机器人技术和植物组织的基因表达研究的动态图像分析
2010年5月5日
我们报告的引进，跟踪和绿色荧光蛋白基因在植物细胞中表达的定量分析方法。这种方法是利用一个半连续图像采集大量样品的定制设计的机器人系统，随着时间的推移。我们也证明了ImageJ和ImageReady中使用图像序列的分析。
在此过程中，使用机器人技术对植物组织中基因表达的动态随时间进行成像，首先对利马豆种子进行消毒，并将其放在组织培养容器中的湿纸巾之间发芽。四天后，去除 coan 并用含有与 GFP 融合的启动子的 DNA 构建体轰炸放置在培养皿中的 Coan 安装在二维定制设计的机器人图像收集系统上。该机器人经过编程，每小时捕获一次每个组织块的图像，持续 100 小时。
图像经过图像分析，获得 GFP 表达强度随时间变化的定量数据。大家好，我是俄亥俄州立大学园艺与作物科学系植物转化实验室的主任 John Finer。我是俄亥俄州立大学最终实验室的博士生 Carlos Herandez Garcia。
今天，Carlos 将向您展示我们开发的用于使用绿色荧光蛋白分析基因表达和植物组织的方案。我们使用我们在实验室开发的该程序来测量 OD 活性的应变。为了做这个启动子，我们在 GFP 基因上游的第一个冠，也就是我们的报告基因。
我将向您展示我们如何将启动子控制引入 Lima 静脉催化，并在我们的定制设计机器人图像捕获系统上发送应用程序。最后，我将介绍一下我们的图像分析方案。那么让我们开始这个程序：使用标准程序对消毒的利马豆种子进行表面消毒。
将消毒过的种子放入洋红色的 GA 7 容器中，在湿毛巾和纸巾层之间，并在 25 摄氏度下孵育 4 天。这里我们使用高拷贝数表达载体，可用于启动子和启动子元件分析。该载体包含 GFP 基因，用于在轰击前约 1 至 2 小时观察转化组织中的启动子或启动子元件功能。
从种皮中去除利马豆 CU 铅素。适合轰击的 CU 铅蛋白应为黄色至浅绿色平坦，并且在切除后立即将 12 cu 铅蛋白放入含有 MS 盐、B 5 维生素、3% 蔗糖和 0.2% 凝胶速率的 OMS 培养基的培养皿中，pH 值为 5.7。接下来，将 DNA 构建体沉淀到 M 10 钨颗粒上首先，在使用前将颗粒重悬于无菌水中至浓度为 100 毫克/毫升。
然后在 0.6 毫升离心管中，加入 25 微升颗粒、5 微升 DNA（每微升 1 微克）、25 微升 2.5 摩尔氯化钙和 10 微升 100 毫摩尔精子aine。将 DNA 制备物在冰上孵育 5 分钟，然后取出并丢弃颗粒顶部的 50 μL 溶液。通过涡旋重新悬浮留在试管底部的 DNA 包被的颗粒。
涡旋后，立即取出 2 μL 的 Eloqua。重复此涡旋步骤。每次去除 Eloqua 时，涂层颗粒应保存在冰上并在 15 分钟内使用。
现在 DNA 已包被到颗粒上，将两微升颗粒通过滤网中间的针式过滤器顶部。然后将针式过滤器放入颗粒流入枪或 PIG 室内的过滤器固定装置中。将利马豆 co 引线的轴向朝上放在挡板上，挡板由熔化到烧杯底部的筛网组成。
将挡板放在粒子枪室中，该挡板用作轰击期间支撑组织的平台。要轰击组织，首先打开通向真空的阀门以排空腔室。当真空达到 760 毫米汞柱时，激活螺线管并释放氦气以推动颗粒。
用于加速颗粒的氦气压力为 50 至 60 PSI。粒子轰击后，关闭真空管路阀并使用排气阀释放真空。当真空释放时，打开腔室门以取回被轰炸的 co 导联，并将 co 导联送回 dal 侧。
高达 OMS 培养基，用于定量和表达谱分析。为每个 DNA 构建体轰炸至少 3 个 co leadin。还包括阳性对照，它给出了经过充分研究的基因表达谱。
共导联蛋白现在可以进行成像。打开水银灯并等待 30 分钟，让灯预热。打开 SPOT R-T-C-C-D 相机和电机控制器的电源，电机控制器驱动定制设计的机器人平台的运动，该平台可容纳 8 块板。
通过在 MZ L 三解剖显微镜上选择 480 纳米激发和 510 纳米发射的 GFP 双滤光片组，设置用于 GFP 检测的滤光片组。接下来，通过喷洒 70% 乙醇对增稠的聚碳酸酯培养皿盖进行消毒。用于覆盖培养皿底座的专用盖子可防止图像采集过程中出现冷凝。
将包含轰炸 cuan 的板放在机器人平台上，并拧紧横向固定螺钉以将其固定到位。现在打开控制机器人平台和图像采集的自定义软件应用程序。同时使用软件打开软件白灯控制器开关，将平台定位到初始位置。
这是在输入位置之前完成的。对于 motor 选项卡中的每个 coddle leadin，选择第一个板。该平台将培养皿的中心定位在显微镜的物镜下。
使用移动距离按钮精确定位第一个 CU LEADIN 以进行图像采集。使用实时模式功能，将 cuddle leaden 移动到适当的 view区域 对于第一个 cuddle leaden，使用解剖显微镜上的手动旋钮设置焦点并将放大倍率设置为 1.6 倍。设置感兴趣区域后，单击 add this position 按钮。
软件会将该区域的坐标添加到位置计划文件中，平台将返回到板上所有剩余 coens 的板组位置中心。使用移动距离按钮，使用位于机器人平台上每个板下方的三个手动调平螺钉来调整同一板上剩余 coan 的焦距。输入所有坐标后，保存位置明细表坐标。
输入图像收集参数，例如光线类型（GFP 和曝光设置为蓝色），并指定图像的存储位置，如随附的书面协议中所述。进入 采集时间控制 选项卡，设置采集时间间隔和采集总周期数。通常每小时收集一次图像，持续 100 小时。
生成定义明确的基因表达谱。通过打开 position schedule 选项卡，然后单击 run schedule 按钮来开始图像采集。在 100 小时图像采集结束时，将图像采集系统与外来光线隔离。
每张约 5 MB 的高分辨率图像已准备好用于图像分析。使用 image ready 组合每个文件夹中的 100 个连续图像。将所有连续图像作为帧导入，并将它们的大小调整为 800 x 600 像素，以加快图像处理速度。
接下来，在新引入的图层上使用标记，该图层在所有帧中都可见，并在图像参考中使用选定的 GFP 点。对齐完成后手动对齐每个图像，删除用作参考的图层，并将文件存储为单个 PSD 文件。此外，使用最高分辨率将所有帧导出为单个 MOV 文件。
这些文件现在可以开始 GFP 定量了。使用图像 J 打开 MOV 文件并裁剪 400 x 300 像素区域。然后使用红色和绿色通道的 RGB 分割工具将连续图像分成红色、蓝色和绿色通道。
使用减去每个切片插件的测量 ROI 工具减去背景荧光。通过调整阈值级别并使用旨在测量每个像素的平均灰度值和 GFP 表达像素总数的插件来计算 GFP 表达式。复制图像 J 中的输出值最后，将绿色和红色通道的输出值粘贴到 Microsoft Office 中。
Excel 进行进一步的数据处理，让您了解图像对齐的结果。第一个动画显示了在 100 小时的实验期间机器人平台重新定位的不准确。点移动是由于机器人平台在手动图像对齐后无法在每个时间点返回到完全相同的位置而导致的伪影，可以很容易地观察到表达 GFP 的细胞，并且该跟踪系统的独特功能很容易可视化。
正如该动画重复指出的那样，圆圈中表达 GFP 的细胞，红色圆圈中的细胞在轰击后 18 至 20 小时内显示表达非常迅速的下降，而白色圆圈中的细胞显示 GFP 表达延迟开始。除了动画之外，该程序还允许快速定量 GFP 在利马豆靶组织中随时间的表达。这些代表性结果显示了使用 CAMV 35 S 启动子和四种不同的大豆启动子对启动子强度的比较定量。
我们刚刚向您展示了如何将 DNA 引入发芽的 catalin 中。Lima 静脉种子将 catalin 放在机器人上，收集图像进行图像分析并分析这些图像。我们在实验室中经常使用该程序来验证克隆植物启动子。
从引入不同的植物启动子中可以产生大量数据。然而，这个过程很复杂，许多步骤可能会出错，而执行此程序对于从新鲜的线豆种子开始或至少使用已正确储存的高质量种子很重要。快速将轰炸切割盖安装到机器人上，并使用厚厚的宠物培养皿盖来最大限度地减少冷凝问题也很重要。
最后，请注意，我们使用的 GFP 是另一个名为 SGFP 的版本，即哈佛大学的 front Gen HIN 实验室。这种 GFP 不是很稳定，可能更适合追踪基因表达的快速变化。这就是我们关注我们的原因。
祝你的实验好运。
概述
本研究提出了一种使用定制机器人系统跟踪和定量分析植物细胞中GFP表达的方法。该方法允许在长时间内对多个样本进行半连续图像采集。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生物学
- 基因表达分析
- 成像中的机器人技术
背景
- 了解基因表达动态对植物研究至关重要。
- 绿色荧光蛋白（GFP）作为基因活动的报告基因。
- 机器人系统可以提高图像采集的效率。
- 图像分析软件有助于量化表达水平。
研究目的
- 开发植物组织中基因表达成像的协议。
- 利用机器人进行高通量图像采集。
- 分析GFP表达的定量随时间变化。
使用的方法
- 对豌豆种子进行表面灭菌以促进发芽。
- 用含有GFP报告基因的DNA构建体对种子进行轰击。
- 使用定制机器人系统进行图像采集。
- 使用ImageJ和ImageReady软件进行图像分析。
主要结果
- 成功跟踪了植物组织中GFP表达超过100小时。
- 获得了GFP强度的定量数据。
- 该方法在图像采集中表现出高效率。
- 机器人技术促进了多个样本的同时处理。
结论
- 开发的方法对于研究植物中的基因表达有效。
- 机器人系统可以显著提高实验的吞吐量。
- 图像分析工具对解释表达数据至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables longitudinal monitoring of gene expression in living plant tissues, providing dynamic, quantitative data that supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By capturing expression profiles over time, it reduces reliance on destructive assays and improves predictive confidence in promoter activity assessments. The approach enhances translational continuity from discovery through preclinical stages by generating reproducible, time-resolved biomarker-like readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional dynamics and promoter strength under controlled conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation through real-time reporter expression tracking.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by correlating expression kinetics with phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative GFP intensity measurements suitable for high-content screening.
- Reproducibility: Enables consistent region-of-interest selection and background subtraction across time points.
- Scalability: Robotics platform allows parallel processing of multiple tissue samples under identical conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Biomarker Alignment: Time-lapse imaging provides spatial and temporal expression patterns that inform biomarker relevance.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking promoter activity to cellular behavior over time.
- Mechanistic De-risking: Reveals intercellular transport and expression heterogeneity not detectable in endpoint assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling hypothesis testing and pathway clarification before lead identification, with outputs feeding into analytics-driven go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports promoter element analysis and transcriptional dynamics assessment for target hypothesis refinement.
- Screening: Delivers quantitative, time-resolved expression data that enables reliable compound or genetic construct evaluation.
- Analytics: Provides GFP intensity measurements and spatial distribution data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects expression dynamics to cellular phenotypes, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Robotics and image analysis workflow can be adapted across model systems and promoter libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene regulatory element function through kinetic profiling.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via automated image collection and standardized analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing ambiguity in promoter strength and stability assessments.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic constructs based on expression durability and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue preparation, particle bombardment, and fluorescence microscopy.
- Dependent on custom robotics platform, fluorescence microscope, and digital image capture system.
- Necessitates cross-team standardization for image alignment, channel separation, and threshold settings.
- Adaptation to other model systems may require adjustments to tissue handling and imaging parameters.
- Manual image alignment step introduces variability that may affect longitudinal consistency.
