Name: 机器人技术和植物组织的基因表达研究的动态图像分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 了解利用机器人技术对植物组织进行基因表达动态成像的方法。本研究使用定制机器人系统对利马豆幼苗进行半连续图像采集，通过ImageJ软件定量分析GFP表达强度，实现高通量基因表达研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

薪资和研究支持由美国大豆委员会以及划拨给俄亥俄州立大学/俄亥俄农业研究与发展中心的州级和联邦资金提供。本研究还部分得到了墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）向CMHG提供的博士后奖学金资助。提及商标或专有产品并不构成俄亥俄州立大学/俄亥俄农业研究与发展中心对该产品的保证或担保，也不意味着排除其他可能同样适用的产品而予以批准。期刊文章编号 HCS 09-17。

以下方法概述了使用自动化图像采集系统进行基因表达图像分析的实验方案。为便于说明，整个流程分为四个步骤：1）种子准备，2）利用微粒轰击法导入基因，3）机器人自动采集图像，4）图像分析。尽管该通用方法可广泛应用于其他多种实验场景，但本文所述的具体操作流程基于使用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，gfp）基因，该基因是一种有效的报告基因，可用于长期追踪同一活体组织中基因的表达情况。
一、种子准备
<ol>
	<li>可以购买利马豆（Phaseolus lunatus cv. Henderson-Bush）种子，或最好从生长箱中种植的植株上收获（相对湿度50%，光照周期16/8小时 光照：黑暗，昼夜温度25/23°C）。收获后的种子可通过在-20°C下储存以保持种子质量。</li>
	<li>准备用于种子萌发的Magenta GA7容器。将滤纸或纸巾折叠至适合放入Magenta盒底部。每个容器中加入约25 ml去离子水以润湿纸巾，并倒掉未被吸收的水分。将含湿润纸巾的盒子在高压灭菌器中灭菌20分钟。</li>
	<li>使用50 ml一次性离心管，在10%市售次氯酸钠溶液中对种子进行消毒（20粒种子置于20–40 ml溶液中），在旋转摇床（60 rpm）上振荡处理20分钟。 
 注意：后续所有步骤均应在超净工作台内进行。</li>
	<li>用无菌去离子水冲洗种子4–7次，每次轻轻振荡30秒。</li>
	<li>将5–6粒无菌种子放置于每个无菌Magenta盒中已折叠好的纸层之间。</li>
	<li>将种子在以下条件下培养4天：25°C，光照周期16/8小时 光照：黑暗，光照强度40 μEm-2 s-1。</li>
</ol>
二、利用基因枪轰击法导入基因
<ol>
	<li>使用您常用表达载体构建基因载体，载体需携带可在活体组织中检测的报告基因。我们已构建一种高拷贝数表达载体，适用于启动子及启动子元件分析。该载体包含 gfp 基因，用于在转化组织中可视化启动子/启动子元件的功能。</li>
	<li>在基因枪轰击前约1-2小时，从萌发的幼苗中切下利马豆子叶，并去除种皮。适合轰击的子叶应呈黄色至浅绿色，扁平且无任何可能干扰后续图像分析的损伤。</li>
	<li>子叶切除后立即置于含MS盐1、B5维生素2、3%蔗糖和0.2% Gelrite（pH 5.7）的OMS培养基上。</li>
	<li>将DNA载体沉淀到M10钨微粒（Sylvania, Towanda, PA, USA）上。在0.6 ml离心管中加入25 μl钨微粒（使用前用无菌水重悬至100 mg ml-1）、5 μl DNA（1 μg μl-1）、25 μl 2.5 M氯化钙（Sigma-Aldrich 货号 C3881-500G）和10 μl 100 mM亚精胺（Sigma 货号 S-2626）。短暂涡旋振荡，充分混匀所有组分。</li>
	<li>将DNA混合物冰上孵育5分钟，随后移除并弃去50 μl上清液。</li>
	<li>通过涡旋振荡重悬DNA包被的微粒，并立即取出2 μl等分试样。每次从管中取样时均需重复涡旋操作。包被微粒应保持在冰上，并在15分钟内使用完毕。</li>
	<li>通过注射器滤器顶部，将2 μl包被微粒置于滤膜中央。将含有包被微粒的滤器单元放入基因枪腔室内的滤器固定装置中。</li>
	<li>将一片利马豆子叶腹面朝上放置于挡板上，并将挡板放入基因枪腔室内。该挡板由熔接在烧杯底部的筛网构成，用于在轰击过程中支撑组织。</li>
	<li>使用基因枪（在本方法中，我们采用实验室设计的一种简单且低成本的粒子流入枪3，PIG）轰击组织，操作如下：a）打开通向真空泵的阀门以抽真空；b）当真空度达到760 mm（30 in）Hg时，启动电磁阀释放氦气以推动微粒；c）轰击完成后，关闭真空管路阀门，并通过排气阀释放真空。用于加速微粒的氦气压力为50 PSI。</li>
	<li>释放真空后，打开腔室门取出轰击后的子叶，并将子叶腹面朝上放回OMS培养基中。 注意：为进行定量和表达谱分析，我们通常每种DNA载体至少轰击三片子叶。同时设置阳性对照，通常为已知具有明确基因表达模式的DNA载体，作为参照。</li>
</ol>
III. 自动化图像采集
<ol>
	<li>打开汞灯，并等待 30 分钟使灯管预热。</li>
	<li>打开 Spot-RT CCD 相机（Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI, USA）和机器人平台电机控制器的电源，后者用于驱动机器人平台的运动。</li>
	<li>在 MZFLIII 体视显微镜（Leica, Heerbrugg, Switzerland）上设置用于 GFP 检测的滤光片组（GFP2 滤光片组；激发光 480/40 nm，发射光 510 LP）。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒加厚的聚碳酸酯培养皿盖进行灭菌。这种专用盖子用于覆盖培养皿底部，可在图像采集过程中防止冷凝4。</li>
	<li>将含有基因枪轰击后子叶的培养皿放置在自动图像采集系统的机器人平台（Arrick Robotics, Hurst, TX, USA）上。该机器人平台由步进电机组驱动，配备可固定 8 个培养皿的载物台，平台由聚碳酸酯、聚丙烯和铝制成。通过拧紧侧向的塑料紧定螺钉将培养皿固定到位。</li>
	<li>打开控制机器人平台和图像采集的定制软件应用程序，同时打开软件中的白光控制器开关。</li>
	<li>在“电机运动”选项卡中，点击“电机开启”和“电机归零”。待软件将平台定位至初始位置后，即可开始为每个子叶输入位置坐标。</li>
	<li>在“电机运动”选项卡中选择第一个培养皿。平台会将培养皿中心定位至显微镜物镜下方。使用移动距离按钮，精确调整第一个子叶的位置以进行图像采集。开启“实时模式”功能后，可通过计算机显示器在白光照明下观察目标区域。</li>
	<li>对第一个子叶，使用体视显微镜上的手动旋钮设置焦距和放大倍数（推荐使用 1.6 倍放大）。同一培养皿上其余子叶的焦距调整，则通过机器人平台上每个培养皿下方的三个调平螺钉完成。</li>
	<li>目标区域定位完成后，点击“添加此位置”按钮。软件会将该区域的坐标添加至位置序列文件中，平台将返回培养皿中心位置。</li>
	<li>使用移动距离按钮和手动调平螺钉，为所有培养皿上的其余子叶设置位置和焦距。待所有子叶的坐标输入完毕后，保存位置序列坐标文件。</li>
	<li>输入图像采集参数。在“图像设置”选项卡中选择所需光源类型：白光或蓝光。进行 GFP 检测时，仅使用蓝光。同时设置曝光参数。尽管红、蓝、绿三色通道的曝光时间可分别独立调节，但通常在 GFP 图像记录中采用相同设置（红、绿、蓝通道分别为 20、14 和 14 秒），以便对不同 DNA 构建体进行直接且一致的比较。</li>
	<li>在同一“图像设置”选项卡中，指定一个空文件夹用于存储图像。所有图像序列将按子叶位置输入顺序，在该主文件夹内以编号递增的独立子文件夹形式保存。</li>
	<li>进入“采集时间控制”选项卡，设置图像采集的时间间隔和总采集周期数。通常每小时采集一次图像，持续 100 小时，以获得清晰的基因表达谱。</li>
	<li>点击“位置序列”选项卡中的“运行序列！”按钮，开始图像采集。</li>
	<li>100 小时图像采集结束后，将控制机器人计算机中的所有图像转移至大容量硬盘或计算机中，用于后续图像分析。采集的高分辨率图像（1600 × 1200 像素）以 TIF 格式保存，每个文件大小约为 5 Mb。</li>
</ol>
IV. 图像分析
<ol>
	<li>使用 Adobe ImageReady 将每个文件夹中的 100 张连续图像进行组合。
	<ol>
 	<li>打开 ImageReady 并将构成序列的所有连续图像作为帧导入。</li>
	<li>将原始图像调整大小为 800 x 600 像素。采集的图像为高分辨率，会产生较大的文件，可能导致图像处理速度变慢。</li>
	<li>浏览图像，找到在大多数图像中均可见的位置。</li>
	<li>将选定区域放大至300%。使用更高倍数的放大倍率对图像进行对齐，可实现更精确的配准。</li>
	<li>在所有图像的上方插入一个图层，并确保其在所有帧中均可见。使用“画笔”工具标记位置。</li>
	<li>使用“移动”工具并以图层上的标记为参考，开始对齐所有帧。</li>
	<li>当对齐完成后，删除用作参考的图层，并将图像保存为单个“psd”文件。同时，以最高分辨率将所有帧导出为单个“mov”文件。每组图像的手动对齐耗时约10分钟。</li>
 </ol>
 </li>
	<li>使用 ImageJ 进行基因表达量的定量分析。
 <ol>
 	<li>打开 ImageJ 软件，并打开之前在 ImageReady 中保存的 "mov" 文件。</li>
 	<li>使用选择工具，选取一个 400 x 300 像素的区域并裁剪图像。应将此新文件保存为“avi”文件。</li>
 	<li>在 ImageJ 中，点击“图像”、“颜色”和“RGB 分割”，将新“avi”文件中的连续图像分离为红色、蓝色和绿色通道。</li>
 	<li>从绿色和红色通道的所有图像中扣除背景荧光。使用绿色通道图像序列，在非表达细胞区域选择一个20 x 20像素的区域，并在"ROI管理器"工具中记录其位置，以便在两个通道中均选中同一区域。在绿色通道中激活该20 x 20像素方块，前往ImageJ任务栏中的"插件"命令，然后点击"为每个切片扣除已测量ROI"插件工具。</li>
 	<li>在 ImageJ 中，点击“图像”、“调整”，然后点击“阈值”，以定义或分割表达 GFP 的像素。通过拖动阈值窗口中的滑块来调整阈值水平，使平均斑点大小为 20–30 像素。</li>
 	<li>使用我们设计的插件测定GFP表达，该插件可测量每个像素的平均灰度值及GFP表达像素的总数。</li>
 	<li>将ImageJ中的平均输出灰度值复制并粘贴到Microsoft Office Excel中。通过将每个通道（红色和绿色）每像素的平均灰度值乘以该通道中表达GFP的像素总数，计算各通道的GFP表达量。两个通道表达量之和即为总的GFP表达量。这些数值可用于展示基因表达谱并进行直接比较。此外，还可利用“mov”或“avi”文件生成延时动画，直观清晰地呈现基因表达动态变化。</li>
</ol>
</li>
</ol>
V. 代表性结果
本文报道的机器人图像采集与分析流程（图1）能够在短时间内获取大量关于基因表达的定量数据。在利用gfp基因进行植物启动子表征时，该方法不仅可用于构建瞬时表达谱（图2），还可用于详细追踪瞬时转化和稳定转化植物组织中的GFP表达5,6。利用连续采集的图像生成的短时间间隔动画，是深入分析植物组织中基因表达随时间变化的有力工具。该方法还可广泛应用于评估直接影响基因表达的各种因素。例如，已成功利用我们的自动化图像采集与分析系统，研究了不同病毒来源的基因沉默抑制因子存在条件下GFP的瞬时表达情况7,8。
<img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig1.jpg" alt="荧光分析；ImageJ 数据；实验流程；显微镜，图像阈值处理，结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="FIgure 1"> 图1. 图像分析流程包括四个主要步骤。（A）使用机器人图像采集系统获取图像序列，（B）将图像分离为红、蓝、绿三个通道，（C）通过调整阈值水平对表达像素进行分割，（D）获得输出结果，包含灰度值及GFP表达焦点的计数。
<img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig2.jpg" alt="基因表达图；总表达量 vs. 时间；启动子分析；动态表达模式。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="FIgure 2"> 图 2. 利用植物启动子驱动 gfp 所产生的不同瞬时表达谱的图表。数据通过我们的机器人图像采集系统收集，并使用 ImageReady 和 ImageJ 软件进行分析。

<ol><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).</li>
<li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).</li>
<li>Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+particle+inflow+gun+for+DNA+delivery+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells.</a> Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).</li>
<li>Finer, J. E., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+reducing+moisture+condensation+on+Petri+dish+lids%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Tiss+Org%22%5BJournal%5D)">A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids.</a> Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).</li>
<li>Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+35S+and+Lectin+promoters+in+transgenic+soybean+tissue+using+an+automated+image+acquisition+system+and+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis.</a> Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).</li>
<li>Chiera, J. M., Bouchard, R. A., Dorsey, S. L., Park, E. H., Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+two+highly+active+soybean+%28Glycine+max+%28L.%29+Merr.%29+promoters+and+their+characterization+using+a+new+automated+image+collection+and+analysis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Isolation of two highly active soybean (Glycine max (L.) Merr.) promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system.</a> Plant Cell Rep. 26, 1501-1509 (2007).</li>
<li>Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+extension+of+transient+GFP+expression+by+the+co-introduction+of+a+suppressor+of+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing.</a> Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).</li>
<li>Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+six+different+viral+suppressors+of+silencing+using+image+analysis+of+transient+GFP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression.</a> Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).</li>
</ol>

机器人技术在人类生活的各个方面具有广泛的应用；具体而言，机器人已成功用于在危险环境中执行任务、自动化繁琐且复杂的操作，以及更精确地完成各项作业。在分子生物学领域，特别是基因表达分析中，机器人不仅能够追踪基因的特征，还能随时间推移监测组织的生长与发育过程。许多生物现象具有动态变化特性，仅通过单个时间点的观察可能难以全面把握。
使用gfp基因进行表达研究在观察组织反应和生长方面具有额外优势。在我们的实验流程中，GFP使我们能够随时间连续监测同一组织样本中的基因表达，因为GFP的检测具有非破坏性。此外，我们所使用的GFP蛋白具有足够的稳定性以便检测，同时又具备一定的降解 turnover，可避免在植物组织中过度积累，从而让我们能够同时观察基因表达的上升和下降过程。
我们已将机器人图像采集与分析系统应用于多种场景。我们预见该系统在许多需要动态理解现象的生物学应用中具有巨大潜力。例如，可利用本系统追踪植物组织的生长与发育，从而深入了解这些过程。此外，通过绿色荧光蛋白（gfp）等报告基因标记的蛋白质转运动态，也可借助延时动画轻松实现可视化。本报告所述方法在技术上较为复杂，但在概念上十分简洁。我们的研究结果具有高度可重复性，且新的应用正不断被发现。

<table><tbody><tr><td>ImageJ</td><td>软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

用于植物组织基因表达研究的机器人技术与动态图像分析

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

植物组织中的基因表达通常通过从植物组织中破坏性提取化合物来进行研究in vitro分析。本文所述方法利用绿色荧光蛋白（gfp) 基因，以随时间对相同组织样本中的基因表达进行持续监测。gfp基因被置于不同启动子的调控之下，并通过粒子轰击法导入利马豆子叶组织中。随后将子叶放置于一套机器人图像采集系统上，该系统由一台配备数码相机的荧光解剖显微镜和一个二维机器人平台组成，该平台为定制设计，可牢固固定培养皿。每小时对子叶组织进行一次图像采集，持续100小时，以生成各个启动子的表达谱。每组连续采集的100幅图像首先使用ImageReady软件进行手动图像对齐，以确保GFP表达焦点在选定的分析视野中保持一致。随后选取图像序列中大小为300 × 400像素的特定区域，利用ImageJ软件进一步分析，获取GFP强度测量值。将批量图像拆分为红、绿、蓝三个通道，并使用ImageJ的阈值功能识别GFP表达区域。在分别扣除红、绿通道中的背景荧光（即从每个像素中减去非表达区域像素的灰度值）后，通过将每个通道中每个像素的平均灰度值乘以该通道内GFP表达像素的总数，再将红、绿两个通道的计算结果相加，从而得出GFP强度值。对全部100个时间点收集GFP强度值，以获得完整的表达谱。GFP表达谱的差异源于启动子强度、是否存在沉默抑制因子以及启动子性质等因素的不同。除了对GFP强度进行定量分析外，图像序列还被用于使用ImageReady生成延时动画。延时动画显示，绝大多数细胞的GFP表达呈现相对较快的上升，随后缓慢下降。部分细胞偶尔出现荧光突然消失的现象，可能与快速细胞死亡有关。此外还观察到GFP明显跨越膜和细胞壁向邻近细胞运输的现象。延时动画提供了仅通过GFP强度谱或单时间点图像采集无法获得的额外信息。

我们报道了一种在植物细胞中引入、追踪和定量分析GFP表达的方法。该方法利用自行设计的机器人系统，对大量样品进行随时间推移的半连续图像采集。我们还展示了使用ImageJ和ImageReady对图像序列进行分析的方法。

植物组织中的基因表达通常通过从植物组织中破坏性提取化合物，进而进行体外分析来研究。这些方法……

在此实验过程中，利用机器人系统随时间成像植物组织中基因表达的动态变化。首先将利马豆种子进行表面灭菌，然后置于湿润的滤纸之间，并放入组织培养容器中以促进萌发。四天后，取下子叶并用含有启动子与绿色荧光蛋白（GFP）融合的DNA构建体进行基因枪轰击。将处理后的子叶放置于培养皿中，并固定在自行设计的二维机器人图像采集系统上。该机器人被编程为每小时对每块组织进行一次图像采集，持续100小时。图像经过图像分析，获得随时间变化的GFP表达强度的定量数据。大家好，我是约翰·菲纳（John Finer），俄亥俄州立大学园艺与作物科学系植物转化实验室主任。我是卡洛斯·埃尔南德斯·加西亚（Carlos Herandez Garcia），俄亥俄州立大学菲纳实验室的博士研究生。今天，Carlos 将向您展示我们开发的利用绿色荧光蛋白分析基因表达和植物组织的实验方案。我们在实验室中采用此方法测定OD活性。为此，我们将目标启动子置于GFP基因的上游，GFP基因即为我们的报告基因。我将向您展示如何将启动子控制引入利马豆的维管组织，并通过我们定制设计的机器人图像采集系统发送应用程序。最后，我将介绍图像分析的实验方案。现在开始，首先按照标准操作程序对利马豆种子进行表面灭菌。将灭菌后的种子置于Magenta GA7容器中，夹在湿润的纸巾层之间，在25摄氏度下培养四天。此处我们使用高拷贝数表达载体，适用于启动子及启动子元件的分析。该载体含有GFP基因，可用于在转化组织中观察启动子或启动子元件的功能，观察时间通常在轰击前约一至两小时。从利马豆种子种皮中切除CU小叶。用于轰击的CU小叶应呈黄色至浅绿色，扁平且无任何可能干扰切除后立即进行图像分析的损伤。将12个CU小叶置于含有MS盐、B5维生素、3%蔗糖和0.2%凝胶琼脂（pH 5.7）的OMS培养基的培养皿中。接下来，将DNA构建体沉淀到M-10钨颗粒上。首先，在使用前立即将颗粒重悬于无菌水中，浓度为100毫克/毫升。然后，在一个0.6毫升离心管中，加入25微升颗粒、5微升浓度为1微克/微升的DNA、25微升2.5摩尔氯化钙以及10微升100毫摩尔亚精胺。将DNA样品置于冰上孵育5分钟，随后移除并弃去颗粒上方50微升的溶液。通过涡旋振荡重悬管底残留的DNA包被颗粒。涡旋后立即取两微升Eloqua。每次取出Eloqua后，重复此涡旋步骤。包被的颗粒应始终保持在冰上，并在15分钟内使用。现在DNA已包被到微粒上，取两微升微粒溶液，从位于滤膜筛中央的注射器滤器顶部加入。然后将该注射器滤器放入粒子喷射装置（PIG）腔室内的滤器固定单元中。将一颗利马豆平放在挡板上，使其轴向朝上，该挡板由一张金属筛网熔接到烧杯底部构成。将挡板放入基因枪室中，该挡板用作在轰击过程中支撑组织的平台。开始轰击组织时，首先打开通向真空系统的阀门，以抽空室内空气。当真空度达到760毫米汞柱时，启动电磁阀，释放氦气以推动微粒。用于加速粒子的氦气压力为50至60 PSI。粒子轰击完成后，关闭真空管路阀门，并通过排气阀释放真空。当真空释放后，打开腔室门取出被轰击的co leadin，并将co leadin放回dal侧。使用OMS培养基进行定量和表达谱分析。每种DNA构建体至少轰击三个共引导样品。同时包括一个具有已知基因表达谱的阳性对照。共聚焦样品现在已准备好进行成像。打开汞灯，并等待30分钟使灯预热。打开SPOT R-T-C-C-D相机和电机控制器的电源，后者用于驱动定制设计的可承载八块培养板的机器人平台的运动。在 MZ L3 体视显微镜上选择激发波长为 480 纳米、发射波长为 510 纳米的 GFP 双滤光片组，以设置用于 GFP 检测的滤光片组。接着，用 70% 乙醇喷洒加厚的聚碳酸酯培养皿盖进行灭菌。这些专用的皿盖用于覆盖培养皿底部，可在图像采集过程中防止冷凝水形成。将含有经轰击处理的铜板放置于机器人平台上，并拧紧侧向固定螺钉以固定其位置。现在打开用于控制机器人平台和图像采集的自定义软件程序。同时通过软件打开软件白光控制器开关，并将平台调整至初始位置。此操作在输入位置之前完成。对于电机选项卡中的每个引导线，选择第一块培养板。平台将把培养皿的中心定位在显微镜物镜下方。使用移动距离按钮精确定位第一个CU引导位置以进行图像采集。在实时模式下，将cuddle引导移动到合适的观察区域。对于第一个cuddle引导，使用解剖显微镜上的手动旋钮调节焦距，并将放大倍数设置为1.6倍。一旦确定了目标区域，点击“添加此位置”按钮。软件会将该区域的坐标添加到位置计划文件中，平台将返回到所有剩余孔板上预设位置的中心。使用移动距离按钮，调节机器人平台每个孔板下方的三个手动调平螺丝，以调整同一孔板上其余孔的焦距。在输入所有孔的坐标后，保存位置计划坐标。输入图像采集参数，例如光照类型（GFP 使用蓝光）和曝光设置，并按照随附书面方案中的说明指定图像存储位置。进入捕获时间控制选项卡，设置图像采集的时间间隔和图像采集的总循环次数。通常每小时采集一次图像，持续 100 小时。生成明确的基因表达谱。通过打开位置时间表选项卡，然后点击运行时间表按钮，开始图像采集。在100小时图像采集结束时，将图像采集系统与外界光线隔离。每个约五兆字节的高分辨率图像已准备好进行图像分析。使用图像处理软件将每个文件夹中的100张连续图像组合起来。将所有连续图像作为帧导入，并调整大小为800×600像素，以加快图像处理速度。接下来，使用新引入的图层上的标记，该图层在所有帧中均可见，并以图像参考中选定的 GFP 斑点为依据。手动对齐每幅图像，对齐完成后，删除用作参考的图层，并将文件保存为单个 PSD 文件。同时，以最高分辨率将所有帧导出为单个 MOV 文件。文件现已准备就绪，可开始进行GFP定量。使用ImageJ打开MOV文件，并裁剪出一个400乘以300像素的区域。然后使用RGB分割工具将序列图像分离为红色、蓝色和绿色通道，用于红色和绿色通道。使用“减去每个切片测量的感兴趣区域（ROI）”插件工具扣除背景荧光。通过调整阈值水平，并使用专门用于测量每个像素的平均灰度值及表达GFP的像素总数的插件，计算GFP表达量。将ImageJ中的输出值复制，最后将绿色和红色通道的输出值粘贴至Microsoft Office。Excel 用于进一步的数据处理，以展示图像配准的结果。此第一段动画显示了在 100 小时实验期间机器人平台重新定位的不准确性。斑点移动是由于机器人平台在每次手动图像配准后无法精确返回到完全相同的位置而产生的伪影，表达 GFP 的细胞可以被清晰观察到，该追踪系统的独特特征也易于可视化。随着此动画的重复播放请注意，被圈出的表达GFP的细胞中，红色圆圈标记的细胞在轰击后18至20小时表现出GFP表达的迅速下降，而白色圆圈标记的细胞则显示出GFP表达的延迟启动。除了动画之外，该方法还可实现对菜豆靶组织中GFP表达随时间变化的快速定量分析。这些代表性结果展示了利用CAMV 35S启动子与四种不同大豆启动子进行的启动子强度比较定量分析。我们刚刚向您展示了如何将 DNA 导入萌发的菜豆子叶中。利用 Lima 脉序种子，将菜豆子叶放置在机器人上，采集图像用于图像分析，并对这些图像进行分析。我们实验室常规使用该方法来验证克隆植物启动子。通过引入不同的植物启动子，可以获得大量数据。然而，该实验流程步骤繁多，操作复杂，容易出错。进行此操作时，必须使用新鲜的菜豆种子，或至少使用储存得当的高质量种子。此外，需迅速完成基因枪轰击用培养皿盖的制备并将其安装到机器人装置上，同时使用较厚的培养皿盖以尽量减少冷凝问题。最后，请注意我们使用的 GFP 是另一种版本，称为 SGFP，来自哈佛大学的 Gen HIN 实验室。这种 GFP 不够稳定，因此可能更适合追踪基因表达的快速变化。感谢您观看我们的视频。祝您的实验顺利。

robotics-dynamic-image-analysis-for-studies-gene-expression-plant

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

机器人技术和植物组织的基因表达研究的动态图像分析

本文展示了一种从植物材料中分离特定细胞类型的实验方法。该技术利用在特定细胞类型中表达荧光蛋白的转基因标记品系，结合细胞解离和荧光激活细胞分选技术进行细胞分离。此外，本文还建立了一种生长体系，便于在细胞分选前对Arabidopsis...

植物原生质体的荧光激活细胞分选

利用表现出组织和器官特异性光敏色素缺陷的转基因植物，正在研究空间特异性光敏色素响应的分子基础。通过荧光激活细胞分选技术分离出光敏色素生色团耗竭的特定细胞，随后进行微阵列分析，以鉴定参与空间特异性光敏色素响应的基因。...

利用FACS辅助的细胞类型特异性表达谱分析研究植物组织和器官特异性的光敏色素反应 拟南芥

的 原位 此处描述的杂交方案可在细胞水平上高灵敏度、高特异性地直接定位 mRNA 和小 RNA...

原位 杂交技术用于植物中转录本的精确定位

一种用于制备的方法 拟南芥 适用于荧光激活细胞分选（FACS）的叶片原生质体，可用于特定细胞群体的研究。该方法适用于任何 拟南芥...

细胞特异性分析 拟南芥 使用荧光激活细胞分选法分离叶片细胞

染色质免疫沉淀是一种用于鉴定拟南芥蛋白质DNA结合位点的强大技术...

染色质免疫沉淀实验用于鉴定拟南芥体内蛋白质-DNA 相互作用 In Vivo

本实验方案的目的是演示如何利用变角落射荧光显微镜监测植物细胞表面荧光标记蛋白的动态变化，展示拟南芥（Arabidopsis...

利用可变角度落射荧光显微镜对植物细胞表面动态进行实时成像

活体共聚焦成像为生物学家研究发育过程提供了强有力的工具。本文中，我们介绍了一种对发育中的拟南芥（Arabidopsis）花进行活体共聚焦成像的详细实验方案。...

活体共聚焦成像观察拟南芥花的发育过程

我们报道了一种简单且通用的方法，可用于对拟南芥（Arabidopsis...

一种通用的封片方法 拟南芥 用于活体时间序列成像的叶片

本文介绍了一种植物组织激光显微切割（LCM）的实验方案。LCM是一种用于无污染地分离特定组织区域的显微技术。该操作流程包括组织固定、石蜡包埋、切片、激光显微切割以及RNA提取。所获得的RNA可用于后续组织特异性、时间分辨的转录组分析。...

激光捕获显微切割结合RNA测序用于植物时空特异性组织基因表达分析

本文介绍了一种低成本的植物成像方法，用于测量表型，并提供了图像采集的最佳实践以及量化植物性状的图像分析流程。这些方法已应用于测量玉米（Zea...

成像与分析用于量化玉米（Zea mays）非生物胁迫表型

该过程结合使用共聚焦显微镜与荧光标记的细胞核及染色质标记品系 拟南芥 同时记录细胞核与染色质动态 拟南芥...

发育与环境胁迫过程中细胞核形态及染色质动态的定量活细胞成像 拟南芥 根

了解利用机器人技术对植物组织进行基因表达动态成像的方法。本研究使用定制机器人系统对利马豆幼苗进行半连续图像采集，通过ImageJ软件定量分析GFP表达强度，实现高通量基因表达研究。

用于植物组织基因表达研究的机器人技术与动态图像分析

探索更多视频