从组织外植体培养的人原代支气管上皮细胞

本文介绍了一种从新分离的人支气管节段中培养和扩增人支气管上皮细胞的实验方案。该方案包含五个部分：编码与刮取、100毫米培养皿的准备、支气管组织修复、支气管组织外植体移植以及纤毛状生长的人支气管上皮细胞的传代，最后是在Transwell小室中培养人支气管上皮细胞。开始实验前请注意，所有操作步骤均需在生物安全柜中进行。

除非另有说明，否则请阅读材料、试剂和准备部分，并确保您已基本准备就绪。以下步骤包括编码、储备液配制、细胞培养、培养基配制、解离溶液、包被和划痕实验。100毫米培养皿的操作应在生物安全柜中进行。

保持所有物品无菌。放置无菌的100毫米培养皿和包被液。用BST移液器将2 mL包被液加入100毫米培养皿中，轻轻旋转混匀以使包被液覆盖皿底。

确保包被液均匀覆盖培养皿底部。用移液器吸出剩余溶液，并用其包被第二个100毫米培养皿。根据需要重复此步骤。

所需培养板的数量随组织外植体的数量而变化。确保包被液均匀覆盖培养板的底部。如图所示。

用培养板盖盖住培养板。将培养板置于培养箱中干燥一至两小时，使用前吸除多余的溶液。对于支气管组织外植体实验，未使用的包被培养板可放入无菌袋中，并于4°C保存以备后续使用。

使用经70%乙醇消毒的清洁、小巧且锋利的剪刀、手术刀和镊子，将组织放入生物安全柜中。用手术刀用力按压涂有涂层的培养板，划出至少四个较深的小X形划痕。如果划痕不够深，组织碎片将无法沉降，会漂浮在注射器外。在生物安全柜外，将组织放入一个35 mm培养皿中。用BSS充分冲洗分离的人支气管组织。

打开支气管组织块。将组织放入BS液中，并转移至无菌的100毫米组织培养皿中，培养皿中应含有DMEM/F12培养基（含1%抗生素-抗真菌剂）。使用锋利的小剪刀将组织剪成2至3毫米见方的小块。

用镊子将一块切割好的组织置于每个 X 形区域的中心，轻轻按压。让组织块或 X 形外植体在培养板上静置数秒，使其轻微贴附。然后缓慢加入 10 µL 完全培养基。如果组织在加入培养基后漂浮，可用镊子将组织推入 X 形的凹槽内，或重新制作一个新的 X 形区域。若原有凹槽不够深，可能需要重新制作新的 X 形区域。

将培养皿放入培养箱中，每三到四天更换一次培养基，直至组织准备移植。当组织周围生长出足够的上皮细胞，覆盖面积达到一至两厘米时，大约需要四周时间。使用直径100毫米的包被并划痕处理的培养皿。

由于某些组织外植体可能无法成功生长，所需培养板的数量取决于您移植的组织块数量。如果您使用的是先前包被并储存在4摄氏度的培养板，请在使用前将其恢复至室温。用镊子小心夹取原培养板中的组织，将其放置于新培养板的中央位置，并轻轻按压。对于无细胞迁出或生长迹象的组织，应予以弃用。

让组织贴附于培养板。加入培养基，孵育数秒。按先前所述加入X的解释。

每100毫米组织培养皿使用2毫升胰蛋白酶和EDTA储备液。将储备液用6毫升无菌0.01摩尔PBS稀释，2毫升储备液加至6毫升PBS中，使胰蛋白酶终浓度为250微克/毫升，EDTA终浓度为100微克/毫升。将外植体转移至新培养皿后，用1至2厘米的细胞环从培养皿中吸除培养基。

向每个100毫米培养皿中加入8 mL温热的稀释液滴，并制成溶液，在37°C的培养箱中放置3至15分钟。频繁检查。

胰蛋白酶消化时间过长会损伤细胞。应在显微镜下观察培养板，确保大多数细胞已脱落；细胞会变圆并脱离，如八微升温育时所示。每孔培养板加入含10%胎牛血清（FBS）的培养基以灭活胰蛋白酶中的EDTA溶液。

将所有培养板的体积合并至一个离心管中，或分装至不同组织对应的离心管中。使用血细胞计数板进行细胞计数，并在100 ×g 条件下离心5分钟。离心后管底将形成细胞沉淀，用完全培养基重悬细胞沉淀，调整至所需细胞浓度。

每 T75 培养瓶接种 200 万至 300 万个细胞，并根据需要加入完全培养基。孵育并更换培养基。每三至四周，细胞在 D75 培养瓶中生长至亚汇合状态。

约四周后，应将细胞提起并扩增，或在亚汇合状态下使用，以防止衰老。首先准备transwell的可渗透膜，使用可放入24孔多孔板中的6.5毫米插入式培养小室。

向膜的两侧加入培养基，底部加入 0.6 mL，顶部加入 0.1 mL。在细胞培养箱中孵育 1 小时。

小心地从膜的两侧移除培养基。先从基底侧开始移除时需格外小心，因为膜容易受损。因此，应将移液管沿培养插件的侧壁缓慢加入培养基，并使用推荐的体积。

若不这样做，会导致培养基泄漏至其他孔中，从而影响细胞接种。在可渗透支持物预孵育后，用移液器小心地将细胞悬液加入膜的顶端侧，对于6.5毫米的孔，每孔加入0.1毫升细胞悬液至膜的顶端侧。在膜的基底侧加入0.6毫升培养基。

从顶侧和基底侧培养细胞10天。为建立良好分化的培养交换，每周更换培养基两次。采用所示方法，移除基底侧液体体积。

首先，更换基底侧体积，在膜的基底侧加入 0.6 mL 培养基。该方法可促进细胞贴附于膜上，并防止细胞长时间暴露于空气中。迅速更换培养基后，立即将培养物放回培养箱。

在第10天通过移除AAL培养基并更换膜基底侧的0.6 mil培养基来建立气液界面。将细胞维持在气液界面培养六周，每周更换培养基两次。在耳类器官建立后四周，纤毛细胞将开始出现。

液体-空气界面。细胞将均匀分化为纤毛细胞。耳类器官液体-空气界面建立后六周。

来自移植体和外植体的具有健康上皮细胞的人支气管节段。在本研究中，九个支气管组织中有八个成功建立了外植体培养。由于其中一个外植体培养物发生感染，上皮细胞环在三至四周内达到一至两厘米的半径。

成功的X外植块被再次培养多达六次。所有成功的培养均显示，在移植开始后48小时内即出现细胞迁移现象，或如B图所示，X外植块中的B细胞呈现出明显的鹅卵石样形态，这是此类上皮细胞的特征。在后续图示中，对外植块来源细胞以及接种于盖玻片上的细胞进行的细胞爬片免疫染色结果显示，所有细胞均表达上皮特异性细胞角蛋白。此处展示的是生长至亚汇合状态的T75培养瓶中的人支气管细胞亚培养物。请注意其鹅卵石样形态。

人支气管细胞亚培养显示对角蛋白和E-钙黏蛋白的免疫染色呈均匀阳性。使用针对其他细胞类型的特异性抗体进行免疫染色，未发现成纤维细胞、间充质细胞或内皮细胞污染培养物的任何迹象。更多细节请参见文中图五及其图注。在可渗透的聚酯膜或transwell中培养的细胞，无论是否存在液-液界面，均可分化为纤毛上皮，如本图所示。若出现形态不同的细胞，应丢弃这些细胞及其移植物。在本方案中，我们介绍了原代人支气管上皮细胞培养与扩增的详细方法。

基于人源细胞的研究对于确定人类肺部疾病机制的重要通路，以及对新型药物进行毒性和药理学筛选至关重要。我们希望本文所述方法能够鼓励您从组织外植体培养人支气管上皮细胞，并将这些细胞应用于您的研究体系中。谢谢您，祝您研究顺利。