Name: 氧成像在生物系统中的磷光纳米探针的合成和校准 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学习基于铂钯卟啉树状纳米传感器合成磷光氧探针的方法，用于生物系统氧成像。本方案涵盖探针构建、校准流程及其在生物氧测量中的应用价值。

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特此感谢美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 EB007279 和 HL081273 的支持。

1. 氧气测量方案的一般描述
（本部分无需实际操作，但对理解论文其余部分至关重要。可以将其拍摄成一系列幻灯片，例如几页Power Point，并配以解说声音。）
1.1）将探针递送至目标介质中，例如注射到动物的血液或组织间液中。
1.2) 用适当波长的光照射样品（组织表面），以促使探针进入激发三重态。通常激发发生于 通过 单光子机制。然而，对于特殊的双光子增强探针，激发可以进行 通过 双光子机制，可实现探针在高分辨率显微成像中的应用。单光子激发通常空间分辨率较低，但所需仪器更简单，且可用于基于LED的光纤磷光计进行单点测量。 
1.3) 探针发出的磷光来源于长寿命的三重态。探针分子必须经过特殊设计，以实现高三重态的量子产率，并发射磷光而非荧光。当处于三重态时，探针可能与氧分子发生碰撞，导致三重态失活，这一过程称为“猝灭”。在无氧条件下，三重态的寿命即磷光衰减寿命为 τ0。在有氧条件下，由于猝灭作用，磷光寿命（τ）会缩短。三重态寿命与环境中氧的含量之间存在直接关系。这种关系即著名的 Stern-Volmer 关系，它将磷光寿命（τ）与氧浓度 [O2]（或氧分压 pO2）关联起来：
<img src="/files/ftp_upload/1731/1731equation.jpg" alt="用于氧气浓度荧光猝灭分析的 Stern-Volmer 方程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="equation">
在生物系统中，氧气是迄今为止最有效的磷光猝灭剂，这使得磷光猝灭法对氧气具有很高的选择性。
1.4) 为了测量寿命 t，需对发射的磷光光子进行时间上的分箱。例如，在激发脉冲之后，前 15 微秒内可能收集到 200 个光子，接下来的 15 微秒内收集到 150 个光子，依此类推，直至不再收集到光子。将各时间箱中的光子数对时间作图，即可得到磷光衰减曲线，通过分析该曲线可获得寿命 τ。在成像过程中，此方法应用于图像的每一个像素，从而生成磷光寿命分布图。寿命测量对探针在整个样品中分布不均的情况不敏感，而这种不均在生物样品中十分常见。因此，寿命信号仅反映氧气状态。寿命 τ 通过 Stern-Volmer 关系式转换为氧气浓度。
2. 磷光探针的构建
用于生物体系中氧气检测的磷光探针由磷光发色团（核心）组成，这些发色团被封装在由树状大分子——高度规整的超支化聚合物[3]——构建的笼状结构中。树状大分子可保护核心免受环境相互作用的影响，并调控氧气向核心扩散的速率，从而优化探针的灵敏度和动态范围（即Stern-Volmer关系中的常数kq）。树状大分子的末端被化学惰性的亲水性聚乙二醇（PEG）基团修饰，使探针具有高度水溶性，并防止其与生物大分子发生相互作用。
探针的磷光核心为卟啉或π-扩展卟啉的铂（Pt）或钯（Pd）配合物。π-扩展卟啉是指吡咯环与外部芳香片段稠合的卟啉。通过π-扩展可调节探针的光谱特性，以满足特定成像应用的需求（例如显微成像与断层成像）。作为示例，我们描述了四芳基四苯并卟啉钯（PdAr4TBP）的合成方法[4]。PdAr4TBP在光谱的远红区具有强吸收带和强烈的磷光，非常适合用于生物体系中的氧气检测。
PdAr的合成4TBP 的步骤包括以下内容：
2.1) 通过Lindsey缩合反应[5]，将四氢异吲哚与取代苯甲醛缩合制备四芳基四环己烯卟啉（Ar4TCHP）。在四氢异吲哚（1当量）的CH中0.01 M溶液中2CL2 在氩气氛围下加入芳香醛（1 当量）。反应混合物于室温避光搅拌 10 分钟。BF3xEt2O（0.2 当量）加入后，反应混合物在室温下继续搅拌 2 小时。随后加入 DDQ（1 当量），混合物在持续搅拌下静置过夜。反应液用 10% 水合 Na 溶液洗涤2SO3，10% 水溶液 Na2CO3，5% 水合盐酸，最后用饱和食盐水洗涤。有机相用 Na₂SO₄ 干燥2SO4，然后在真空下浓缩。残留物用CH重结晶2Cl2 - 叔丁基-丁基醚混合物以得到Ar4TCHP 为绿色粉末，产率约为 50%。 
2.2）插入 Pd 以获得 PdAr4TCHPs。将游离碱卟啉（1 当量）与 PdCl2 或 Pd(OAc)2（1.2 当量）在过量 Et3N（20 当量）存在下，于回流的 CH3CN 中反应。通过紫外-可见光谱法（溶剂为 CH2Cl2-AcOH）监测反应进程，当 468–472 nm 处的 Soret 带完全消失时，认为反应完成。反应混合物冷却后，用 CH2Cl2 稀释，并通过一层薄薄的硅藻土过滤以除去 Pd(0)。蒸发溶剂后，残留物通过硅胶柱层析纯化，以 CH2Cl2 作为洗脱溶剂。收集深红色馏分，蒸发溶剂后几乎定量地得到目标产物 PdAr4TCHPs。
2.3) PdAr4TBP通过PdAr的氧化制备4在回流的THF中，使用过量2倍的DDQ（16当量）处理TCHPs。回流过程中，溶液颜色由深红色变为深绿色。蒸发溶剂后，将残余物用CH稀释2Cl2，用10%水溶液Na洗涤2SO3，水和盐水。有机相用Na干燥2SO4 并在真空下浓缩。残余物通过硅胶柱层析纯化（洗脱剂：CH2Cl2）。收集第一份深绿色组分，减压浓缩，得到85-90%的PdAr4TBP，呈蓝绿色粉末。
2.4) 使用10倍过量的KOH在1%（v/v）水/四氢呋喃中于室温下水解Pd四[3,5-二丁氧羰基苯基]四苯并卟啉（PdAr4TBP）的外围酯基。将生成的PdAr4TBP羧酸衍生物钾盐沉淀析出后，倾去溶剂。固体溶于水，继续搅拌2小时，用浓盐酸酸化至pH~4-5。所得沉淀通过离心分离，用水洗涤，并在真空下干燥。
保护树枝状结构（dendron）。 树状大分子的每一个独立分支称为 dendron。保护树枝状结构由芳基甘氨酸（AG）构建单元构成。AG 树枝状结构可由廉价起始原料简便合成，并通过无需色谱纯化的手段以高纯度和高收率获得。第二代（G2）AG-树枝状结构的合成包括以下步骤：
2.4）采用 Fischer 卤代酰卤法合成砌块：Boc 保护的 3,5-二羧基苯基甘氨酸酰胺和 3,5-二丁氧羰基苯基甘氨酸酰胺。
2.5）使用 CDMT/NMM 肽偶联化学法偶联结构单元。
2.6）在室温下将 G2 树枝状分子溶液在三氟乙酸（TFA）中搅拌 2 小时，以脱除焦点氨基的保护基。
2.7）对于高代数树状大分子的组装，需重复进行偶联/脱保护步骤。
树状大分子组装通过HBTU/DIPEA偶联反应将脱保护的树状支化单元与PdAr4TBP（或其他卟啉）偶联而实现。
2.8）首先，从树枝状分子上除去 Boc 保护基团。例如，将 Boc 保护的 G3 树枝状分子（0.58 g）溶于 TFA（15 ml）中，混合物在室温下反应 2 小时。通过旋转蒸发除去酸，得到 TFA 盐形式的树枝状分子。将残余物溶于干燥的 NMP（10 ml）中，并加入几滴 DIPEA 以淬灭残留的 TFA。
2.9）在开始偶联反应之前，必须将卟啉完全溶解。例如，将四羧基苯基卟啉铂（0.061 g）溶于65 ml无水NMP中，在氮气氛围下加热至140°C并搅拌10分钟。
2.10）将溶液冷却至室温，加入 HBTU（0.211 g），混合物搅拌反应 5 分钟。
2.11) 将DIPEA（0.35 ml）一次性加入混合物中，立即随后加入树状分子的TFA盐在NMP中的溶液（见2.8），混合物在搅拌下静置过夜。
2.12) 将混合物倒入3%水溶液NaCl（350 ml）中，离心收集析出的沉淀，并依次用水、MeOH和Et洗涤。2通过反复悬浮/离心获得目标卟啉-树状大分子。 
2.13) 为了水解外围的酯基，首先将树状大分子在 DMSO/MeOH 中用 NMe4OH（约 5 mM）处理 20–60 分钟，随后完全除去溶剂。该步骤可使树状大分子生成足够数量的羧酸根，从而获得水溶性。为完成水解，再将树状大分子用 0.1N 的水相 NaOH 处理（过夜）。最终，可分离得到纯的卟啉-树状大分子羧酸，产率为 80–95%。
树枝状大分子外围的修饰。 在此阶段，从相同的卟啉-树枝状大分子出发，可合成单光子或双光子探针。在前一种情况下，所有外围的羧基均被聚乙二醇（PEG）单元修饰，该方法称为PEG化。在后一种情况下，首先将若干羧基与经乙二胺（EDA）连接基修饰的双光子天线发色团（香豆素-343）偶联，随后对剩余的羧基进行PEG化修饰[6]。树枝状大分子使用单甲氧基寡乙二醇胺（m-PEG-NH2，平均分子量1000）通过HBTU/DIPEA偶联反应实现PEG化。
2.14) 将 HBTU 以 1.25 倍摩尔过量加入到树形分子的 NMP（或 DMF）溶液（1–10 mM）中，室温下搅拌反应混合物 10 分钟。随后加入 6.25 倍摩尔过量的 DIPEA，立即再加入 1.25 倍摩尔过量的 m-PEG-NH2。反应混合物在室温下继续搅拌 2 天。向反应混合物中加入乙醚，通过离心分离析出的沉淀，并将沉淀物用乙醚在 THF 中再次沉淀。
2.15）通过收集第一前缘相，采用尺寸排阻色谱法实现最终纯化。将聚乙二醇化的卟啉-树状大分子溶解于少量四氢呋喃（~15 ml）中，加样至填充有聚苯乙烯尺寸排阻相（Biorad，Biobeads S-X1）的色谱柱顶部。用纯四氢呋喃洗脱色谱柱，收集随溶剂前沿移动的深色条带。
2.16）在旋转蒸发仪上除去 THF，并将剩余物质在真空下干燥。
3. 探针表征
光物理表征包括在生理条件下测量探针的吸收光谱和发射光谱、磷光寿命τ0以及 Stern-Volmer 氧猝灭常数kq。
3.1) 使用标准仪器（分光光度计和稳态荧光光谱仪），在常温常压条件下测定探针的吸收光谱和发射光谱。探针溶液浓度约为 1 μM。
3.2）接下来，获得 Stern-Volmer 校准曲线。这是最重要的测量步骤，因为它使我们能够将探针的寿命与氧气浓度关联起来。
3.3）将探针的PBS缓冲液（pH 7.2）溶液置于特制的圆柱形比色皿中，将比色皿放入控温腔室内，该腔室位于不透光的屏蔽箱内，箱体设有激发光和发射光光纤的接口。在腔室内，光纤以直角几何构型紧贴比色皿放置。
3.4）将比色皿用塞子封闭，塞子上插入一个高灵敏度的克拉克型氧电极（CK-氧电极）。塞子上还设有两个针孔端口，用于氩气的进气和出气。电极浸入溶液中，而针孔仅用于在溶液表面之上通入气体。最初，进气口不连接氩气。
3.5）将温度设定至所需值（通常为36-37°C），溶液在搅拌条件下静置以达到平衡。
3.6）激发光纤连接至由计算机控制的数字磷光计的激发端口。磷光计中的光源为高功率LED，其输出由333 kHz的D/A板控制。发射光纤连接至磷光计的另一个光学端口，该端口耦合至一个对红外光高度敏感的APD（雪崩光电二极管）。二极管的输出信号经过放大后输入同一控制板的A/D通道，从而实现激发通道与发射通道之间的同步。
3.7) 控制软件可生成任意所需长度的激发脉冲（例如 5 或 10 ms），随后在任意选定的时间段内（通常为 2-3 ms）采集磷光衰减信号。单次寿命测量所需时间通常为 0.5-1 s，但测量速度可快至每秒 10-20 次。
3.8）氧电极的输出信号被放大后，输入同一台计算机上的另一块A/D板卡。该板卡为低频板卡（最高1 kHz），用于在选定的时间段内记录电极电流。记录电极数据的程序与磷光仪软件同时运行。
3.9）当溶液温度达到平衡后，同时启动磷光计和电极程序，每10秒进行一次测量。两者的输出结果被同步记录到两个独立的文件中。随后，将氩气连接至比色皿塞子的进气口。
3.10) 当氩气流过搅拌溶液的表面时，会逐渐取代其中的氧气。这导致电极电流下降，同时磷光寿命增加，磷光寿命由磷光计测定。通常情况下，经过约 2 小时后，溶液中的氧气可被完全置换，此期间数据会全自动记录到文件中。
3.11) 滴定运行结束后，将电极数据和磷光寿命导入标准分析软件（例如 Microcal Origin）。电极电流与氧浓度呈线性关系，对于所用的电极，在无氧条件下其电流实际为零。在大气压下，pO2 已知（约为 150 mm Hg）。因此，可将电极数据直接转换为氧浓度标度，并绘制磷光寿命的倒数与 pO2 的关系图。采用最小二乘法对该图进行直线拟合，其斜率即为氧猝灭常数 kq。磷光寿命 t0 可通过同一拟合结果获得（取截距的倒数），或直接从无氧条件下的测量结果中获得。
3.12) 如有需要，可使用探针在白蛋白存在下的溶液重复滴定实验——白蛋白是血浆中浓度较高的蛋白质，以此模拟真实实验体系（动物体内血液）中的条件。in vivo 实验获得的 Stern-Volmer 图应完全一致，前提是树状大分子能有效保护探针，且 PEG 基团可将探针与白蛋白隔离。否则，探针将与血液中的蛋白质发生相互作用，导致 Stern-Volmer 图发生变化，从而引起氧浓度测量结果的不确定性。
因此获得的校准常数用于成像实验中，以测定氧气浓度 先验的 未知。

<ol><li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+on+quenching+of+phosphorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li>
<li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+phosphorescence%3A+A+novel+method+for+measuring+the+distribution+of+oxygen+in+perfused+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue.</a> Science. 241, 1649-1651 (1988).</li>
<li>Lebedev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+phosphorescent+probes+for+oxygen+Imaging+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems.</a> Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).</li>
<li>Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+versatile+synthesis+of+substituted+tetrabenzoporphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins.</a> Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).</li>
<li>Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rothemund+and+Adler-Longo+Reactions+revisited%3A+Synthesis+of+tetraphenylporphyrins+under+equilibrium+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions.</a> Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).</li>
<li>Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+metalloporphyrin-based+dendritic+nanoprobes+for+two-photon+microscopy+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Porphyrins+and+Phthalocyanines%22%5BJournal%5D)">Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen.</a> J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>N-甲基吡咯烷酮</td><td></td><td></td><td>NMP</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td></td><td></td><td>TFA</td></tr><tr><td>二异丙基乙胺</td><td></td><td></td><td>DIPEA</td></tr><tr><td>2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐</td><td></td><td></td><td>HBTU</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td></td><td></td><td>DMSO</td></tr><tr><td>CDMT=1-氯-3,5-二甲氧基三嗪</td><td></td><td></td><td>CDMT</td></tr><tr><td>NMM=N-甲基吗啉</td><td></td><td></td><td>NMM</td></tr></tbody></table>

生物系统中用于氧成像的磷光纳米探针的合成与标定

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

通过磷光猝灭法测量氧气[1, 2]包括以下步骤：1）将探针导入目标介质中（例如血液或组织间液）；2）用适当波长的光照射样品，使探针激发至其三重态；3）收集发射的磷光信号，并分析其时间过程以获得磷光寿命，再将其转换为氧浓度（或氧分压，pO2). 探针不得与生物环境发生相互作用，并且在某些情况下，测量完成后需能从介质中排出。上述每个步骤都对磷光探针的分子设计提出了要求，而这类探针是测量过程中唯一的侵入性组分。本文综述了用于生物体系中氧气检测的树枝状磷光纳米传感器的设计。这些探针由基于铂（Pt）或钯（Pd）卟啉的聚芳甘氨酸（AG）树枝状聚合物构成，其外围经聚乙二醇（PEG）残基修饰。为了实现有效的双光子激发，可在树枝状分子的末端修饰双光子天线发色团，该发色团可捕获激发能量，并通过分子内FRET（Förster共振能量转移）将能量传递至探针的三重态核心。我们描述了探针的关键光物理特性，并提供了详细的校准方案。

我们介绍了基于磷光猝灭的氧气检测原理，并综述了用于生物系统中氧气成像的卟啉类树状纳米传感器的设计。

通过磷光猝灭法测量氧气[1, 2]包括以下步骤：1）将探针导入目标介质中（例如血液……

我们介绍了基于铂和钯卟啉衍生物（DERs）的磷光氧探针的设计。本文将阐述这些探针的结构，包括金属卟啉核心、树状大分子包埋结构以及外围亲水性聚乙二醇层的构建，以及探针的校准方法。大家好，我叫Luis Sinks。我在宾夕法尼亚大学生物化学与生物物理学系与 Sergei OV 教授共事。我是 Emmanuel Losis，也来自 Vina。我同样来自 And，我就是 Sergei。利用磷光淬灭法进行生物氧浓度测量时，需使用外源性磷光物质和探针，这些探针被直接引入目标介质中。血液或组织间液探针是测量方案中唯一的侵入性组件，其设计需要特别关注。今天我们将向您展示一种用于合成和校准树状磷光纳米探针以进行氧气测量及生物系统检测的方法。我们使用该方法来合成和表征适用于半定量及双重氧气测量的探针。那么，让我们开始吧。在开始构建探针之前，我们先来回顾一下探针磷光的基本原理。磷光来源于寿命较长的三重态。探针分子必须设计为能够产生高三重态量子产率，并发射磷光而非荧光。探针的激发可通过单光子过程实现，而对于特殊的双光子增强型探针，则可通过双光子机制实现。单光子激发通常空间分辨率较低，但所需仪器更简单，可用于基于LED的光纤磷光计进行单点测量。处于三重态时，探针可能与氧分子发生碰撞，导致三重态失活，该过程称为猝灭。因此，在有氧环境下，磷光寿命会缩短。由于猝灭作用，三重态寿命对环境中氧含量的依赖性可用 Stern-Volmer 方程来描述。在活体实验中，将探针递送至动物的血液或组织间液中，并用适当波长的光照射组织表面，使探针进入其激发三重态。为了测量磷光寿命，需对发射出的磷光光子进行时间分辨采集。例如，在激发脉冲之后，前5微秒内可能收集到3,609个光子，接下来的5微秒内收集到1,421个光子，依此类推，直至不再检测到光子为止。将各时间点对应箱中的数值绘制成图，可得到磷光衰减曲线，通过分析该曲线可获得磷光寿命。在成像过程中，此方法被应用于图像的每一个像素，从而生成磷光寿命分布图。寿命测量对探针在样品内分布不均的情况不敏感，而这种分布不均在生物样品中十分常见。现在让我们看看如何构建探针。首先将芳香醛加入浓度为 0.01 摩尔的四氢异吲哚溶液中，开始合成过程。在室温下避光搅拌反应混合物 10 分钟。然后加入硼、三氟化二乙基铝，继续搅拌额外两小时。接着加入二氯氰基苯醌（DDQ），反应液颜色由浅红色变为深绿色，将混合物在持续搅拌下过夜。次日，洗涤并干燥溶液，然后在减压条件下浓缩。残留物经重结晶得到绿色粉末状目标产物，产率通常约为50%。接下来，将游离碱卟啉与醋酸钯反应，通过紫外-可见光谱监测反应转化过程。当狄翁在468至472纳米之间的皂带消失后，反应转化即告完成。通过硅胶柱层析法分离卟啉。制备钯四苯基卟啉的方法是将钯四环卟啉进行氧化。在回流过程中，颜色由深红色变为深绿色，蒸发溶剂，用二氯甲烷洗涤残留物，干燥并在真空下浓缩有机相。经硅胶柱层析分离，得到钯四苯并卟啉，呈蓝绿色粉末。接下来水解钯三苯并卟啉的外围酯基。首先，将四苯基卟啉酯在四氢呋喃中用碱处理。然后继续在水相碱性条件下进行水解，通过加入盐酸使卟啉沉淀，并在真空条件下干燥。至此完成卟啉的合成。现在让我们看看如何合成内含子（entrons）。在组装探针之前，需要预先合成丹麦（Denmark）结构的分支，即内含子（entrons）。我们使用气相糖（aero gly）和相同的DERs，这些化合物可通过无柱层析的方法，由廉价的起始材料便捷地制备而成。随后将焦点处带有氨基的树枝状分子连接到叶啉上，而叶啉的制备方法我们刚刚已经展示过。接着，以类似于叶啉外围羧基的方式，水解DME外围的酯基。至此，从卟啉DME多羧酸出发，可合成单光子或双光子探针，用于制备双光子探针。首先，将若干个双光子天线片段分别连接到二聚体外围的多个羧基上，进行发散式修饰。接下来，对二聚体上剩余的羧酸残基进行修饰。开始时，向浓的卟啉二聚体溶液中加入1.25倍摩尔过量的HBTU，并在室温下搅拌反应混合物10分钟。现在，加入二异丙基乙胺和甲氧基聚乙二醇胺。在室温下搅拌反应混合物两天，然后加入乙醚。通过离心分离析出的沉淀，并通过多次加入乙醚从四氢呋喃中重新沉淀。最后，使用四面体烷作为溶剂，通过聚苯乙烯珠上的尺寸排阻色谱纯化探针。现在我们来看探针的表征与校准。在常温条件下，使用标准分光光度计和稳态荧光计，对1微摩尔浓度的探针溶液进行检测，获得探针的吸收光谱和发射光谱。接下来，为了获得斯特恩-乌尔默（Stern-Volmer）校准曲线，从而将探针的寿命与氧气浓度关联起来，需将探针溶液放入一种特殊的圆柱形小瓶（vete）中。该小瓶置于一个不透光的笼子内的温度控制腔室中，笼子设有用于激发和发射光学纤维的接口。用带有插入式高灵敏度克拉克型（Clark-type）氧电极的塞子封闭小瓶。塞子还设有两个针口，用于氩气的进气和出气。将温度设置为36至37摄氏度，并持续搅拌溶液直至达到平衡。将激发光纤连接至由计算机控制的数字磷光计时仪的激发入口。光源和磷光计周长部分采用高功率LED，其输出由一块333千赫兹的数模转换板控制。发射光纤连接至磷光计周长部分的另一个光学端口，该端口耦合到一个对红外光敏感的雪崩光电二极管。光电二极管的输出信号经过放大后输入同一控制板的ad通道，从而实现激发通道与发射通道之间的同步。自主编写的控制软件可生成任意所需长度的激发脉冲，随后采集磷光衰减信号。氧电极的输出信号被放大后，输入同一台计算机上的另一块模拟数字转换板。该转换板为低频板，最高频率为1千赫兹，用于在选定的时间点记录电极电流，通常为每秒10次。当溶液温度达到平衡后，同时初始化磷酸盐周长仪和电极程序。为实现每10秒进行一次测量，将它们的输出同步记录到两个独立的文件中。随后，将Argonne连接至旋塞塞上的进样口。当氩气流过搅拌溶液的表面时，会逐渐取代其中的氧气。这导致电极电流下降，同时磷的寿命增加，后者由磷光计测定。通常情况下，氧气会完全从溶液中被置换出来。滴定运行约两小时后，将电极数据和磷光寿命导入标准分析程序，该程序会绘制出磷光寿命的倒数与氧分压的关系图。采用最小二乘法对该图进行直线拟合，拟合直线的斜率即为氧猝灭常数。磷光寿命可由该拟合结果获得，或直接从零氧条件下的测量值中获取。可以使用探针在白蛋白存在下的溶液重复滴定实验，白蛋白是血浆中存在的一种蛋白质，以模拟体内动物血液中的条件。如果ER能够保护探针，则获得的Stern-Volmer图应完全相同。此外，PEG基团可使探针与白蛋白隔离，避免接触。此处建议，在氧气合成过程中选择若干步骤，然后对探针进行处理及其校准。进行校准时，必须确保条件尽可能接近目标生物体系的实际状况。必须确保探针分子不受白蛋白等生物分子的影响。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

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生物学

氧成像在生物系统中的磷光纳米探针的合成和校准

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本方案描述了一种利用电子自旋共振显微技术对活细胞微环境中的氧气浓度进行微米级三维成像的方法。...

活体物种氧分布的电子自旋共振显微成像

我们实验室制备的荧光纳米颗粒可用于成像生物系统中的离子浓度和离子流，例如细胞在信号传导过程中以及生理稳态下间质液中的离子动态。...

用于生物系统中离子浓度检测的荧光纳米颗粒

NADPH 氧化酶是吞噬细胞中活性氧（ROS）的主要来源。由于 ROS 具有短暂存在的特性，因此在活体动物中测量和监测 ROS 水平十分困难。本文描述了一种在活体小鼠中连续定量检测 ROS...

不同动物模型中NADPH氧化酶活性的生物发光成像

本手稿介绍了利用新型基因编码的一氧化氮（NO•）探针（geNOps）结合荧光显微镜实时监测单细胞内NO•动态变化的实验方案。通过将geNOps与化学钙离子（Ca2+）传感器结合，实现了对单个内皮细胞水平上由Ca2+触发的NO•生成过程的可视化观测。...

应用基因编码的荧光一氧化氮（NO•）探针geNOps对单细胞中NO•信号进行实时成像

本文介绍了一种在无氧条件下，通过纳秒至毫秒时间尺度的时间分辨光致发光光谱法对有机分子进行光谱表征的方法。同时描述了有效去除样品中氧气以限制发光猝灭的方法。...

在无氧环境中利用iCCD相机对三重态 harvesting 有机化合物进行时间分辨光物理表征

我们介绍了一种新型频域发光寿命相机在利用光学传感器薄膜进行二维 O2 分布成像中的应用。文中描述了该相机系统及图像分析流程，以及用于可视化水生植物根际微环境中 O2...

基于频率域相机系统的氧气O2发光寿命成像

本方案描述了利用标准荧光显微镜对球状体的氧合状态和细胞死亡进行多参数分析，从而实现用于生物打印的高通量球状体制备。该方法可用于控制球状体的活力并实现标准化，这对于构建三维组织、肿瘤微环境以及成功进行（微）组织生物制造具有重要意义。...

低成本氧气显微镜辅助的多细胞球体生物制造

本文介绍了一种新型快速光学成像仪在长衰减发射样品宏观光致发光寿命成像中的应用。文中描述了该成像仪的集成、图像采集与分析流程，以及用于成像的传感器材料的制备与表征，并展示了该成像仪在生物样品研究中的应用。...

用于生物医学应用的荧光寿命宏成像仪

我们介绍一种利用氘代水（重水...

芳香族氨基酸调控的细胞代谢生物正交化学成像

本方案介绍了一种用于制造双层微流控芯片并在快速氧浓度波动条件下分析微生物生长的方法。通过在流体通道中进行氧气检测和微生物培养，验证了该装置的性能。...

使用微流控双层装置在微生物单细胞生长分析中实现快速氧气振荡

学习基于铂钯卟啉树状纳米传感器合成磷光氧探针的方法，用于生物系统氧成像。本方案涵盖探针构建、校准流程及其在生物氧测量中的应用价值。

生物系统中用于氧成像的磷光纳米探针的合成与标定

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