综合植物细胞壁成分分析（木质纤维素生物质）第二部分:碳水化合物

确定植物细胞壁的基质多糖组成和结晶纤维素含量从干燥的植物材料开始，对其进行各种提取。所得材料仅由细胞壁组成，然后被分裂以确定基质多糖组成。壁材用弱酸处理以水解非结晶多糖，这些多糖主要是将血纤维素转化为它们的单糖。

然后将单糖衍生成相应的挥发性乙酸羟醛，然后通过与质谱仪联用的气相色谱法进行分析和定量，以测定结晶纤维素。内容物壁用图形试剂处理，图形试剂是一种酸的混合物，可去除非结晶壁成分。剩余的结晶纤维素降解成其单体葡萄糖，可以进行测定。

木质素含量和组成的测定在另一篇题为"植物细胞壁的综合成分分析，第一部分木质素"的 J 视频出版物中进行了演示。大家好，我是密歇根州立大学五大湖生物能源研究中心 Wall 分析设施的负责人。我是 Cliff Foster，Cell Wall Analytical 设施的经理。

今天，我们将向您展示如何确定植物细胞壁材料中存在的多糖的组成，即各种 Homo 纤维素中的纤维素。在五大湖生物能源研究中心，我们开发将这些糖转化为生物燃料的技术。为了确定最佳的植物原料，我们首先需要评估该生物质中存在的糖类的种类和丰度。

在另一个题为"植物细胞壁的综合成分分析"的视频中，第一部分木质素，我们将重点介绍多酚分析。那么让我们开始吧。通过分离细胞壁开始此过程。

在 2 mil SAR TED 螺帽管中，用 5.5 毫米不锈钢球研磨大约 60 至 70 毫克的干燥植物材料。使用 REM 研磨机作为高通量替代方案，使用称为眼墙的研磨和分配机器人，如第一部分所述。研磨完成后，取出钢球。

继续分离细胞壁并去除残留淀粉，如第一部分所示，如随附的书面方案所述。称取 2 毫克 DS 淀粉细胞壁材料放入双研磨管中。执行此任务的一种高吞吐量方法是 eyewall robot。

机器人拿起一根装有植物研磨材料的管子，并在管子底部戳一个孔。然后将穿孔管放置在 VI 进料器上。将空管放在天平上，并通过振动材料通过加载的上管上的孔渗入空底管，直到积累所需量的材料，在 VI 给料机下方移动。

添加 100 μg 乙酰醇作为内标。用丙酮冲洗管壁，以收集管底部的细胞壁材料，并在气流下非常温和地蒸发丙酮。接下来，进行弱酸水解。

小心地向每个样品中加入 250 微升 250 微升的双摩尔三氯乙酸或 TFA，确保没有物质溅到管壁上。盖紧试管，在 121 摄氏度的加热块中孵育 90 分钟。然后将加热块和样品放在冰上冷却，并以 10， 000 RPM 的速度离心试管 10 分钟。

将 100 微升含有基质多糖溶解糖的酸性上清液转移到螺旋盖样品瓶中，确保不要干扰沉淀材料。该沉淀可用于结晶纤维素测定。在蒸发装置中，在温和的气流下，在玻璃管中蒸发 TFA。

加入 300 微升双丙醇以去除多余的酸涡旋并在 25 摄氏度下蒸发。重复总共 3 次。为了能够通过气相色谱鉴定单糖，进行乙酸羟醛衍生化。

首先，将单糖还原为相应的开环醛醇，然后将其乙酰化。有关详细说明，请参阅随附的书面协议。该程序的每个步骤都遵循前面显示的方案，加入试剂孵育，在气流下蒸发，然后通过各种洗涤步骤去除多余的试剂。

在最后的步骤中，提取乙酸羟醛。首先，加入 500 微升乙酸乙酯并轻轻旋转。然后加入 2 密耳水，盖上试管并涡旋，以 2000 RPM 的速度离心试管 5 分钟，以获得透明的单独层，顶部含有乙酸滴露，底部装有水，将 50 μL 乙酸乙酯层移液到带插入物的 GCMS 样品瓶中，向 GC 样品瓶中加入 100 μL 丙酮进行稀释，GC 样品瓶可在 4 °C 下储存。

如果 GCMS 分析没有立即进行，请将样品注入配备四重质谱仪的气色相机中。有关运行的列和详细信息，请查阅随附的书面方案。测定结晶纤维素含量的起始材料可以是分离的细胞壁材料或已经用弱酸 TFA 处理的壁材料，可以在酸处理后立即使用，也可以以可储存的干燥形式使用。

如前所述，用异丙醇去除过量的 TFA 后，将 TFA 沉淀物加入两个 M sar 中的 TFA 沉淀中，加入一管由乙酸、硝酸和水组成的 M up degra 试剂，加入 8 比 1 的体积比。盖紧试管，涡旋并在加热块上以 100 摄氏度加热 30 分钟。作为这种处理的结果，颗粒中只剩下结晶纤维素。

所有其他多糖都是在冰上水解冷却样品，置于冰上至室温或更冷。然后在离心后以 10， 000 RPM 的速度离心样品 15 分钟，弃去上清液，确保沉淀不受干扰，并且没有从沉淀中去除任何物质。为此，在试管中留下大约 150 微升的上清液，用水洗涤沉淀数次。

接下来，用浓硫酸进行相同的水解，以将晶体和纤维素颗粒完全水解成葡萄糖。首先向 sarta 管中加入 175 μL 72% 硫酸，并在室温下孵育 30 分钟。初始孵育后，涡旋样品并再孵育 15 分钟。

然后加入 825 微升水并涡旋，以 10， 000 RPM 的速度离心样品 5 分钟。可能有一些棕色的可溶性物质，大部分木质素留在试管中，而葡萄糖在上清液中。上清液的葡萄糖含量使用 Colormetric anthone 测定法测定。

该测定在 96 孔聚苯乙烯微量滴定板中进行。按照随附书面方案中的说明修复葡萄糖标准曲线，一式两份。通过添加 200 微升新鲜制备和抛出的试剂，将每个样品 10 微升、上苏钠和 90 微升水混合到与标准完成相同的微量滴定板的单独孔中来制备样品。

接下来，在带有铝制散热器的烤箱中以 30 摄氏度的温度将板子加热 80 分钟。观察加热完成后，含葡萄糖的样品从黄色变为蓝绿色。让板冷却至室温并充分摇晃。

使用微量滴定板读数仪读取 625 纳米处的吸收。葡萄糖的含量，纤维素的组成部分，是根据吸光度与在同一板上建立的标准曲线进行比较来计算的。以下是一块杨木多糖分析的一些代表性结果。

气相色谱峰通过标准品的质量数曲线和/或保留时间进行鉴定。单糖根据标准曲线进行定量。基质多糖的糖分析显示木糖丰度高，代表半纤维素 xam，但也存在其他糖。

根据分析，40% 的杨木材料由晶体和纤维素组成。请注意，这些内容物和成分可能因植物或不同的植物解剖结构而异。我们刚刚向您展示了如何测定木质素纤维素生物质的多糖含量和成分分析，以分析多酚木质素。

收听第一部分。感谢您的观看，祝您的实验好运。