 <li>剃毛区域先以7.5%聚维酮碘进行无菌准备，随后使用70%乙醇。</li>
 <li>将动物置于带有加热毯的手术台上，并放置于一个可抬高头部并屈曲颈部的平台。动物头部应背向外科医生。为充分暴露枕骨嵴，必须实现足够的颈部屈曲。</li>
 <li>以无菌方式覆盖动物。</li>
</ol>
第二部分：骨性枕部的切口与暴露
<ol>
 <li>沿预期切口部位（枕部背侧中线皮肤切口）应用含肾上腺素的布比卡因（Marcaine）0.25%。该处理可引起局部血管收缩，减少出血，并在动物苏醒后提供持久的术后镇痛效果。</li>
 <li>在头皮枕部沿背侧中线做皮肤切口。 <img src="/files/ftp_upload/1728/1728fig1.jpg" alt="大鼠手术操作研究与解剖学研究的中线切口位置示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1：皮肤切口沿背侧中线进行，如上图所示。</li>
 <li>为获得充分暴露，使用小型弯止血钳分别夹住切口两侧，将皮肤向侧方牵开。</li>
 <li>沿颈部肌肉做水平切口以暴露骨性枕骨。此阶段即使麻醉充分，动物仍可能因枕大神经被切断而出现抽搐。在枕下区域做水平切口时存在脊髓横断的风险。可通过确保手术刀片下方始终能触及深层骨组织来避免此类并发症。</li>
 <li>当枕下肌群被切开至骨面后，使用第三把止血钳牵开上方肌肉边缘。该止血钳由手术助手固定维持位置。</li>
 <li>使用Lempert骨膜剥离器暴露颞枕缝。</li>
</ol>
 第3部分：钻开颞枕缝
 <ol>
 <li>暴露颞枕缝后（图2），使用带有1.5 mm金刚砂钻头的耳科钻头，沿缝向下方外侧钻磨。</li>
 <li>在颅骨外板下方，将可见到板障（位于颅骨内外板之间的松质骨）的海绵状结构。当板障骨质被完全磨除后，颅骨内板随之显露，同时可见淡蓝色的乙状窦影。</li>
 <li>明确乙状窦的边界，但不穿透该血管。</li>
 <li>当覆盖乙状窦的骨质已充分磨薄后，改用更高倍显微镜放大，并用直头钩针小心去除覆盖乙状窦的残余骨质。</li>
 </ol>
 <img src="/files/ftp_upload/1728/1728fig2.jpg" alt="颞枕缝位置，钻孔区域已标记，骨性解剖学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2 待钻孔区域部分覆盖于颞枕缝之上。
 第4部分：导管阻塞
 <ol>
 <li>将游离的乙状窦向内侧牵拉，以暴露其覆盖的鼓室盖。 </li>
 <li>使用0.5 mm金刚砂钻头在耳盖内侧钻孔，进入内淋巴囊和内淋巴管。 </li>
 <li>然后使用直头探针将骨蜡填塞至内淋巴管中。 </li>
 <li>随后使用明胶海绵（Gelfoam，辉瑞公司，纽约，纽约州）加强颅骨缺损部位。 </li>
 <li>使用4-0 POLYSORB（United States Surgical，Norwalk，CT）缝线将肌肉组织对合。随后无缝过渡至皮下缝合技术以关闭皮肤切口。此种缝合方式无需术后拆线，亦可避免动物抓挠手术部位导致缝线被扯出的风险。</li>
 </ol>
 第5部分：术后护理
 将豚鼠放入孵育箱中以维持其体温，并每30分钟检查一次，直至其苏醒并能够维持胸卧位。检查动物的呼吸频率和体色。本中心分别使用恩诺沙星（0.2 mL，22.7 mg/mL，皮下注射）和布托啡诺（0.05 mL，0.3 mg/mL，皮下注射）进行术后感染预防和镇痛。镇痛药在手术当天给药一次，在术后第一天和第二天各给药两次。尽管无菌手术无需使用抗生素，但可在术后第三天开始给予为期五天、每日两次的预防性抗生素治疗，其中术后第三天给药一次。
 并发症及处理
 <ol>
 <li>呼吸抑制：术者应始终注意动物的呼吸情况。若呼吸变慢或停止，应立即暂停手术，并目视检查胸廓是否有运动。若动物出现呼吸困难或费力呼吸，需检查口腔和气道是否被阻塞。</li>
 <li>乙状窦穿通：使用明胶海绵（Gelfoam）加压并结合吸引器头直至出血停止。</li>
 <li>硬脑膜穿通：用明胶海绵（Gelfoam）覆盖缺损处。</li>
 <li>前庭损伤：钻孔位置不得超出乙状窦外侧1 mm。否则可能损伤后半规管，导致豚鼠实验数据无效。</li>
 </ol>

<ol><li>Andrews, J. C., Bohmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+approach+to+the+endolymphatic+sac+and+the+cochlear+aqueduct+in+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">The surgical approach to the endolymphatic sac and the cochlear aqueduct in the guinea pig.</a> Am J Otolaryngol. 10, 61-66 (1989).</li>
<li>Kimura, R., Schuknecht, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranous+hydrops+in+the+inner+ear+of+the+guinea+pig+after+obliteration+of+the+endolymphatic+sac%5BTitle%5D)+AND+%22Pract+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Membranous hydrops in the inner ear of the guinea pig after obliteration of the endolymphatic sac.</a> Pract Otolaryngol. , (1965).</li>
</ol>

动物实验严格按照凯斯西储大学机构动物护理和使用委员会制定的指南和规定进行。

在内淋巴管手术阻塞后的数周内，实验动物会出现波动性感音神经性听力损失，通过听觉诱发电位脑干反应进行评估。图3展示了一次听觉脑干反应（ABR）记录的示例。左耳作为未手术的对照耳。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1728/1728fig4.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1728/1728fig3tmb.jpg" alt="听觉信号分析，对照耳与手术耳波形比较图，听力研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"></a> 图3： 一只豚鼠术后28周在16 kHz频率下的ABR听阈水平。左耳（未手术耳）的听阈为30 dB SPL，右耳（手术耳）的听阈接近70 dB。
耳蜗的组织学检查还显示Reissner膜扩张（图4）。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1728/1728fig4.jpg"><img ...

通过闭塞内淋巴管手术诱导内淋巴积水

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

通过闭塞和阻断豚鼠的内淋巴管来手术诱导内淋巴积水（ELH），是一种被广泛接受的该病症动物模型，也是人类梅尼埃病的重要相关模型。1965年，Robert Kimura 和 Harold Schuknecht 首次描述了一种用于阻断内淋巴管的硬膜内入路方法（Kimura 1965）。尽管该方法有效，但由于需要穿透脑部保护膜，导致实验动物出现较高水平的并发症和死亡率，因而存在明显缺陷。因此，Andrews 和 Bohmer 开发了一种硬膜外入路方法，可显著减少与中枢神经系统（CNS）穿透相关的并发症发生率（Andrews and Bohmer 1989）。
此处所述的硬膜外入路首先需要在枕部区域做一正中切口，以暴露其下方的肌肉层。我们仅在右侧进行操作。在适当牵开覆盖的组织后，于右侧枕部肌肉层做一横向切口，以暴露右侧颞枕缝线。随后使用耳科钻头在缝线下方偏外侧的骨质区域（图1）进行钻孔，直至乙状窦显露。将乙状窦向内侧牵开后，即可暴露容纳内淋巴囊的内淋巴管骨盖。在骨盖内侧进一步向内淋巴囊区域钻孔，即可显露内淋巴管，随后用骨蜡填塞该管以造成阻塞，最终形成内淋巴积水（ELH）。
在接下来的几周内，该动物将表现出进行性、波动性的听力下降以及内淋巴积水的组织学证据。

本视频展示了如何通过手术阻塞豚鼠的内淋巴管以产生内淋巴积水。

通过阻塞和闭塞耳蜗管在豚鼠中手术诱导淋巴囊积水（ELH）是一种被广泛接受的动物模型……

大家好，我叫 Chris Edden。我是凯斯西储大学耳鼻喉头颈外科的一名研究人员。今天我将介绍在豚鼠中进行内淋巴管手术阻断的方法，该操作可导致内淋巴积水，用于模拟多种与耳部疾病相关的病理状况。淋巴囊积水是指耳蜗内淋巴腔室的肿胀，是梅尼埃病的关键组织学标志。在此图中，您可以看到一个正常耳蜗的横截面，其中包含两个外淋巴腔室——前庭阶和鼓阶，以及一个未扩张的中阶，中阶与内淋巴管相延续。在手术后数周内，我们所关注的这一结构——中阶会如图所示发生扩张，前庭膜也会随之膨胀。此外，实验动物手术耳还会出现进行性波动性听力下降。与许多空气相关疾病一样，自1965年Robert Kor和Harold Schneck首次描述以来，通过手术在豚鼠体内诱导积水已成为人类梅尼埃病的金标准动物模型。尽管该手术最初采用更具侵入性的硬膜内入路进行，但我们中心更倾向于使用硬膜外入路，因为这种方法可显著降低动物的发病率和死亡率。以下是成功且人道地实施这一较为复杂手术所必需的材料、动物护理及外科操作方法的详细说明。首先，我将介绍所需的手术材料。实验动物为成年雌性白色豚鼠，品系为邓肯·哈特利（Duncan Hartley），购自查尔斯河国际实验室公司（Charles River International Laboratories Incorporated）。进行手术室准备和无菌设置时，需要无菌手术服、带有无菌罩的手术显微镜和Mars设备、小型带孔洞巾、术中加热垫以及吸引装置。一个5号吸引器、一个40号吸引器、无菌生理盐水、不锈钢托盘和头架。麻醉用药需要术前使用每千克体重60毫克的氯胺酮和每千克体重12毫克的赛拉嗪。术中需要0.25%的标记溶液0.6毫升、11号一次性安全手术刀片、三个弯止血钳、利尔骨膜剥离器、WEX细胞外科尖刀和耳科钻，以及1.5毫米和0.5毫米的金刚砂钻头。此外，还需要石蜡基润滑剂、电动剃须刀、聚维酮碘和70%乙醇。直型骨刮匙、10 ml 注射器、骨蜡、明胶海绵、4-0 可吸收缝线配 P-13 圆针，持针钳、带齿镊、钻石纹钳口持针器及缝线剪。术后护理需准备带加热垫的清洁笼具，以及每毫升含 22.7 毫克的氧氟沙星溶液 0.2 毫升。0.05 毫升浓度为 0.3 毫克/毫升的布托啡诺。首先通过肌肉注射给予豚鼠每千克体重 60 毫克的氯胺酮和每千克体重 12 毫克的赛拉嗪进行麻醉。该麻醉方案可维持 60 至 90 分钟的麻醉效果，且通常不会引起呼吸抑制，这通常足以完成本操作。麻醉动物后，将石油基润滑剂涂抹于眼睛。接着，使用电推剪从上胸部至头顶剃除头部后方的毛发。然后用聚维酮碘对部位进行消毒，再用酒精擦拭。现在动物已准备好进行手术。我叫Dr.Cliff McGillion，是克利夫兰凯斯西储大学医院耳鼻喉—头颈外科的教授，同时也是耳科和神经耳科的主任。我今天要向您介绍的是在豚鼠中诱导内淋巴囊积水的手术技术。我们采用口腔外入路，暴露乙状窦，并在乙状窦的前方及外侧位置，找到内淋巴系统的O环结构，切除导管组织和囊壁组织，并在直视下将导管钻除。我认为该操作中最关键的部分是游离乙状窦，然后在其内侧进一步暴露并直接观察内淋巴管的O形弯曲。一旦手术区域准备就绪，即将动物转移至手术室，并固定于头架上。颈部屈曲，以充分暴露枕骨嵴，并以无菌方式铺巾，以确保动物的健康与安全。观察在手术过程中为维持适当的体温而对人类患者所需采用的相同无菌技术，务必在第一次切口前将加热垫放置于手术表面下方。在手术部位周围注射标记物。手术操作始于颅骨中线背侧皮肤切口，沿枕部进行，以获得充分暴露；通过在切口两侧各放置一把止血钳来牵开皮肤。由于豚鼠具有较强的止血机制，无需使用电灼设备。接下来，沿颈部肌肉做一横向切口。为暴露骨性枕部，位置恰当的切口可立即显露出颞枕缝线，如此处所示。横断通常位于肌肉下方的枕大神经可能会引起动物抽搐。尽管在切开肌肉时已实施充分的麻醉，但仍需感觉到刀片下方的骨骼。若未感觉到，切口可能过低，从而在切开颈部肌肉后存在脊髓横断的风险。使用第三把止血钳夹住切口的上方部分，并由手术助手固定在位。采用钝性分离法暴露枕骨。操作时始终注意保持在枕外隆嵴的右侧，左侧耳作为对照。在此模型中，随后使用Lumper骨膜剥离器进一步暴露颅骨，显露枕外隆嵴及枕颞缝线。钻孔操作使用直径1.5毫米的金刚砂钻头，从缝线下方稍偏下位置开始。目标是暴露后颅窝和乙状窦。所有磨骨操作必须始终在颞枕缝线处或其下方进行。使用5号吸引管及时吸除血液。同时让助手使用无菌生理盐水持续冲洗术区，生理盐水可从10 cc注射器中持续滴入。钻孔会导致骨髓出血，但可使用金刚砂钻头在约1毫米的深度处止血。将可见一条微弱的蓝色线条。这是乙状窦。就站在这里。位于乙状窦外侧。可找到内淋巴管的壶腹部。在不穿透乙状窦的前提下，明确其边缘至关重要。当上层骨质已变得足够薄时，即停止钻孔，并将吸引器更换为40号。同时使用更高的放大倍数。用直头探针轻柔地去除上层骨质。轻柔地向内侧牵拉乙状窦，以显露其内侧的骨岬，但骨岬可能因血液遮挡而无法明显可见。现在，将已去骨化的乙状窦轻柔地向内侧牵拉，从而显露骨岬。使用较小的0.5切割钻头磨开骨沟，破坏内淋巴囊，最终暴露内淋巴管。导管在周围骨组织的白色背景中呈现为一个深色的椭圆形。在用骨蜡填塞导管前，需先钻开约一毫米。使用明胶海绵将骨蜡推入导管内。这种内淋巴管的阻塞将诱导内淋巴积水。使用4.0聚羟基乙酸可吸收缝线将肌肉层缝合。随后无缝过渡至皮下缝合技术以关闭皮肤切口。采用此种缝合方式，术后无需拆除缝线，且可避免动物抓挠手术部位或将缝线或缝钉拉出的风险。术后，将豚鼠放入孵育箱中以维持体温，并每30分钟检查一次直至其苏醒。观察动物的呼吸频率和体色。该中心使用广谱抗生素in-in和布托啡诺来处理疼痛并发症。与任何手术一样，受试对象存在一定的风险。接下来我将介绍一些可能发生的术中并发症及其预防方法。呼吸抑制：外科医生应始终注意动物的呼吸情况，若出现呼吸停止或减慢，需及时处理。停止手术，目视检查胸廓是否有运动。若动物出现呼吸暂停，需检查口腔和气道是否被阻塞。乙状窦穿通时，使用明胶海绵和压迫止血，并配合吸引器头直至出血停止。使用明胶海绵覆盖硬脑膜穿透处时，前庭损伤区域不得在乙状窦外侧钻孔超过一毫米，否则可能损伤后半规管，导致该只豚鼠的所有实验数据无效。在豚鼠中手术阻断内淋巴管是一项技术要求较高的操作，但借助适当的工具、指导以及对相关解剖结构的充分了解，该手术可被成功实施，既符合动物伦理要求，也可作为人类梅尼埃病的有效研究模型。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

内淋巴管闭塞手术诱导的内淋巴积水

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