Name: 确定使用血凝检测血清中的反应和滴度 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: 学习血凝检测技术，通过U型底微孔板进行血清倍比稀释，观察红细胞凝集模式以测定抗体反应性和滴度。该方法快速简便，适用于免疫学和血清学研究。

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作者感谢Lora Matthews女士进行该技术操作，以及Paul Shepherd先生负责摄影工作。本项目由南澳大利亚大学医学检验项目资助。

5倍维罗纳尔缓冲盐水（VBS）的制备
<ol>
 <li>制备巴比妥缓冲盐水（VBS）时，需先配制三种不同的溶液。</li>
 <li>通过将21.25 g NaCl和0.94 g戊巴比妥钠溶解于350 ml蒸馏水中来配制溶液1。NaCl和戊巴比妥钠的终浓度分别为1.02 M和13 mM。</li>
 <li>通过将1.44 g巴比妥溶解于125 ml热蒸馏水中来配制溶液2。巴比妥的终浓度为62.5 mM。</li>
 <li>通过将20.33 g MgCl2和4.41 g CaCl2溶解于100 ml蒸馏水中来配制溶液3。MgCl2和CaCl2的终浓度分别为2.18 M和440 mM。</li>
 <li>将溶液1和溶液2混合，并冷却至室温。</li>
 <li>待混合溶液冷却后，加入1.25 ml溶液3，并用1 M HCl将pH调节至7.3–7.5。</li>
 <li>用蒸馏水定容至500 ml，得到5倍浓度的储备液。</li>
 <li>配制1倍工作液时，将储备液按1:5比例用蒸馏水稀释。</li>
</ol>
Revercells 的稀释
<ol>
 <li>轻轻颠倒重悬Revercells储存液，取1 ml细胞悬液，于4°C、600g离心5分钟。</li>
 <li>离心后，小心弃去上清液，将细胞重悬于3 ml 1×Veronal缓冲盐溶液中。</li>
 <li>细胞现可于4°C保存，直至使用。</li>
</ol>
步骤
<ol>
 <li>将50ml的1×VBS加入至96孔U型底板的A1-A12列中。</li>
 <li>向A1孔中加入50μl抗A血清，并使用移液器充分混匀。</li>
 <li>使用新的移液器吸头，从A1孔中取出50μl液体并转移至A2孔。充分混匀后重复此操作，依次转移至A11孔，最后将A11孔中的50μl液体弃去。</li>
 <li>血清样本现已完成连续2倍稀释，稀释比例从1:2至1:2048。A12孔不加血清，作为VBS阴性对照。</li>
 <li>若需检测多个血清样本，则对B行等重复步骤4.1–4.4。</li>
 <li>完成所有稀释后，向所有孔中加入50μl 1% Revercells。注意：Revercells在静置过程中会沉降，使用前应轻轻重悬。</li>
 <li>通过轻敲微量滴定板侧面混匀样本，覆盖后于37°C孵育1小时以进行血凝反应。可使用培养箱或温度受控的房间完成孵育。</li>
 <li>孵育结束后，小心将板从培养箱中取出，观察各孔的血凝情况。应首先检查VBS对照孔。若该孔为阴性反应，则结果有效；若VBS样本出现阳性血凝结果，则结果无效，需重复实验。阳性血凝反应表现为孔底形成一层广泛的细胞膜状沉淀，阴性反应则表现为孔底中心形成一个小而集中的细胞沉淀。中间型结果表现为外周有一圈阳性细胞的晕环，中心为沉淀的细胞核心；此结果提示血清中含有一定量可反应的抗体，但抗体浓度不足以引发完全反应。</li>
 <li>代表性结果部分提供了预期结果的两种图示。示例中分别展示了一组无效和有效结果，并将确定抗血清的滴度。</li>
</ol>
代表性结果：
视频中包含代表性结果的示例。以下（图1和图2）以示意图形式展示两个示例：第一个示例为无法判读的反应，因为VBS对照呈阳性；第二个示例为有效的检测，可据此确定滴度。
<img src="/files/ftp_upload/1752/1752fig1.jpg" alt="抗体检测实验结果的连续稀释示意图，浓度逐级降低。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 血凝试验中阳性结果失败的一个示例。在上述图示中，该血凝反应结果不可接受。VBS血清阴性对照显示出阳性血凝反应，表现为孔底出现片状沉淀。这表明实验过程中出现了错误，结果无效。在此情况下，应重新进行实验。
<img src="/files/ftp_upload/1752/1752fig2.jpg" alt="抗体滴度分析的稀释系列示意图；显示稀释倍数及阳性与阴性结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 一个血凝试验的示例，其中阳性结果正确出现。在图示表示中，血凝反应有效。VBS阴性对照显示出阴性血凝反应，表现为孔底部形成的沉淀物。最后一个阳性孔为第7行，表明该血清样本的滴度为128（即1/128的倒数）。这代表血清中存在中等含量的抗体。

血凝试验是一种非常简单的技术，可在短时间内检测大量血清样本。该技术的另一个优点是无需特殊设备即可读取结果，肉眼观察即可。此技术还可经修改用于检测尿液中的人绒毛膜促性腺激素，作为血凝抑制试验的一部分。与标准血凝试验相关，在正确实施该检测时有几个需要特别注意的方面。首先，该技术依赖于细胞在凹面表面的沉降，因此必须使用U型或圆底微量滴定板。常用的平底板（如ELISA所用）不适用，因为阴性和阳性反应在平底板上表现相同。此外，应认识到当使用不同血清样本时，反应性抗体的浓度可能各不相同。在高抗体浓度下，抗原（Revercells）可能成为限制因素，从而出现前带效应。然而，这不会影响滴度值的判定，因为滴度被定义为最后一次观察到阳性反应的孔。最后，该技术并非定量方法，无法得知血清中反应性抗体的绝对水平。但在大多数情况下，这并非必需，特别是当仅需了解对已知抗原的反应性时。

<table><tbody><tr><td>Revercells</td><td>CSL</td><td>02490201</td><td>终浓度使用1%</td></tr><tr><td>Anti-A 血清</td><td>CSL</td><td>02611305</td><td></td></tr><tr><td>96孔U型底板</td><td>TRP</td><td>92097</td><td>必须为U型底</td></tr><tr><td>巴比妥缓冲盐水</td><td></td><td></td><td>终浓度使用1×</td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C 培养箱/室</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性手套</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用血凝试验测定血清的反应性与滴度

Determining the Reactivity and Titre of Serum using a Haemagglutination Assay

血凝集是凝集反应的一种特定形式，当抗体与作为颗粒性抗原的红细胞结合时发生。红细胞是特别有用的靶标，因其易于获取，且凝集现象可通过肉眼直接观察。该技术常用于测定抗体（Ab）效价、血型分型以及病毒定量。本视频将演示使用特异性识别A血型抗原的抗体对红细胞（Revercells）进行血凝集试验的操作步骤。将抗血清在96孔U型底微量滴定板中进行系列稀释，随后加入Revercells悬浮液。样品混合后于37°C孵育60分钟。孵育结束后，可直接肉眼判读各样品的阴性（-）、阳性（+）及中间型（-/+）血凝集反应。该方法利用快速简便的技术评估血清样本的反应性及抗体效价。视频内容将涵盖该试验的原理、结果的读取与解释、效价的确定方法、试验的可调整方案以及使用该技术时可能遇到的问题。

血凝集, 抗体效价, 血型分型, 病毒定量, 红细胞, 微量滴定, 37°C孵育, 凝集反应, 抗血清, 系列稀释

血凝反应是一种抗体与红细胞结合的凝集现象。红细胞易于获取，且结果可用肉眼直接观察。本视频演示了血凝反应实验的操作步骤、结果判读以及效价的确定方法。

血凝反应是凝集反应的一种特定形式，当抗体与作为颗粒性抗原的红细胞结合时发生。红细胞……

使用血凝素检测法测定血清的反应性及滴度。凝集反应是可溶性抗体与颗粒性抗原之间发生的反应。这些抗原可包括细胞或偶联分子。载体表面的表位可使抗体结合并相互交联载体，从而形成一种称为抗原-抗体复合物的复杂晶格结构。血凝是凝集反应的一种特定形式，其中抗体与作为颗粒性抗原的红细胞结合。红细胞是理想的检测靶标，因为它们不仅易于获得，而且实验结果可通过肉眼直接观察。血清样本经连续稀释后，加入96孔U型底培养板中。随后加入红细胞（Riva细胞）悬液。当存在高浓度抗体时，抗体会与红细胞结合，形成较大的晶格结构。当该晶格在重力作用下沉淀时，会贴合ubo板的形状。从上方观察，可见一片广泛的红细胞聚集现象。此为阳性血凝反应。当抗体水平较低时，无法形成网格结构，红细胞会顺应UBO板的形状并聚集在底部，形成一个小的沉淀物。这是阴性血凝反应。此图显示的是阳性反应。细胞在沉降过程中形成晶格结构，并贴合U型底板的形状。在左侧和右侧，我们看到的是俯视图，其中可见一片广泛的红细胞层。如果存在中等量的抗体，则会观察到部分字母状结构的形成。血凝反应还可用于检测不同血清样本对已知抗原的反应性。同时可以确定血清样本的滴度，即仍能观察到阳性反应的最高稀释倍数。通常情况下，血清样本中的抗体浓度越高，滴度也越高。此图显示为阴性血凝反应，抗体数量不足，无法介导红细胞发生交联。当细胞因重力沉降时，会沿孔壁滑落，在孔底形成紧密的沉淀。右侧示意图显示了从上方观察时的红细胞。本实验需要1块96孔U型底板。必须使用U型底板，因为平底板无法使细胞沉淀形成细胞团，从而导致结果无法判读。用移液器向第A行第1至第12列各孔中分别加入50 µL待测血清、1%瑞氏细胞悬液以及一份维罗纳缓冲盐溶液。向各孔中再加入50 µL罗氏缓冲盐溶液。此溶液用作您的稀释液。现在将50微升血清加入A1孔中。这是您的第一次1:2稀释。使用移液器确保血清样本充分混匀。混匀后，从A1孔中取出50微升，转移至A2孔。这是您的1:2二次稀释，得到四倍稀释。 继续使用第3至第11孔进行此系列稀释。不要向第12孔加入任何血清，因为该孔为罗氏缓冲盐水阴性对照。现在取已充分混匀的1%瑞氏细胞悬液，向A1至A12各孔中分别加入50 µL。细胞加入后，盖上培养板，轻轻敲击培养板，以确保样品与细胞充分混匀。随后在37摄氏度条件下孵育60分钟。应使用带加湿功能的培养箱。在60分钟的孵育期间，抗原与抗体将发生相互作用，细胞将开始沉降。您所观看的视频是整个60分钟过程的延时摄影图像。此为第5至第10孔的放大图像。我们已经观察过，嗯，12号孔，这是本实验的VBS对照孔。该孔中的细胞已形成紧密的沉淀，表明实验体系正常发挥作用。5号和6号孔是阳性血凝反应的示例。其中，第七孔为中等凝集结果的示例，而第八、九、十孔则为血凝阴性。根据此结果，滴度应以第七孔的稀释度为准，因为这是最后一次观察到阳性反应的孔。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

确定使用血凝检测血清中的反应和滴度

本研究建立了一种简单的槽点印迹法，利用针对流感病毒血凝素和神经氨酸酶最保守序列的通用抗体，对其进行定量分析，这些保守序列通过生物信息学分析确定。该创新方法可能为所有病毒血凝素和神经氨酸酶的定量测定提供一种有用的替代方案。...

使用通用抗体通过简易槽印迹法对所有A型流感病毒血凝素和神经氨酸酶进行定量分析

该视频演示了用于检测血清中针对特定抗原的抗体的血凝抑制试验。通过不同的视觉模式，可确认检测孔中出现血凝抑制现象，而对照孔中出现血凝现象。该试验在病毒学和免疫学领域中对于评估免疫反应、疫苗有效性以及研究病毒感染具有重要作用。...

检测血清中针对目标抗原抗体的血凝抑制试验

本视频展示了利用过表达与α2,6连接的唾液酸的人类血清中的Madin-Darby犬肾细胞进行微量中和试验，以检测中和抗体。该试验常用于流感的人类血清学研究。...

一种用于测定人血清中中和抗体滴度的微量中和实验

本视频展示了一种用于测定血清样本中流感病毒神经氨酸酶（NA）抑制性抗体滴度的检测方法。将含有抗NA抗体的血清样本加入包被有胎球蛋白（fetuin）的微孔板中。加入病毒后，抗体可阻止病毒NA切割胎球蛋白并暴露其半乳糖基团。随后加入辣根过氧化物酶标记的凝集素，该凝集素可结合暴露的半乳糖。通过比色法测定NA抑制性抗体滴度，即固定化的凝集素偶联过氧化物酶催化过氧化物酶底物产生显色反应。...

一种用于测定流感病毒神经氨酸酶抑制抗体滴度的检测方法

我们描述了一种用于测定血清中流感病毒神经氨酸酶（NA）抑制抗体滴度的酶联凝集素检测法（ELLA）。该检测方法利用花生凝集素来定量当神经氨酸酶从包被有胎球蛋白的96孔板上去除唾液酸后暴露出的半乳糖残基。...

通过酶联凝集素法测定流感病毒神经氨酸酶抑制抗体滴度

本文所述实验方案介绍了如何通过血凝抑制试验定量流感疫苗接种者血清样本中针对流感病毒的特异性抗体滴度。第一项试验通过血凝试验确定最佳病毒抗原浓度；第二项试验通过血凝抑制试验定量流感病毒特异性抗体滴度。...

一种优化的血凝抑制（HI）检测法用于定量流感特异性抗体滴度

我们描述了一种用于检测靶向流感病毒血凝素的抗体激活Fc介导效应功能的方法。该检测方法也可经调整后用于评估靶向其他病毒表面糖蛋白的单克隆抗体或多克隆血清诱导Fc介导免疫应答的能力。...

一种评估流感血凝素特异性抗体诱导的Fc介导效应功能的方法

流感中和抗体与预防流感感染的保护作用相关。微量中和试验用于检测人血清中的中和抗体，常用于流感的人体血清学研究。本文描述了一种使用MDCK-SIAT1细胞的微量中和试验，用于检测流感疫苗接种或感染后针对当前流行的3C.2a和3C.3a...

利用MDCK-SIAT1细胞通过微量中和试验测定人血清中针对A(H3N2)流感病毒的中和抗体反应

本文介绍了一种简化的新城疫病毒血清学检测用4血凝单位抗原的制备方法。通过准确定量抗原的血凝效价，结合更为严格的反向滴定法以及明确的调整流程，该方法可提高检测效率，减少假阳性结果，并改善家禽疫病的监测能力。...

新城疫病毒血清学血凝抑制试验中抗原制备的优化

经典途径由抗体激活，最终导致靶细胞裂解。CH50 测定法用于评估血清样本的补体活性。本视频演示了测定血清样本 CH50...

测定血清50%溶血补体（CH50）活性

学习血凝检测技术，通过U型底微孔板进行血清倍比稀释，观察红细胞凝集模式以测定抗体反应性和滴度。该方法快速简便，适用于免疫学和血清学研究。

利用血凝试验测定血清的反应性与滴度

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