Name: 从外植体生长的首要人权支气管上皮细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: 学习从人支气管组织外植体培养原代人支气管上皮细胞的方法，采用气液界面分化培养技术。该方案为研究肺部健康和疾病机制提供了可靠的细胞模型。

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作者非常感谢 Richard Inculet 博士提供支气管组织。研究伦理委员会的批准由汉密尔顿圣约瑟夫医疗中心和西安大略大学/伦敦健康科学中心（David McCormack 博士）、病理学系组织与档案委员会提供。我们还感谢麦克马斯特大学电子显微镜中心的 Ernie Spitzer 为我们 ALI 培养物提供透射电子显微镜图像，以及 Daniela Farkas 提供免疫染色所需的部分材料。本研究由安大略省胸科学会的专项资助支持；Asma Yaghi 博士获得了加拿大安大略省汉密尔顿圣约瑟夫医疗中心 FSORC 奖学金的支持。

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</ol>

本研究中，我们介绍了原代人支气管上皮细胞培养与扩增的详细方法。我们展示了如何将支气管组织的外植体和移植组织在促进上皮细胞生长的培养基中进行培养，从而持续获得人呼吸道上皮细胞，用于未分化（浸没式）和分化（气液界面培养）细胞模型的研究。这些细胞可用于更接近细胞真实生理环境的药物测试系统。非常重要的一点是，必须密切观察从外植体/移植组织中生长出的细胞，并确认其呈铺路石样形态。如果细胞形态不同，则应丢弃该批细胞及相应的外植体/移植组织，仅继续移植成功的组织。在我们的实验条件下，气液界面（ALI）培养的建立时间比先前报道的更长2。每隔一天更换一次气液界面的培养基，可能有助于促进上皮细胞更快地分化以及纤毛的生长。
我们希望本文所述方法能够鼓励您从组织外植体培养人支气管上皮细胞，并将这些细胞应用于您的研究体系中。毕竟，基于人源细胞的研究对于阐明人类肺部疾病机制中的重要通路以及基于细胞的 体外 针对人类细胞的毒性和功效筛选，以实现新药的早期评估并提高成功率。

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白，粉末状</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td>用作包被溶液</td></tr><tr><td>I型胶原蛋白 0.1% 溶液 经无菌过滤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8919</td><td>用作包被溶液</td></tr><tr><td>人血浆来源的纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td>用作包被溶液</td></tr><tr><td>厄尔&amp;rsquo;Earle's 平衡盐溶液（EBSS，无菌）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28888</td><td>用于组织冲洗及包被溶液</td></tr><tr><td>DMEM/Ham F-12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1015</td><td>灭活后，分装并冷冻（-20℃）&amp;#x00B0;C）；必要时使用新鲜的</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂稳定液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>分装至2 ml样品瓶中，冷冻（-20℃）&amp;#x00B0;C）；根据需要使用新鲜的</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td>BSA</td></tr><tr><td>牛垂体提取物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1476</td><td>BPE</td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>EGF</td></tr><tr><td>(&amp;#177;)-肾上腺素 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1635</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>转铁蛋白 人</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>三碘-L-甲状腺原氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9935</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>PBS</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td>用于消毒和清洁</td></tr><tr><td>24孔Transwell</td><td>康宁</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>Corning 细胞培养瓶（T75）CLLBND</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-104</td><td>这些培养瓶具有促进细胞贴附和生长的Cell Bind涂层</td></tr><tr><td>广谱细胞角蛋白单克隆抗体，FITC标记</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3418</td><td>透化：0.2% TRITON X-100/PBS；使用1:250稀释度</td></tr><tr><td>抗体：E-钙黏蛋白（H108）</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-7870</td><td>&lt;强&gt;不要进行透化处理；&lt;/strong&gt; 使用1:250稀释比例，以A21207（Invitrogen）作为二抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 驴抗兔 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21207</td><td>使用1:400稀释度</td></tr><tr><td>抗体：单克隆小鼠抗- &amp;alpha;-平滑肌肌动蛋白-Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td>透化：0.2% TRITON X-100/PBS；使用1:100稀释度</td></tr><tr><td>抗体：波形蛋白（RV202）</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-32322</td><td>透化：0.2% TRITON X-100/PBS；使用1:100稀释比例，以T2402（Sigma-Aldrich）作为二抗</td></tr><tr><td>兔抗小鼠TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2402</td><td>使用1:400稀释度</td></tr><tr><td>抗体：CD31 或 PECAM-1（M-20）</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-1506</td><td>&lt;强&gt;不要进行透化处理；&lt;/strong&gt; 使用1:200稀释的驴抗山羊IgG-FITC作为二抗</td></tr><tr><td>驴抗山羊IgG-FITC</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td></td><td>使用1:100稀释度</td></tr><tr><td>含DAPI的Vectashield封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>避光冷藏；可标记细胞核，并在长期储存期间保持荧光</td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>避光冷藏；长期储存期间可保持荧光活性</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 染色液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6024</td><td>染色细胞核；使用1:10稀释比例，并用Vectashield H-1000封片</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;其他要求：&lt;/strong&gt; 培养箱、生物安全柜（BSC）、离心机、100 mm 培养皿、无菌离心管（15 ml、50 ml 和 2 ml）、无菌移液器吸头、手术刀柄及刀片、小型锐利剪刀、实验服和手套。上述物品可从您常用的供应商处采购。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

从组织外植体培养的人原代支气管上皮细胞

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

人支气管上皮细胞在疾病细胞模型构建以及研究辅料和药理学试剂对人上皮细胞功能与结构影响方面具有重要需求。本文详细描述了从肺部手术（如肺癌或肺减容手术）期间外科医生获取的支气管气道组织中培养支气管上皮细胞的方法。在获得伦理批准和知情同意后，外科医生在完成病理所需取材的基础上，将远离病变区域的支气管组织提供给我们。该组织随后被用作外植体来源，用于体外培养原代支气管上皮细胞。取长约0.5–1 cm、直径≤1 cm的支气管节段，用冷EBSS冲洗，并去除多余的实质组织。将支气管节段剪开并剪碎成2–3 mm大小的组织块3组织块。这些组织块用作原代细胞的来源。将100 mm培养皿用胶原蛋白（30 μg/mL）、纤连蛋白（10 μg/mL）和牛血清白蛋白（10 μg/mL）的混合物包被1–2小时后，在培养皿表面划出4–5道划痕，将组织块置于划痕区域，然后加入适用于上皮细胞生长的培养基（DMEM/Ham F-12，含添加剂），并将培养皿放入37°C、5% CO₂的培养箱中培养2湿润的空气环境中培养。每3-4天更换一次培养基。上皮细胞从组织块向外生长，约3-4周形成直径约1.5 cm的环状结构。通过将组织块转移至新的预包被培养板中，可重复使用多达6次。细胞用胰蛋白酶/EDTA消化解离，收集后计数，并重新接种于T75 Cell Bind培养瓶中以扩增细胞数量。接种200万至300万个细胞的T75培养瓶，约4周可生长至80%融合度。扩增后的人原代上皮细胞可在气液界面培养并诱导其分化。本文所述方法可从新鲜分离的组织中获得大量人支气管上皮细胞，适用于将这些细胞作为疾病模型进行研究，以及用于药理学和毒理学筛选。

本文介绍了一种从人支气管气道组织外植体中培养原代人支气管上皮细胞的详细方法，包括在气液界面条件下进行分化生长。该方法可提供充足的原代细胞来源，用于研究气道上皮在人类肺部健康与疾病中的作用。

人支气管上皮细胞是构建疾病细胞模型以及研究辅料和药理学试剂对……作用所必需的

本文介绍了一种从新分离的人支气管节段中培养和扩增人支气管上皮细胞的实验方案。该方案包括五个部分：编码与划痕、100毫米培养皿的准备、支气管组织修复、支气管组织外植体移植以及纤毛状生长的人支气管上皮细胞的传代，最后是在Transwell小室中培养人支气管上皮细胞。开始实验前请注意，所有操作步骤均需在生物安全柜中进行。除非另有说明，否则请阅读材料、试剂和准备部分，并确保已基本准备就绪。以下步骤包括编码、储备液配制、细胞培养、培养基配制、解离溶液、包被和划痕实验。100毫米培养皿的操作应在超净台内进行。保持所有物品无菌。放置无菌的100毫米培养皿和包被液。用BST移液器吸取2 mL包被液，加入100毫米培养皿中，轻轻旋转以使包被液覆盖皿底。确保包被液均匀覆盖培养皿底部。用移液器吸出剩余溶液，并用其包被第二个100毫米培养皿。根据需要重复此步骤。所需培养皿的数量根据组织外植体的数量而定。确保包被液均匀覆盖培养皿底部。如图所示。用培养板盖子盖住培养板。将培养板置于培养箱中干燥一至两小时，使用前吸除多余的溶液。对于支气管组织外植体实验，未使用的包被培养板可放入无菌袋中，并于4°C保存以备后续使用。使用经70%乙醇喷洒消毒的小型锋利剪刀、手术刀和镊子，并将刮擦涂布板带入生物安全柜中，用手术刀用力按压以形成深度较小的十字划痕，每板至少四个。如果刮痕不够深，组织碎片将无法沉降，会漂浮在生物安全柜外。将组织置于P3培养皿中。用BSS充分冲洗分离的人支气管组织。打开支气管组织块。将组织放入BS液中，并转移至无菌的100毫米组织培养皿中，培养皿中应含有DMEM/F12培养基（含1%抗生素-抗真菌剂）。使用锋利的小剪刀将组织剪成2至3毫米见方的小块。用镊子将一块切割好的组织置于每个 X 形中心位置并轻压。让组织块或 X 形外植体轻轻贴附于培养板上数秒钟。然后缓慢加入 10 µL 完全培养基。如果组织在加入培养基后漂浮，可用镊子将组织推入 X 形的凹槽内，或重新制作一个新的 X 形。如果凹槽不够深，可能需要重新制作新的 X 形结构。将培养皿放入培养箱中，每三到四天更换一次培养基，直至组织准备移植。当组织周围生长出足够的上皮细胞，覆盖面积达到一至二厘米时，大约需要四周时间。使用直径为100毫米的经包被并划痕处理的培养皿。由于某些组织外植体可能无法成功生长，所需培养板的数量取决于您移植的组织块数量。如果您使用的是先前包被并储存在4°C的培养板，使用前应将其恢复至室温。用镊子小心地从原培养板中取出组织，放置于新培养板的中心位置，并轻轻按压。对于无细胞迁出或生长的组织，应予以弃用。让组织贴附于培养板。加入培养基，孵育数秒。按先前所述，加入用于X实验的试剂。每100毫米组织培养皿使用2毫升胰蛋白酶和EDTA储备液。将储备液用6毫升无菌0.01摩尔PBS稀释，2毫升储备液加6毫升PBS，使胰蛋白酶终浓度为250微克/毫升，EDTA终浓度为100微克/毫升。将外植体转移至新培养皿后，用1至2厘米的细胞环从培养皿中吸除培养基。向每个100毫米培养皿中加入8 mL温热的稀释液滴，并制成溶液，在37°C的培养箱中放置3至15分钟。频繁检查。胰蛋白酶消化时间过长会损伤细胞。应在显微镜下观察培养板，确保大多数细胞已脱落；细胞会变圆并脱离，如八微升温育时所示。每孔加入含10%胎牛血清（FBS）的培养基以灭活胰蛋白酶中的EDTA溶液。将所有培养板的体积合并至一个离心管中，或按不同组织分装至多个离心管中。使用血细胞计数板进行细胞计数，并在100 ×g 条件下离心5分钟。离心后管底将形成细胞沉淀，用完全培养基重悬细胞沉淀，调整至所需细胞浓度。每 T75 培养瓶接种 200 万至 300 万个细胞，并根据需要加入完全培养基。孵育并更换培养基。每三至四周，细胞在 D75 培养瓶中生长至亚汇合状态。约四周后，应将细胞提起并扩增，或在亚汇合状态下使用，以防止衰老。首先准备Transwell的可渗透膜，使用可放入24孔多孔板中的6.5毫米插入式小室。向膜的两侧加入培养基，底部加入 0.6 mil，顶部加入 0.1 mil。在细胞培养箱中孵育 1 小时。小心地从膜的两侧移除培养基。先从基底侧开始移除时需格外小心，因为膜容易受损。因此，应将移液管沿培养插件的侧壁缓慢加入培养基，并使用推荐的体积。若不这样做，会导致培养基泄漏至其他孔中，从而污染细胞。在可渗透支持物预孵育后，用移液器将细胞悬液小心地加入6.5毫米孔膜的顶侧，每孔加入0.1毫升细胞悬液至膜的顶侧。在膜的基底侧加入0.6毫升培养基。从顶侧和基底侧培养细胞10天。为建立良好分化的培养交换，每周更换培养基两次。采用所示方法，移除基底侧液体体积。首先，更换基底侧体积，在膜的基底侧加入 0.6 mL 培养基。该方法可促进细胞贴附于膜上，并防止细胞长时间暴露于空气中。迅速更换培养基后，将培养物放回培养箱。在第10天通过移除AAL培养基并更换膜基底侧的0.6 mil培养基来建立气液界面。将细胞维持在气液界面条件下六周，每周更换两次培养基。在耳类器官建立后四周，纤毛细胞将开始出现。液体界面。细胞将均匀分化为纤毛细胞。耳部液体界面建立六周后。来自移植体和外植体的具有健康上皮细胞的人支气管节段。在本研究中，九个支气管组织中有八个成功建立了外植体培养。由于其中一个外植体培养物发生感染，其余上皮细胞环在三至四周内扩展至一至两厘米半径。成功的X外植块被再次培养多达六次。所有成功的培养均显示，在移植开始后48小时内即出现细胞迁移现象，或如B图所示，X外植块中的B细胞呈现出明显的鹅卵石样形态，这是此类上皮细胞的特征性表现。在后续图示中，对外植块来源细胞以及接种于盖玻片上的细胞进行的细胞爬片免疫染色结果显示，所有细胞均表达上皮特异性细胞角蛋白。此处展示的是生长至亚汇合状态的T75培养瓶中的人支气管细胞亚培养物。请注意其鹅卵石样形态。人支气管细胞在亚培养后对角蛋白（keratin）表现出均匀的阳性免疫染色，而使用针对其他细胞类型的特异性抗体进行免疫染色时，未发现成纤维细胞、间充质细胞或内皮细胞污染的任何迹象。更多细节请参见文中图五及其图注。在可渗透的聚酯膜或transwell中培养的细胞，无论是否存在液-液界面，均可分化为纤毛上皮，如本图所示。若出现形态不同的细胞，则应丢弃这些细胞及其后续传代培养物。在本方案中，我们介绍了原代人支气管上皮细胞的培养与扩增的详细方法。基于人类细胞的研究对于确定人类肺部疾病机制的重要通路，以及对新药进行毒性和药理学筛选至关重要。我们希望本文所描述的方法能够鼓励您从组织外植体中培养人支气管上皮细胞，并将这些细胞应用于您的研究体系中。谢谢您，祝您研究顺利。

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