Name: 综合植物细胞壁成分分析（木质纤维素生物质）第二部分:碳水化合物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学习植物细胞壁碳水化合物成分分析方法，通过弱酸水解和GC-MS技术定量测定基质多糖与结晶纤维素含量。该方案为优化生物燃料原料选择提供可靠技术支持。

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我们感谢 Matthew Robert Weatherhead 提供的出色技术服务，感谢威斯康星大学的 John Ralph 提供的宝贵建议、讨论以及杨木样品。本工作由美国能源部科学办公室基础能源科学司化学科学、地球科学和生物科学处（资助号 DE-FG02-91ER20021）以及美国能源部（DOE）大湖生物能源研究中心（DOE 科学办公室 BER 项目 DE-FC02-07ER64494）资助。

1. 细胞壁的分离
<ol>
	<li>使用Retsch研磨仪（1分钟，25 Hz），将约60-70 mg的风干或冷冻干燥植物材料与5.5 mm不锈钢研磨珠置于2 ml Sarstedt螺口管中进行粗研磨。另一种方法是使用高通量研磨与分配机器人iWall，详见第一部分3。</li>
	<li>在继续细胞壁分离步骤前，移除不锈钢研磨珠 
细胞壁材料制备的详细方案见第一部分3。为完整起见，此处列出该方案的文字步骤。</li>
	<li>向样品中加入1.5 ml 70%乙醇水溶液，并充分涡旋混匀</li>
	<li>在10,000 rpm下离心10分钟，使醇不溶性残渣沉淀</li>
	<li>吸除或倾倒上清液</li>
	<li>向残渣中加入1.5 ml氯仿/甲醇（1:1 v/v）溶液，并充分振荡试管以重悬沉淀</li>
	<li>在10,000 rpm下离心10分钟，吸除或倾倒上清液</li>
	<li>用500 µl丙酮重悬沉淀</li>
	<li>在35°C下用气流吹干溶剂至完全干燥 
如需保存，干燥样品可在室温下储存，直至后续处理。</li>
	<li>为启动样品中淀粉的去除，将沉淀重悬于1.5 ml 0.1 M乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中。</li>
	<li>盖紧Sarstedt管，于加热块中80°C加热20分钟。</li>
	<li>将悬浮液置于冰上冷却</li>
	<li>向沉淀中加入以下试剂：35 µl 0.01%叠氮化钠（NaN3）、35 µl淀粉酶（50 µg/1 mL H2O；来源于芽孢杆菌属，SIGMA）、17 µl普鲁兰酶（18.7单位，来源于嗜酸普鲁兰芽孢杆菌，SIGMA）。盖紧管盖并充分涡旋混匀。</li>
	<li>将悬浮液在37°C摇床中过夜孵育。将试管水平放置有助于提高混合效果。</li>
	<li>将悬浮液在加热块中100°C加热10分钟，以终止酶解反应。</li>
	<li>离心（10,000 rpm，10分钟），弃去含有可溶性淀粉的上清液</li>
	<li>用1.5 ml水洗涤剩余沉淀三次，每次均需涡旋混匀、离心并倾去洗涤水。</li>
	<li>用500 µl丙酮重悬沉淀</li>
	<li>在35°C下用气流吹干溶剂至完全干燥。必要时可用刮勺在管内将材料打散，以促进更充分干燥。 
所得干燥材料即为分离的细胞壁（木质纤维素）。如需保存，干燥样品可在室温下储存，直至后续处理。</li>
</ol>
2. 基质多糖组成
该方法本质上是对 Albersheim 发表的方法的一种改进1。
<ol>
 <li>为测定壁材料的单糖组成，使用手动方式或利用iWall（一种机器人研磨和称重装置）以高通量方式，将2 mg细胞壁材料称量至2 ml Starstedt管中。</li>
	<li>加入20 μL肌醇溶液（5 mg/mL）作为内标。对于2 mg的细胞壁样品，建议加入100 μg。</li>
	<li>用250 μL丙酮冲洗管壁，使细胞壁材料沉于管底，并在气流下轻轻蒸发丙酮。</li>
	<li>进行弱酸水解时，向每个样品中加入250 μL 2 M三氟乙酸（TFA）。添加TFA时应小心，确保无样品溅至管壁上。</li>
	<li>盖紧管盖，在加热块中于121°C孵育90分钟。</li>
	<li>将加热块及样品置于冰上冷却。</li>
	<li>以10,000 rpm离心10分钟。</li>
	<li>转移100 μL含基质多糖来源单糖的酸性上清液至玻璃螺口小瓶中，注意勿扰动沉淀物。沉淀物可用于下述结晶纤维素测定（见第3步）。</li>
	<li>在蒸发装置中，用温和气流将玻璃管中的TFA吹干。</li>
	<li>加入300 μL 2-丙醇，涡旋混匀后于25°C蒸发（重复共三次）。</li>
	<li>醇糖乙酸酯衍生化步骤的第一步是将单糖还原为其相应的醇糖。为此，向每个干燥样品中加入200 μL硼氢化钠溶液。每次需新鲜配制该溶液，方法为每1 mL 1 M氢氧化铵中加入10 mg硼氢化钠。</li>
	<li>将玻璃小瓶在室温下静置1.5小时。</li>
	<li>加入150 μL冰醋酸以中和溶液。</li>
	<li>涡旋混匀后于25°C蒸发。</li>
	<li>加入250 μL乙酸/甲醇（1:9, v/v），涡旋混匀后于25°C蒸发。</li>
	<li>加入250 μL甲醇，并在气流下蒸发（重复共三次）。</li>
	<li>为进行醇糖的乙酰化，加入50 μL乙酸酐和50 μL吡啶，涡旋混匀后在加热块中于121°C孵育20分钟。</li>
	<li>在等待温度降至约室温期间，用冰对样品进行冷却。</li>
	<li>在室温下用温和气流蒸发试剂。注意：醇糖乙酸酯具有高度挥发性。</li>
	<li>加入200 μL甲苯，并在气流下蒸发（重复三次）。</li>
	<li>最后步骤为提取醇糖乙酸酯。首先加入500 μL乙酸乙酯，轻轻摇晃。</li>
	<li>加入2 mL水，盖紧管盖后涡旋混匀。</li>
	<li>以2,000 rpm离心5分钟，以获得清晰的分层（上层为乙酸乙酯，下层为水）。</li>
	<li>用移液器吸取50 μL乙酸乙酯层至带有内插管的GC/MS小瓶中。</li>
	<li>向GC小瓶中加入100 μL丙酮稀释并盖紧。若样品浓度过高，可调整进样量和稀释体积，以避免GC/MS过载。 若不立即进行GC/MS分析，GC小瓶可在4°C下保存。</li>
	<li>样品注入配备四极杆质谱仪的气相色谱仪中，但也可使用火焰离子化检测器。采用Supelco SP-2380（30 mm × 0.25 mm × 0.25 μm膜厚）色谱柱，设置4分钟溶剂延迟，载气流速为1.5 mL/min。进样后采用以下程序升温：初始温度160°C保持2分钟；以20°C/min升至200°C并保持5分钟；再以20°C/min升至245°C并保持12分钟；快速升至270°C并保持5分钟，随后冷却至初始温度160°C。通过标准品的质谱图和/或保留时间鉴定峰。单糖含量根据标准曲线进行定量。</li>
</ol>
3. 结晶纤维素含量
该方法基本依据Updegraf8所述进行。本实验可采用多种起始材料：分离的细胞壁材料（见1）或已用2M TFA处理过的壁材料（见2.8），包括酸处理后立即获得的残余沉淀（见2.8），或经2-丙醇洗涤并干燥的TFA沉淀。
<ol>
 <li>在螺口玻璃管中的TFA沉淀物中加入1 ml Updegraff试剂（乙酸:硝酸:水，8:1:2 v/v）。</li>
	<li>盖紧管盖，涡旋混匀，然后在加热块中于100°C加热30分钟。经过此处理后，只有结晶纤维素保留在沉淀中且不溶解。</li>
	<li>将样品在冰上冷却至室温或更低温度</li>
 <li>以10,000 rpm离心样品15分钟</li>
 <li>弃去上清液，注意不要扰动沉淀，避免损失沉淀物。为此，建议在管中保留约150 µl上清液。</li>
	<li>加入1.5 ml水，振荡混匀，离心后弃去上清液，操作同上</li>
	<li>使用1.5 ml丙酮重复洗涤步骤3次</li>
	<li>用空气非常轻柔地吹干沉淀，或在实验台上静置过夜自然干燥</li>
	<li>此时沉淀（结晶纤维素）通过所谓的Saeman水解法完全水解为葡萄糖。为此，向Sarstedt管中加入175 µl 72%硫酸</li>
	<li>室温孵育30分钟，涡旋混匀后再孵育15分钟</li>
	<li>加入825 µl水并涡旋混匀</li>
	<li>以10,000 rpm离心样品5分钟。管中可能残留少量棕色不溶物质，即木质素。</li>
	<li>采用比色蒽酮法测定上清液中的葡萄糖含量。该检测在96孔聚苯乙烯微孔板中进行。</li>
	<li>制备标准曲线时使用1 mg/ml葡萄糖储备液（储存于0°C），通过移液分别将0、2、4、6、8和10 µl加入不同的适当孔中，制得0、2、4、6、8和10 µg的标准品，每个孔用水补足至100 µl。</li>
	<li>将各待测样品上清液10 µl与90 µl水分别加入同一微孔板中的不同孔（与标准品同板）。</li>
	<li>每孔加入200 µl新配制的蒽酮试剂（蒽酮溶于浓硫酸，2 mg蒽酮/ml硫酸）</li>
	<li>将微孔板置于烘箱中（使用铝制导热板）于80°C加热30分钟。含葡萄糖的样品颜色由黄色变为蓝绿色。</li>
	<li>让微孔板冷却至室温，并充分振荡混匀。</li>
	<li>使用微孔板读数仪在625 nm波长处读取吸光度。</li>
	<li>根据与同板上建立的标准曲线比较吸光度值，计算葡萄糖含量（从而推算出结晶纤维素含量）。</li>
</ol>
4. 代表性结果
图2展示了一个细胞壁分析的示例。在此案例中，杨树茎秆（木材）按照本方案部分所述的各种步骤进行分析。通过一个色谱图示例突出了基质多糖的组成，该图鉴定了植物细胞壁中典型的糖类成分：岩藻糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖（以及内标肌醇）。杨树中半纤维素的主要组分是木聚糖，这由其较高的木糖含量得以证实。然而，这些糖类的丰度会因所用原料的不同而有所变化4。本分析中的葡萄糖来源于半纤维素中的木葡聚糖以及无定形纤维素。根据该分析，数据可以以摩尔百分比（mol%）或每毫克细胞壁材料中的微克数（μg/mg）（或干重）表示。结晶纤维素的含量不言自明，其占细胞壁干重的比例通常在20%至50%之间。根据本文及第一部分3所呈现的结果，杨树木材的木质纤维素组成为：21%木质素、30%半纤维素和41%结晶纤维素。其余成分为灰分。
<img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig1.jpg" alt="细胞壁分离流程图；通过水解、气相色谱-质谱联用（GC/MS）和测定法分析木质素和多糖。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1：木质纤维素分析概览。 从粗制干燥的植物材料中分离细胞壁（木质纤维素）。将壁材料称重后分装成等分试样，用于不同的测定。在用弱酸（2M TFA）处理壁材料，将释放出的单糖衍生化为醛糖醇乙酸酯后，通过气相色谱-质谱联用法（GC-MS）分析基质多糖的组成。弱酸处理后的残渣用所谓的Updegraff试剂洗涤，仅留下不溶性结晶纤维素。纤维素经硫酸溶解后，通过比色测定法测定其葡萄糖含量以实现定量。同时，木质素的含量和组成可按照第一部分3所述方法进行测定。
<img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig2.jpg" alt="气相色谱结合单糖组成柱状图；多糖含量分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2：杨木的全面木质纤维素分析。 对来自杨树（Populus tremoloides）的木屑进行了所述方案的处理。 左上：基质多糖组成；Fuc 岩藻糖；Rha 鼠李糖；Ara 阿拉伯糖；Xyl 木糖；Man 甘露糖；Gal 半乳糖；Glc 葡萄糖；inositol 内标物。

<ol><li>Albersheim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+analysis+of+sugars+in+plant+cell+wall+polysaccharides+by+gas-liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography.</a> Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).</li>
<li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulosic+Biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellulosic Biofuels.</a> Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).</li>
<li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+%28Lignocellulosic+biomass%29%2C+Part+I%3A+Lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).</li>
<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant-cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward a systems approach to understanding plant-cell walls.</a> Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).</li>
<li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterisation+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar%3A+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endotransglycosylases%5BTitle%5D)+AND+%22Biocatalysis+and+Biotransformation%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li>
<li>UPDEGRAF, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEMIMICRO+DETERMINATION+OF+CELLULOSE+IN+BIOLOGICAL+MATERIALS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS.</a> Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).</li>
</ol>

所述方法可实现对木质纤维素类植物生物质成分的快速定量评估。该方法可用于测定此类材料的组成，包括基质多糖（即半纤维素）的糖类组成以及结晶纤维素含量。不同分析方法每人每天的处理通量有所不同。采用此处描述的实验方案，每人每天可处理20个样品用于测定基质多糖组成，或处理30个样品用于测定结晶纤维素含量。由于所得数据具有定量性质，因此可据此评估最优的原料作物、品种或基因型在生物燃料生产中的适用性。

<table><tbody><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>肌醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>吡啶</td><td>JT Baker</td><td>3348-01</td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Spectromax Plus 384</td><td>Molecular Devices</td><td>Plus384</td><td></td></tr><tr><td>气相色谱-质谱联用仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>7890A GC/5975C MSD</td><td></td></tr><tr><td>5.5毫米不锈钢球</td><td>Salem Ball Company</td><td>(N/A)</td><td></td></tr><tr><td>96孔板散热板</td><td>Biocision</td><td>Coolsink 96F</td><td></td></tr><tr><td>Retsch研磨仪</td><td>Qiagen</td><td>TissueLyser II</td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td>Techne</td><td>Dri-block DB-3D</td><td></td></tr><tr><td>样品浓缩仪</td><td>Techne</td><td>FSC400D</td><td></td></tr></tbody></table>

植物细胞壁（木质纤维素生物质）的全面组成分析 第二部分：碳水化合物

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

工业和社会对可再生、碳中和及可持续原材料的需求已成为21世纪最紧迫的问题之一。这重新激发了人们将植物产品用作工业原料以生产交通用液体燃料的兴趣2以及其他产品，例如生物复合材料6. 植物生物质仍然是地球上最大的未开发资源之一4它主要由细胞壁构成，细胞壁中含有富含能量的聚合物，包括纤维素、多种半纤维素以及多酚类木质素。5因此有时被称为木质纤维素类物质。然而，植物细胞壁在进化过程中形成了对降解的抗性，因为细胞壁对整个植物的强度和结构完整性具有重要作用。尽管细胞壁具有必要的刚性，但它是一个高度动态的实体，具有代谢活性，并在植物生长与分化等多种细胞活动中发挥关键作用。5. 由于细胞壁具有多种功能，不同植物种类以及同一植物内不同细胞类型的细胞壁在结构上表现出极大的多样性4因此，根据生物炼制所使用的作物种类、作物品种或植物组织的不同，需要对化学/酶法解聚以及后续将各种糖类发酵为液体生物燃料的加工步骤进行调整和优化。这一事实凸显了对植物生物质原料进行充分表征的必要性。本文介绍一种全面的分析方法，可用于测定木质纤维素的组成，并适用于中高通量分析（图1）。该方法首先制备脱淀粉的细胞壁材料，然后将所得的木质纤维素组分进行分离，以测定半纤维素及其他基质多糖的单糖组成1，以及结晶纤维素的含量7. 第一部分讨论了分析木质纤维素生物质中木质素组分的实验方案3.

植物生物质是一种主要的碳中性可再生资源，可用于生物燃料的生产。植物生物质主要由细胞壁组成，这是一种结构复杂的复合材料，称为木质纤维素。本文描述了一种对细胞壁来源的碳水化合物含量和组成进行全面分析的实验方案。

工业和社会对可再生、碳中和及可持续原材料的需求已成为21世纪最紧迫的问题之一。

测定植物细胞壁中基质多糖的组成以及结晶纤维素含量，首先从干燥的植物材料开始，经过一系列提取处理。所得材料仅包含细胞壁，随后对其进行分步分析以确定基质多糖的组成。将细胞壁材料用弱酸处理，水解非结晶性多糖（主要为半纤维素），使其降解为单糖。随后将单糖转化为相应的挥发性醛醇乙酸酯，再通过气相色谱-质谱联用技术进行分析和定量，以测定结晶纤维素含量。细胞壁经图示试剂处理，该试剂为一种酸混合物，可去除非晶态壁组分。剩余的结晶纤维素被降解为其单体葡萄糖，可通过比色法进行测定。另一部 JoVE 视频出版物《植物细胞壁综合组成分析，第一部分：木质素》展示了木质素含量和组成的测定方法。大家好，我是马歇龙州立大学大湖生物能源研究中心细胞壁分析平台负责人马库斯·保莱（Marcus Pauley）。我是细胞壁分析平台经理克里夫·福斯特（Cliff Foster）。今天我们将向您展示如何测定存在于不同同型纤维素植物细胞壁材料中纤维素的多糖组成。在大湖生物能源研究中心，我们致力于开发将这些糖类转化为生物燃料的技术。为了确定最优的植物原料，我们首先需要评估这种生物质中所含糖类的种类和丰度。在另一段名为《植物细胞壁全面组分分析，第一部分：木质素》的视频中，我们将重点介绍多酚分析。现在就开始吧。首先通过分离细胞壁来启动该实验流程。使用5.5毫米不锈钢研磨珠，在2毫升SAR TED螺口管中粗略研磨60至70毫克干燥的植物材料。作为高通量替代方法，可使用REM研磨仪，并按照第一部分所述，采用名为eyewall的研磨与分配机器人。研磨完成后，取出不锈钢研磨珠。继续按照第一部分及随附的书面实验方案所示，分离细胞壁并去除残留淀粉。称取2毫克DS淀粉细胞壁材料，放入2毫升离心管中。执行此操作的高通量方法是使用眼壁机器人（eyewall robot）。机器人取一支含有研磨后植物材料的试管，并在试管底部打一个小孔。穿孔后的试管被放置在VI进样器上。一支空试管被置于天平上，并通过振动移至VI进样器下方，物料随即从上方装有样品的试管小孔中渗出，进入下方的空试管，直至达到所需物料量。加入100微克丙酮醇作为内标。用丙酮冲洗管壁，使细胞壁材料聚集在管底，并在气流下非常温和地蒸发丙酮。接下来，进行弱酸水解。向每个样品中小心加入 250 微升 2 摩尔的三氯乙酸（TCA）或三氟乙酸（TFA），确保无物质溅到管壁上。盖紧管盖，于加热块中 121 摄氏度孵育 90 分钟。随后将加热块及样品置于冰上冷却，并以 10,000 转/分钟离心 10 分钟。将含有基质多糖溶解后糖类的100微升酸性上清液转移至螺口小瓶中，注意不要扰动沉淀物质。该沉淀可用于结晶纤维素测定。在蒸发装置中，用温和的气流吹扫玻璃试管，使三氟乙酸（TFA）挥发除去。加入300微升正丙醇以去除过量酸，涡旋混匀后在25摄氏度下蒸发。重复此步骤共三次。为通过气相色谱鉴定单糖，需进行醛醇乙酸酯衍生化反应。首先，将单糖还原为其相应的开环醛醇，然后进行乙酰化。有关详细说明，请参阅随附的书面实验方案。该操作流程的每一步均遵循前述方案，依次加入试剂、孵育、在气流下蒸发，随后通过多种洗涤步骤去除过量试剂。最后步骤中，提取醛醇乙酸酯。首先，加入 500 微升乙酸乙酯并轻轻涡旋。然后加入 2 毫升水，盖紧管盖后涡旋混合，以 2000 转/分钟离心 5 分钟，得到清晰的分层：上层为含有醛醇乙酸酯的乙酸乙酯相，下层为水相。用移液器吸取 50 微升乙酸乙酯层至含内插管的 GC-MS 小瓶中，再加入 100 微升丙酮稀释。GC 小瓶可于 4 摄氏度保存。如果气相色谱-质谱（GCMS）分析不能立即进行，则需将样品注入配备四极杆质谱仪的气相色谱仪中。有关色谱柱及运行参数的详细信息，请参考随附的书面实验方案。测定结晶纤维素含量的起始材料可以是分离得到的细胞壁材料，也可以是经弱酸三氟乙酸（TFA）处理后的壁材料，后者可在酸处理后立即使用，或以可储存的干燥形式使用。如前所述，使用异丙醇去除过量三氟乙酸（TFA）后，向两个M萨氏管中的TFA沉淀中加入1 M的去垢剂溶液1 mL，该溶液由乙酸、硝酸和水配制而成，添加体积比为8:1至2:1。盖紧管盖，涡旋混匀，并在100摄氏度的加热块中加热30分钟。经此处理后，仅有结晶纤维素保留在沉淀中。将所有其他多糖样品在冰上或更低温度下冷却，待其升至室温或更冷后进行水解。随后将样品在10,000 RPM条件下离心15分钟，离心后弃去上清液，注意不要扰动沉淀，确保沉淀物未被移除。为此，每管中保留约150微升上清液，并用水反复洗涤沉淀数次。接下来，使用浓硫酸进行同酸水解，以将晶体和纤维素沉淀完全水解为葡萄糖。首先，向萨尔塔管中加入175微升72%的硫酸，并在室温下孵育30分钟。初始孵育结束后，涡旋混匀样品，再继续孵育15分钟。然后加入825 µL水，涡旋混匀，并以10,000 RPM离心样品5分钟。离心后，试管中可能残留一些呈棕色的可溶性物质，主要为木质素，而葡萄糖则存在于上清液中。使用比色蒽酮法测定上清液中的葡萄糖含量。该实验在96孔聚苯乙烯微孔板中进行。按照随附书面方案中的说明，以复孔方式建立葡萄糖标准曲线。取每份样品上清液10微升，分别与90微升水混合，加入同一微孔板的不同孔中，随后每孔加入200微升新鲜配制的试剂，完成样品的制备。接下来，将酶标板置于烘箱中，使用铝制导热板，在 80 摄氏度下加热 30 分钟。加热完成后，观察到含葡萄糖的样品颜色由黄色变为蓝绿色。待酶标板冷却至室温后，充分振荡混匀。使用微孔板读数仪在625纳米处读取吸光度。葡萄糖（纤维素的基本组成单元）的含量根据与同一块板上建立的标准曲线比较后的吸光值进行计算。以下是杨木样品多糖分析的一些代表性结果。通过标准品的质量谱图和/或保留时间来鉴定气相色谱图中的峰。单糖的定量基于标准曲线。基质多糖的糖分析显示木糖含量丰富，代表半纤维素木聚糖，但也存在其他糖类。根据分析，杨树材料中有40%为结晶纤维素。请注意，这些含量和组分在不同植物之间或同一植物的不同解剖结构之间可能存在差异。我们刚刚向您展示了如何测定木质纤维素生物质的多糖含量及其组分，以用于多酚木质素的分析。敬请关注第一部分。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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细胞外多糖的寡糖质谱分析（OLIMP）

介绍了一种基于共聚焦拉曼显微技术的方法，可实现对植物细胞壁中木质素的无标记可视化，并可用于比较不同组织、样品或物种间的木质化程度。...

无标记 原位 植物细胞壁木质化的成像

本文介绍了一种称为综合微阵列多聚物谱型分析（Comprehensive Microarray Polymer Profiling,...

利用微阵列对植物细胞壁多糖进行糖谱分析

本研究的目的是利用稀水悬浮液中分离出的纳米纤维素纤维和木质素，通过逐层自组装方法构建合成植物细胞壁组织。 采用石英晶体微天平和原子力显微镜等表面测量技术，监测聚合物-聚合物纳米复合材料的形成过程。...

仿生木材：由纳米纤维素、木质素和合成聚阳离子制备的自支撑薄膜

采用双链RNA干扰（dsRNAi）技术下调玉米肉桂酰辅酶A还原酶（ZmCCR1）基因，以降低植株木质素含量。通过显微分析观察细胞壁中木质素的下调情况，并采用克拉森法进行定量测定。同时分析半纤维素和结晶纤维素的组分变化。...

木质素下调 Zea mays 通过dsRNAi和Klason木质素分析

植物细胞壁的结构和化学特性被用于评估生物燃料和生物材料的理想原料。传统方法在处理大规模数据集时存在局限性。这些高通量的预处理、酶解糖化以及热解-分子束质谱分析方法，能够在减少实验时间和成本的同时，对大量生物质样品进行比较分析。...

木质纤维素生物质抗降解性变异的高通量筛选：总木质素、木质素单体及酶解糖释放

本实验方案旨在介绍一种利用拉曼成像结合多元分析方法，对植物细胞壁中的木质素、纤维素和半纤维素进行可视化的一般性方法。...

结合拉曼成像与多元分析可视化植物细胞壁中的木质素、纤维素和半纤维素

本文描述了一种以甘露聚糖为例，通过凝胶电泳（PACE）进行多糖结构分析的实验方案。...

利用PACE对植物细胞壁甘露聚糖的结构表征

本文介绍了一种用于制备13C,15N标记的真菌和植物样品的方案，适用于多维固态核磁共振波谱和动态核极化（DNP）研究。...

利用动态核极化固态核磁共振技术进行结构解析的真菌与植物材料制备

Updegraff 法是用于纤维素测定的最广泛使用的方法。本演示的主要目的是提供一种详细的 Updegraff...

利用Updegraff法测定植物生物质中的结晶纤维素含量

学习植物细胞壁碳水化合物成分分析方法，通过弱酸水解和GC-MS技术定量测定基质多糖与结晶纤维素含量。该方案为优化生物燃料原料选择提供可靠技术支持。

植物细胞壁（木质纤维素生物质）的全面组成分析第二部分：碳水化合物

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植物细胞壁（木质纤维素生物质）的全面组成分析 第二部分：碳水化合物

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