从胚胎脊髓中分离和培养联合神经元

本视频演示了一种从胚胎脊髓中分离和培养运动神经元的方法。该操作首先获取E13大鼠胚胎，然后解剖出脊髓。在解剖过程中，沿脊髓的背侧室管膜（roof plate）将脊髓切开，并制备成展开书本状（open book）结构。

背侧组织条被解剖并收集到离心管中。使用胰蛋白酶消化并结合机械法将背侧组织解离为单细胞悬液。随后将联合神经元培养于多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片或组织培养皿上。

随后可用于研究轴突生长与导向的细胞和分子机制。大家好，我是来自蒙特利尔临床研究所神经发育分子生物学实验室的Sebastian。大家好，我是Steve Moen，同样来自神经发育分子生物学实验室。

今天我们将向您展示一种从胚胎脊髓中分离和培养联合神经元的实验方法。我们在实验室中采用该方法研究轴突导向的细胞与分子机制。现在让我们开始吧。

今天，将从新鲜获取的E13大鼠胚胎中分离脊髓，胚胎在整个解剖过程中需置于含有L15培养基的培养皿中。务必保持胚胎和溶液处于冰上。请注意，在所有解剖步骤中，切勿用镊子牵拉脊髓，以免影响完整脊髓的分离。

在解剖显微镜下，将胚胎与所有胚外组织及胚胎膜分离。然后将一个胚胎放入解剖皿中。使用显微剪刀剪除此处所示角度的头部和尾部区域。

这将形成一个平整的表面，有助于固定胚胎位置，便于接触脊髓。将胚胎腹侧朝下放置，头部朝外。用镊子将胚胎一侧牢固地固定住。

不要夹紧或松开镊子，否则组织会被第二把镊子撕裂。抓住脊髓侧边的皮肤。轻拉持针镊的尖端。

剥离覆盖在胚胎背部的皮肤，暴露被脑膜包裹的脊髓，以部分分离脊髓右侧的组织。使用闭合的镊子从固定镊子所在水平位置开始穿刺组织，尽量靠近脊髓但不要接触脊髓。

沿脊髓重复数次。这将附带一些背根神经节并破坏腹侧器官。从头端开始，在前后两端各保留部分组织。

使用钩状钨针切开脑膜，并沿顶板切开脊髓。将胚胎旋转180度，用相同方法破坏另一侧残留的组织。

然后完全分离脊髓左侧的组织，即最初右侧受损的一侧。将脊髓侧放，用镊子去除大部分残留的间充质组织和背根神经节。用镊子掀开一小片脑膜，形成一个短的瓣膜。此时，脑膜和脊髓呈两层三明治样的组织片。

用镊子将脊髓前部较大的部分固定住。用镊子夹住两个分离的节段，剥离软脑膜。操作时应保持平稳、持续的动作，不均匀的剥离可能会撕裂软脑膜层或脊髓。

如果在牵拉过程中脑膜层破裂，通常无法回收仍附着在脑膜上的脊髓部分，尽管有时仍有可能。在处理更多胚胎之前，使用塑料移液管将分离的脊髓轻轻转移至含有10%热灭活马血清的L-15培养基培养皿中，并置于冰上。

注意更换解剖皿中的培养基为预冷的 L-15，以保持胚胎低温，有助于维持组织完整性。在进行背侧脊髓解剖之前，先从所有胚胎中收集脊髓。开始背侧脊髓解剖时，将一条新分离的脊髓置于含有 10% 加热灭活马血清的 L-15 培养基的培养皿中。

切除较宽的前部组织，其中包含部分后脑。然后将脊髓平铺，像打开的书本一样展开。背侧组织位于展开后脊髓的最外侧区域，用直的钨针固定脊髓，再用L形钨针切取一条宽度约为半侧脊髓五分之一的组织条带；切取更宽的条带可提高产量，但会降低培养物的纯度。

将多个背侧条带转移至含有添加10%马血清的L 15培养基的15毫升锥形管中，并将管子置于冰上。后续操作应在组织培养超净台附近或内部进行。对于这些培养，重要的是提前准备好溶液和设备，通常在解剖之前完成。

移植步骤使用两种不同尺寸的火焰抛光毛细玻璃管，一种直径为原始尺寸的一半，另一种稍小一些。操作开始前，通过抽吸将含血清的培养基吸入两根火焰抛光的玻璃管中，并静置30秒，以使玻璃管内壁预吸附培养基。这一步骤可减少细胞在移植过程中黏附在玻璃管壁上的数量。

首先确认背侧条带已沉降至管底。在层流罩中，用普通移液器吸出大部分上清液。随后用 3 mL 冷的无镁无钙 HBSS 快速洗涤。

让背侧神经管条静置两分钟。然后用意面挑起并移除HBSS。将体积补至4.7毫升。

用预热的HBSS加入0.3毫升2.5%胰蛋白酶，使终浓度为0.15%胰蛋白酶，轻轻混匀，于37°C水浴中孵育7分钟，孵育至一半时间时轻轻混匀一次。孵育结束后，加入DNA酶，使其终浓度为每毫升150单位，同时加入硫酸镁，使其终浓度为0.15%，短暂混匀。

此时，背侧神经管组织应已破碎成碎片。将组织碎片在200 G条件下离心4分钟。用移液器吸走上清液，保留约50至100微升液体于管底。

轻轻弹击离心管以松动沉淀。然后加入 5 mL 温热的 HBSS 洗涤细胞。室温下静置 2 分钟，使细胞沉降。

离心并再次洗涤细胞。此次，用两毫升预热的HBSS重悬细胞。使用直径为一半的火焰抛光移液管，通过缓慢吹打4到6次来 triturate 细胞，将液体吹向管壁以打散较大的细胞团块，从而减少细胞死亡。

避免产生气泡，且不要过度吹打。使用最小的火焰抛光玻璃巴氏吸管，以相同方式缓慢吹打三到四次，进一步解离细胞。无需解离所有细胞团块，因为细胞碎片中的聚集体往往是死细胞形成的。

让组织碎片静置一分钟。然后吸取20 µL上清液，其中应含有可用于血细胞计数板计数的悬浮细胞；通过台盼蓝染色法检测，神经元存活率应至少达到95%。将神经元以适合您实验应用的浓度重悬于Neurobasal铺板培养基中。

16至18小时后，更换为神经基础生长培养基，以避免细胞脱落。神经元培养过程中，应使用移液器轻柔地更换培养基，而不是用真空泵抽吸。以下是将联合神经元接种到PLL包被的玻璃盖玻片上后的代表性结果：接种4小时后，神经元已贴附于表面；接种30小时后，神经元进一步伸展。

大多数神经元具有延伸的轴突，并带有可见的生长锥。这些神经元可直接用于免疫荧光实验。在此示例中，微管标记为绿色，F-肌动蛋白标记为红色，细胞核（NA）标记为蓝色。

我们刚刚向您展示了如何从胚胎脊髓中分离并培养联合神经元。进行此操作时，需要特别注意联合神经元的纯度取决于所分离的背侧条带的厚度。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。