Name: 纯化 M。 magneticum应变AMB - 1磁小体相关蛋白MamAΔ41 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-25T16:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学习从Magnetospirillum magneticum AMB-1菌株中纯化磁小体相关蛋白MamAΔ41的方法。本方案采用亲和层析、离子交换层析和尺寸排阻层析技术，可获得高纯度均一的重组蛋白样品，为磁小体生物学研究提供重要实验基础。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 Amir Aharoni 博士的支持，以及 Geula Davidov、Noam Grimberg 和 Chen Guttman 提供的建议和意见。

1. 克隆与表达 mamA 基因在 E. coli
突变基因 mamAΔ41 使用聚合酶链式反应（PCR）从基因组DNA中扩增 Magnetospirillum magneticum AMB-1, 引物序列：5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3' 和 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3'。在扩增的DNA片段中，起始密码子ATG处引入了NcoI位点，终止密码子被替换为ScoI位点。将片段用NcoI和SacI消化后，连接至pET52b(+)载体的相应位点，构建得到pET52bMamAΔ41-AMB1。在此构建体中， mamAΔ41 基因在C末端与10-His标签进行了框内融合。将质粒电转化至大肠杆菌BL21菌株中。含有pET52b-MamAΔ41质粒的大肠杆菌BL21菌株在自动诱导培养基中培养 (15) 含氨苄青霉素（50 mg/ml）的培养基 310°K 3小时。随后将培养温度从 310° 到 300°K 并额外维持 48 小时 300°K通过在5465g离心10分钟收集细胞 277°K8升培养液获得60克湿菌体沉淀。
2. 生物信息学计算
根据氨基酸序列，使用 ProtParam 服务器（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）计算分子量（MW）以及预测蛋白质在 280 nm 处的吸光度（1 mg/1 ml）。10His-Tag-MamAΔ41 的分子量为 22529 Da（240 个氨基酸），MamAΔ41（经凝血酶切除 His 标签后剩余 9 个氨基酸）的分子量为 20596.5 Da（187 个氨基酸）。10His-Tag-MamAΔ41 在 280 nm 处（1 mg/1 ml）的预测吸光度为 0.595，MamAΔ41 为 0.579。此外，该氨基酸序列不含任何半胱氨酸残基，因此纯化过程中无需添加还原剂。
3. 纯化 MamAΔ41
<ol>
 <li>用于配制储备液，称量并分别配制以下浓度的溶液各 200 ml：咪唑（分子量 228.2 g/mol）4 M 溶液、NaCl（分子量 58.44 g/mol）5 M 溶液、Tris-HCl（分子量 121.3 g/mol）1 M 溶液，调节 pH 至 8.0。加入双蒸水（DDW），使用涡旋振荡器混匀直至溶液澄清。用滤膜过滤溶液 0.22μm 过滤后室温保存。</li>
 <li>配制并过滤6种新鲜缓冲液（从储备溶液，见表1）。 </li>
 <li>将细胞用缓冲液A按1:2的比例稀释并重悬，即每克细胞加入2毫升缓冲液A。</li>
 <li>添加 10μl 每10克细菌加入10毫升DNase I（1 mg/ml），以降解样品中的DNA片段。每20克细菌加入1毫升不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物。冰上孵育20分钟。</li>
 <li>通过两轮 25,000 psi 的法式高压匀浆器破碎细胞。与超声处理不同，法式高压匀浆器适用于大体积样本&gt;通过将细胞在高压下强制通过一个细小的孔口，实现10 ml细胞的挤出。由于使用过程中会产生热量，活塞在组装和使用前应在冰上冷却十分钟。</li>
 <li>将裂解后的细胞转移至25 ml超速离心管中，用缓冲液A精确平衡（±50 mg），直至样品液面达到离心管的颈部刻度线。</li>
 <li>通过超速离心在 270,000g 条件下离心 1 小时，分离细胞碎片 277°K.</li>
 <li>制备自制重力镍柱（Ni-NTA柱，直径2.5 cm）：将4 ml保存在20%乙醇中的Ni-NTA树脂加入柱中，待液体完全滴尽后，用40 ml去离子水（DDW）洗涤，并让液体完全滴尽。随后用40 ml缓冲液A对柱中树脂进行预平衡。</li>
 <li>将超速离心管中的可溶性组分上样至重力镍柱（Ni-NTA柱），让液体自然滴落，收集穿流液（未结合蛋白），并于277 K保存。</li>
 <li>使用小枪头刮取超速离心管中的沉淀样品，将枪头混入 50μl 含5% β-巯基乙醇的2X SDS-PAGE上样缓冲液。</li>
 <li>用100 ml缓冲液B洗涤层析柱。让液体滴出，收集流出液并于277 K保存。</li>
 <li>准备15个已标记的离心管（1.5 ml）。 </li>
 <li>洗脱——关闭柱阀，然后将1 ml缓冲液C加样至柱上；孵育3分钟，随后打开柱阀并收集流出液。重复此步骤三次。</li>
 <li>以1 ml缓冲液C的增量洗脱剩余悬浮液，并关闭阀门。</li>
 <li>在280 nm处测定各组分的OD值，评估蛋白峰的位置；如果OD值仍然 &gt;0.3，需要额外的样本。</li>
 <li>收集组分的SDS-PAGE分析。还应对以下样品进行此类分析：未结合蛋白穿流组分、洗涤穿流组分以及超速离心沉淀样品。混合 10μl 从每个样本中 10μl 加入含5% β-巯基乙醇的2X SDS-PAGE上样缓冲液，将样品上样至15% SDS-PAGE凝胶，在180伏电压下电泳运行45分钟。</li>
 <li>将凝胶置于15 ml InstantBlue溶液中染色，摇动1小时。确保塑料盒加盖并避光。</li>
 <li>评估凝胶；若蛋白表达量高且条带特异性明显，则合并选定的洗脱组分。</li>
 <li>为了去除10-His标签，加入牛凝血酶（10单位/μl), 10μl 根据制造商的建议，向合并样品中每1 mg蛋白加入凝血酶。</li>
 <li>透析用于去除过量的咪唑，并降低 NaCl 浓度，以达到离子交换结合所需的水平。进行透析时，裁剪适当长度的 7 kD 截留分子量（MWCO）透析袋，用双蒸水（DDW）清洗，并在一端打结（或用夹子密封）。将合并的蛋白质溶液转移至透析袋中，顶部留出一定空间，然后用夹子夹紧封口。 </li>
 <li>将透析管浸入4升预冷的透析缓冲液（缓冲液D）中，缓慢搅拌过夜 277°K.</li>
 <li>将透析管从烧杯中取出，剪一个小口，将蛋白质转移至50 ml离心管中。</li>
 <li>离子交换色谱：将预装的MonoQ 4.6/100 PE柱安装至快速蛋白液相色谱系统（FPLC）。用5个柱体积（CV）的经滤膜过滤的去离子水洗涤柱子。用5 CV的缓冲液D平衡柱子。 </li>
 <li>用双蒸水清洗进样环（两个环体积），再用缓冲液D重复清洗。将蛋白质样品加载至进样环中。</li>
 <li>注入蛋白样品（流速为1 ml/min），开始收集洗脱组分，用于SDS-PAGE检测未结合的蛋白质。</li>
 <li>如果初始蛋白体积（步骤 3.23）大于进样环体积，则重复步骤 3.25–3.26，无需清洗进样环，直至全部样品加载至色谱柱上。 </li>
 <li>用3个柱体积的缓冲液C洗涤层析柱，以去除未结合的蛋白质。</li>
 <li>用缓冲液D之间的40至2000 mM NaCl线性梯度在60分钟内洗脱蛋白质 &amp; E（当100%缓冲液E为梯度洗脱终点时），流速为1 ml/min（尽管可使用更高流速，但会导致洗脱体积增大，蛋白峰浓度降低）。根据280 nm色谱图中出现的蛋白峰进行收集。</li>
 <li>根据制造商建议清洗预装柱。 </li>
 <li>收集组分的SDS-PAGE分析。应使用以下样品进行该分析：未结合蛋白的穿流组分和蛋白峰穿流组分。按照步骤3.17–3.18中所述方法运行SDS-PAGE并染色。</li>
 <li>根据预染蛋白质分子量标记，在预测的相对分子质量（Mw）处检测凝胶中是否存在蛋白条带。合并含有目标蛋白的选定洗脱组分。</li>
 <li>透析合并的样品，以降低进行凝胶过滤层析所需的氯化钠浓度。使用缓冲液F进行透析，操作步骤同3.21–3.23。</li>
 <li>使用 Vivaspin-15 10,000 MWCO 超滤管，在台式离心机中以 4000 rpm 浓缩蛋白样品至 8 mg/ml。用石英比色皿在 280 nm 处测定吸光度（OD）以确认目标浓度。若蛋白浓度过高，则用缓冲液 F 稀释后再次测定。</li>
 <li>在FPLC上安装预装好的凝胶过滤层析柱HiLoad 26/60 Superdex 200；用3个柱体积的经滤膜过滤的去离子水洗涤层析柱，随后用3个柱体积的缓冲液F平衡层析柱。</li>
 <li>用5 ml去离子水（两个环路体积）清洗进样环，随后用等体积的缓冲液F冲洗。进样环中加入的蛋白样品体积不超过4 ml。</li>
 <li>以3.5 ml/min的流速注入蛋白样品，并在280 nm色谱图中出现蛋白峰时开始收集峰馏分。继续用缓冲液冲洗，直至达到柱体积。</li>
 <li>如果初始蛋白体积（步骤 3.23）大于进样环体积，则重复步骤 3.25–3.26，期间不清洗进样环，直至全部样品加载至色谱柱上。</li>
 <li>根据制造商的建议清洗预装柱。 </li>
 <li>收集组分的SDS-PAGE分析。应对蛋白峰样品进行该分析。按照步骤3.17–3.18中所述运行SDS-PAGE并染色。</li>
 <li>评估凝胶：若蛋白条带特异，且其分子量与预染蛋白标记物预测的大小一致，并仅可见单一条带，则合并该目的蛋白对应的洗脱组分。</li>
 <li>使用 Vivaspin-15 10,000 MWCO 浓缩蛋白质样品 &gt;20 mg/ml，使用台式离心机在4000 rpm条件下进行。通过在280 nm处测量OD值来验证所需浓度。纯化的MamAΔ41随后浓缩至26.5 mg/ml用于结晶。</li>
 <li>使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）确认样品纯度和蛋白质鉴定。</li>
 <li>如果蛋白质已根据质谱仪和SDS-PAGE纯化，则将浓缩的MamAΔ41分装至预先标记的Eppendorf管中；25-50μl 每份中的蛋白质</li>
 <li>液氮中速冻后于 193°K. </li>
</ol>
4. 代表性结果
若正确执行本实验方案，应获得高纯度、分子大小均一且浓度较高的蛋白质样品。这些蛋白质样品可直接用于结晶试验以及生化研究，例如酶动力学、结合亲和力分析等。本文描述了纯化方案中主要步骤的代表性结果。Ni-NTA亲和层析柱洗脱组分的SDS-PAGE分析应显示目标蛋白在可溶性组分中大量表达，其分子量约为22 kDa（图1）。该SDS-PAGE分析还应显示，在未结合蛋白的穿流组分、洗涤穿流组分以及超速离心沉淀样品中，目标蛋白含量极低或几乎不存在。若在上述样品中出现明显的目标蛋白条带，则应考虑缓冲液配制错误、细胞破碎过程存在问题，或培养物自诱导条件及生长状态不佳等因素。
离子交换色谱用于分离目标蛋白与结合到镍树脂上的其他大肠杆菌（E.coli）蛋白（由于静电相互作用或富含组氨酸/带负电氨基酸的蛋白环段）以及未切割的带His标签的目标蛋白。该色谱柱通过蛋白质在逐渐增加NaCl浓度条件下与带正电荷树脂的结合亲和力差异实现分离。高度带负电荷的蛋白质将在较高NaCl浓度下洗脱，而中等带负电荷的蛋白质则在较低浓度下洗脱。该色谱柱的优点是具有高流速和高结合容量。离子交换色谱图（图2）显示，在NaCl浓度梯度增加过程中，三种蛋白质组分得到了良好分离。需进行SDS-PAGE分析以确定各组分的分子量，分离目标组分，并评估是否需要进一步纯化步骤。第一个组分为MamAΔ41（约20 kDa），第二个组分为未被牛凝血酶切割的MamAΔ41+His标签蛋白（约22 kDa），第三个组分因浓度过低而在SDS-PAGE中无法检测。如果蛋白峰未能清晰分离，应考虑缓冲液配制错误或调整NaCl梯度斜率。
凝胶过滤色谱用于分离目标蛋白与其他蛋白 E.coli 与Ni-NTA树脂结合且在离子交换层析中未被分离的细胞蛋白。该层析柱根据蛋白质的大小进行分离，大分子蛋白质将在较小的洗脱体积中洗脱，而小分子蛋白质则在较大的洗脱体积中洗脱。层析图谱（图3）显示目标蛋白得到了良好的分离，呈现为一个主要的峰。该峰对应的蛋白洗脱体积符合单体大小，分子量约为20 kDa。此外还观察到约80 kDa条带的存在（E.coli 在上样前通过SDS-PAGE检测到一种典型的结合Ni-NTA树脂的蛋白质（约80 kDa），该蛋白在此次层析过程中消失。由于该蛋白初始浓度较低，其组分在层析图谱中因稀释而不可见，需通过SDS-PAGE分析以确定纯化效率。我们建议将主峰洗脱液的稀释与浓缩样品均上样至SDS-PAGE，以便准确判断目标分子量处是否存在纯蛋白。至此，蛋白已获得高度纯化，其均一性应通过MALDI-TOF质谱进行评估。分析结果显示，一种蛋白的分子量为20347 Da，另一种为10176 Da（图4）。其中约10 kDa的信号峰对应于约20 kDa蛋白的双电荷离子形式。去除His标签后剩余9个氨基酸的MamAΔ41预测分子量为20596.5 Da。与实测的MALDI-TOF分子量相比，二者相差248 Da。此差异可能源于MALDI-TOF检测误差，和/或常见的N端第一个甲硫氨酸与第二个甘氨酸的降解所致。综上，该蛋白已实现高度纯化，可用于后续实验。
<img src="/files/ftp_upload/1844/1844table.jpg" alt="缓冲液配制表，试剂浓度：Tris-HCl、NaCl、咪唑；测量体积。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 1"> 表 1. 缓冲液配方。
<img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig1.jpg" alt="SDS-PAGE 凝胶、蛋白质分离、电泳结果、分子量标记物。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. Ni-NTA 柱纯化 SDS-PAGE 分析的代表性结果。 从右至左：P- 超速离心沉淀（步骤 3.11）、W- 洗涤液（步骤 3.12）、U- 未结合蛋白（步骤 3.10）、E- 五道洗脱样品（步骤 3.14）、M - 蛋白质标记物（数字表示分子量）。箭头指示 MamAΔ41。
<img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig2.jpg" alt="层析与SDS-PAGE凝胶；蛋白质分析；尺寸分离与分子量测定。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 离子交换层析步骤的分析 (a) 离子交换（MonoQ柱）层析图；蓝色—280 nm处的吸光度，代表蛋白质浓度，绿色—NaCl浓度，红色—收集的组分指示。(b) 离子交换纯化步骤的代表性SDS-PAGE分析。从左至右：M—蛋白质标记物（数字表示分子量），A6—第一峰组分，A8—第二峰组分。
<img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig3.jpg" alt="蛋白质纯化；层析图谱和SDS-PAGE凝胶用于蛋白质分析结果比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 凝胶过滤层析分析 (a) 凝胶过滤（Superdex 200色谱柱）层析图；蓝色—280 nm处的吸光度，代表蛋白质浓度；红色—收集的组分指示。(b) 凝胶过滤纯化步骤的代表性SDS-PAGE分析。从左至右：M—蛋白质标记物（数字表示分子量），PreI—上样前样品，A4-6—从第一个峰收集并合并的组分，A4-6D—从峰中收集的稀释组分。
<img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig4.jpg" alt="质谱图显示离子强度峰；谱图分析；质荷比数据。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 纯化MamAΔ41的基质辅助激光解吸/电离（MALDI-TOF）质谱图。 基质为芥子酸（SA）。MamAΔ41的分子量为20347 Da，同时可见其双电荷离子峰，位于10176 Da。

<ol><li>Faivre, D., Schuler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetotactic+Bacteria+and+Magnetosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes.</a> Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).</li>
<li>D'Andrea, L. D., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPR+proteins%3A+the+versatile+helix%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">TPR proteins: the versatile helix.</a> Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).</li>
<li>Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. lrich, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+folding%3A+localized+functions+of+cytosolic+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">More than folding: localized functions of cytosolic chaperones.</a> Trends Biochem Sci. 28, 541-547 (2003).</li>
<li>Brocard, C., Hartig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+targeting+signal+1%3A+is+it+really+a+simple+tripeptide%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Peroxisome targeting signal 1: is it really a simple tripeptide?</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1565-1573 (2006).</li>
<li>Fransen, M., Amery, L., Hartig, A., Brees, C., Rabijns, A., Mannaerts, G. P., Van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+PTS1-+and+Rab8b-binding+properties+of+Pex5p+and+Pex5Rp%2FTRIP8b%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of the PTS1- and Rab8b-binding properties of Pex5p and Pex5Rp/TRIP8b.</a> Biochim Biophys Acta. 1783, 864-873 (2008).</li>
<li>Baker, M. J., Frazier, A. E., Gulbis, J. M., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein-import+machinery%3A+correlating+structure+with+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein-import machinery: correlating structure with function.</a> Trends Cell Biol. 17, 456-464 (2007).</li>
<li>Mirus, O., Bionda, T., von Haeseler, A., Schleiff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+evolved+discriminators+in+the+3-TPR+domain+of+the+Toc64+family+involved+in+protein+translocation+at+the+outer+membrane+of+chloroplasts+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Model%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily evolved discriminators in the 3-TPR domain of the Toc64 family involved in protein translocation at the outer membrane of chloroplasts and mitochondria.</a> J Mol Model. 15, 971-982 (2009).</li>
<li>Gatsos, X., Perry, A. J., Anwari, K., Dolezal, P., Wolynec, P. P., Likic, V. A., Purcell, A. W., Buchanan, S. K., Lithgow, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+and+outer+membrane+assembly+in+Alphaproteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein secretion and outer membrane assembly in Alphaproteobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 32, 995-1009 (2008).</li>
<li>Tiwari, D., Singh, R. K., Goswami, K., Verma, S. K., Prakash, B., Nandicoori, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+residues+in+Mycobacterium+tuberculosis+protein+kinase+G+play+a+role+in+regulating+kinase+activity+and+survival+in+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Key residues in Mycobacterium tuberculosis protein kinase G play a role in regulating kinase activity and survival in the host.</a> J Biol Chem. 284, 27467-27479 (2009).</li>
<li>Edqvist, P. J., Broms, J. E., Betts, H. J., Forsberg, A., Pallen, M. J., Francis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratricopeptide+repeats+in+the+type+III+secretion+chaperone%2C+LcrH%3A+their+role+in+substrate+binding+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tetratricopeptide repeats in the type III secretion chaperone, LcrH: their role in substrate binding and secretion.</a> Mol Microbiol. 59, 31-44 (2006).</li>
<li>Grunberg, K., Muller, E. C., Otto, A., Reszka, R., Linder, D., Kube, M., Reinhardt, R., Schuler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+proteomic+analysis+of+the+magnetosome+membrane+in+Magnetospirillum+gryphiswaldense%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and proteomic analysis of the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1040-1050 (2004).</li>
<li>Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosome+vesicles+are+present+before+magnetite+formation%2C+and+MamA+is+required+for+their+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 3839-3843 (2004).</li>
<li>Okuda, Y., Fukumori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+a+magnetosome-associated+protein%2C+TPR-containing+MAM22%2C+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of a magnetosome-associated protein, TPR-containing MAM22, in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 491, 169-173 (2001).</li>
<li>Taoka, A., Asada, R., Sasaki, H., Anzawa, K., Wu, L. F., Fukumori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+localizations+of+Mam22+and+Mam12+in+the+magnetosomes+of+Magnetospirillum+magnetotacticum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spatial localizations of Mam22 and Mam12 in the magnetosomes of Magnetospirillum magnetotacticum.</a> J Bacteriol. 188, 3805-3812 (2006).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li>
</ol>

蛋白质纯化是任何蛋白质生化或结构研究中的关键步骤。由于每种蛋白质都具有独特的性质和行为，因此需要明确其特性，并相应地调整纯化方案。应首先利用生物信息学工具对目标蛋白质进行分析，作为纯化的第一步。这些工具可用于计算目标蛋白的等电点，评估其对还原/氧化环境的需求，以及对特殊离子或配体的需求。我们的实验方案包含若干关键性调整，以反映目标蛋白的独特性，这些调整包括缓冲液的选择、工作温度以及层析柱条件的优化。
第一个关键的改进是所使用的缓冲液（第3.3节），需要调整这些缓冲液以反映蛋白质稳定性和功能所需的正确pH范围、离子/配体及离子强度。如果目标蛋白出现任何不稳定的迹象（如降解、沉淀或功能丧失），则需要测试并寻找其他更合适的缓冲液。另一个关键问题是纯化速度和操作温度。为了防止蛋白质降解（由蛋白酶或蛋白质自身不稳定引起），应快速进行纯化，并在277°K下操作（包括使用低温缓冲液、转子和层析柱）。
亲和纯化步骤以及其他层析步骤可以在多种树脂来源上进行。亲和树脂可通过多种技术加载蛋白质，具体方法应根据本地条件进行调整。若通过将蛋白质溶液...

<table><tbody><tr><td>法国压滤器</td><td>仪器设备</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>FA-078A</td><td></td></tr><tr><td>压力细胞</td><td>仪器设备</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>FA-032</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>仪器设备</td><td>Sorvall，赛默飞世尔科技</td><td>Discovery 90SE</td><td></td></tr><tr><td>Rottor</td><td>仪器设备</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>Ti60</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管；PC-瓶盖检测 26.3 ml</td><td>仪器设备</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>BC-355618</td><td></td></tr><tr><td>2.5 cm 直径，玻璃 Econo-Column 层析柱</td><td>仪器设备</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2521</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA His Bind 树脂</td><td>仪器设备</td><td>Novagen，EMD Millipore</td><td>M0063428</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>仪器设备</td><td>Amersham</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>石英比色皿</td><td>仪器设备</td><td>赫尔马</td><td>104-QS</td><td></td></tr><tr><td>快速蛋白液相色谱 - AKTA purifier 10</td><td>仪器设备</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>离子交换柱 &amp;#8211; MonoQ 4.6/100 PE</td><td>仪器设备</td><td>GE Healthcare</td><td>10025543</td><td></td></tr><tr><td>尺寸排阻预装柱-HiLoad 26/60 Superdex 200</td><td>仪器设备</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1071-01</td><td></td></tr><tr><td>Centricon - Vivaspin15 &amp;#8211; 10,000 截留分子量</td><td>仪器设备</td><td>Sartorius AG</td><td>VS1501</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>仪器设备</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>IEC CL30R</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>仪器设备</td><td>布鲁克公司</td><td>Reflex IV</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl（羟甲基）氨基甲烷</td><td>试剂</td><td>生物实验室</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>试剂</td><td>FRUTROM</td><td>235553470</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>试剂</td><td>Alfa Aesar</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>无EDTA蛋白酶抑制剂混合物</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8849</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>牛凝血酶</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP25432</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>试剂</td><td>生物实验室</td><td>07132391</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>试剂</td><td>生物实验室</td><td>19822391</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇&amp;#8211;乙醇</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>试剂</td><td>Expedeon</td><td>1SB01L</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler 预染蛋白标记</td><td>试剂</td><td>Fermentas</td><td>SM0671</td><td></td></tr></tbody></table>

磁小体相关蛋白 mamaΔ41 的纯化：来自 m. magneticum 菌株 amb-1

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

趋磁细菌是一类多样化的水生微生物，能够沿着地磁场方向定向移动。这种行为被认为有助于它们寻找适宜的生存环境(1). 这种能力由磁小体赋予，磁小体是一种亚细胞器，由脂质囊泡线性链状排列组成，每个囊泡均能生物矿化并包裹一个约50 nm的磁铁矿或硫铁矿晶体。磁小体的一个关键组分是MamA，已被证明是功能性囊泡形成所必需的蛋白。MamA是一种丰度很高的磁小体相关蛋白，也是目前研究最为深入的磁小体相关蛋白之一。in vivo (2-6)。本文重点介绍 MamA 的纯化，尽管该蛋白已被研究in vivo，尚未发现其明确的功能或结构细节。生物信息学分析表明，MamA 是一种含有四次三十四肽重复序列（TPR）的蛋白质。TPR 是一种结构模体，广泛存在于多种蛋白质中，可单独存在或作为更大折叠结构的一部分，其作用是作为蛋白质-蛋白质相互作用的模板，并介导多蛋白复合物的形成。(7)TPR结构域参与真核细胞细胞器过程中的许多关键任务，以及多种细菌信号通路。(8-14)。为了研究含有独特TPR结构域的蛋白质MamA，首先需要获得高纯度的蛋白质。本文介绍了从稳定表达的MamA缺失突变体（MamAΔ41）中纯化该蛋白的实验方案。M. magneticum AMB-1.

MamA 是一种独特的与磁小体相关的蛋白质，已被证明参与磁小体的活化过程。本文介绍了从M. magneticum AMB-1中纯化 MamA 缺失突变体（MamAΔ41）的实验方案。

磁小体相关蛋白 MamAΔ41 的纯化：来自 M. magneticum 菌株 AMB-1

趋磁细菌是一类多样化的水生微生物，能够沿地磁场方向定向移动。这种行为是……

纯化过程始于表达Mame. Delta 41重组蛋白的细胞沉淀，随后进行细胞膜的破碎，并分离可溶性与不溶性组分。为了提取可溶性重组蛋白，通过亲和层析将带有标签的重组蛋白与其他细胞蛋白分离开来。离子交换色谱法将哺乳动物Delta 41与其他在亲和层析和尺寸排阻后仍残留的细胞蛋白分离开。色谱进一步分离哺乳动物Delta 41，并揭示其寡聚状态。最后，分析重组蛋白的纯度和均一性。大家好，我是Raza，来自Benon University of the Negative生命科学系XVA实验室的负责人。这位是同样来自Z实验室的Natalie。今天我们将向您展示一种重组蛋白纯化的方法。我们在实验室中采用此方法研究与磁性相关的蛋白质。现在开始本实验方案。MAME Delta 41 蛋白以 10 个组氨酸（10 hiss）融合蛋白的形式表达。在BL21大肠杆菌细胞中，将细胞于含有Epi Brazilin的自动诱导培养基中，在310 K下培养3小时。随后将培养温度转移至300 K，使细胞继续孵育48小时。孵育结束后，通过离心收集细胞，弃去上清液，并称量所得的细胞沉淀。8升培养液应可产生约60克湿菌体沉淀。在进行蛋白质纯化之前，配制200毫升含4摩尔异亮氨酸、5摩尔氯化钠以及1摩尔Tris-HCl（pH 8）的溶液。使用双蒸水（DDW）涡旋振荡溶液至澄清，并用0.22微米滤膜过滤。从新配制的储备液中过滤，并按照本视频附带的书面方案所述，依次过滤缓冲液A至F。开始蛋白质纯化时，将细胞在缓冲液A中重悬，细胞质量与缓冲液体积的比例为1:2。每 10 克细菌加入 10 微升 dna，以消化样品中的任何 DNA 片段。然后加入 1 毫升 E dt，即一种游离的蛋白酶抑制剂混合物。每 20 克细菌将溶液在冰上孵育 20 分钟。孵育后，使用法国压榨机在25,000 PSI条件下进行两轮破碎细胞。由于温度会逐渐升高，使用前应将活塞在冰上冷却10分钟。将裂解后的细胞转移至25毫升超速离心管中。用缓冲液 A 将离心管加至刻度线处，并精确配平。然后通过超速离心分离细胞碎片。同时，将 4 毫升镍 NTA 树脂加入 2.5 厘米玻璃柱中，组装镍 NTA 重力柱。根据生产商的说明和S的指示，准备用于蛋白质纯化的树脂。样品完成离心后，将超速离心管中的可溶性组分倾倒至镍-NTA柱上。收集流穿组分中的未结合蛋白质。继续用 100 毫升缓冲液 B 洗涤层析柱，并收集流穿液。将流穿液组分保存在 277 K。用 15 个编号的 1.5 毫升离心管洗脱蛋白。关闭层析柱阀门，并向柱中加入 1 毫升缓冲液 C。孵育三分钟后，打开阀门并收集流出液。重复此步骤三次。随后继续以一毫升缓冲液为增量洗脱蛋白，无需再进行三分钟孵育。使用紫外分光光度计，通过在 280 纳米处测量吸光度来确定各组分中的蛋白质峰。最后，对收集的组分进行 S

purification-m-magneticum-strain-amb-1-magnetosome-associated-protein

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

纯化 M。 magneticum应变AMB - 1磁小体相关蛋白MamAΔ41

该视频介绍了一种通过免疫磁珠靶向和分离外周血单个核细胞悬液来纯化B细胞的方法。该方法涉及使用特异性抗体或配体（与磁性颗粒相连）标记不需要的细胞类型，这些抗体或配体靶向特定的细胞表面蛋白，从而通过磁性分离从异质性细胞悬液中去除这些细胞。...

阴性免疫磁珠分选：一种从外周血单个核细胞中纯化B细胞的方法

在本视频中，我们演示了一种利用磁性微珠从目标生物液体中分离外泌体的方法。该方法可快速捕获外泌体，适用于后续分析。...

磁珠法外泌体提取：一种从生物流体中分离特定外泌体的技术

在本视频中，我们介绍了一种利用磁珠激活细胞分选技术从小鼠幼崽脑组织中分离CD11b细胞（包括小胶质细胞）的实验方案。脑组织经匀浆处理以获得单细胞悬液，随后与包被抗CD11b抗体的磁珠共同孵育，再通过基于磁性柱的分离方法纯化CD11b+细胞群体。...

从小鼠幼崽大脑中磁分离小胶质细胞

我们展示了一种可用于天然水体的趋磁细菌（MTB）收集方法。利用细菌自身的天然磁性，可通过相对简单的装置从沉积物样品中分离并富集趋磁细菌。分离得到的趋磁细菌可进一步通过光学显微镜和电子显微镜进行详细观察。...

从环境中采集、分离与富集天然存在的趋磁细菌

本实验步骤介绍了如何从成年小鼠脑组织中分离线粒体相关内质网膜（MAMs），以及从MAMs和线粒体组分中提取糖鞘脂富集的微结构域组分。...

线粒体相关内质网膜（MAMs）和糖鞘脂富集微区（GEMs）：从小鼠脑组织中分离

外泌体是存在于生物体液中的微囊泡结构，可能携带重要的疾病鉴别生物标志物。本文采用一种新方法，通过非均匀电循环方波破坏外泌体后，特异性地提取外泌体，并快速检测其内含的RNA和蛋白质靶标。...

电场诱导释放与检测法（EFIRM）对外泌体生物标志物的检测

本文介绍了一种掺钴磁性铁蛋白的合成与阳离子化方案，以及利用阳离子化磁性铁蛋白快速磁化干细胞的方法。...

合成阳离子化磁铁蛋白用于细胞的超快速磁化

本论文描述了一种利用PEI/MNP载体高效、非病毒性地将miR递送至内皮细胞并实现其磁化的方法。因此，该方法除了可实现遗传修饰外，还可实现磁性细胞导向和磁共振成像（MRI）检测。该技术可用于改善治疗性细胞产品的特性。...

制备与 体外 磁化miR修饰内皮细胞的表征

本文所述方法是一种新的囊泡分离方案，可纯化在交叉提呈过程中通过内质网相关降解途径处理外源性抗原的细胞区室。...

交叉提呈中外源性抗原在内质网相关降解膜区室的纯化

本文介绍一种磁分离辅助的高速均质化方法，用于大规模制备来源于内体的纳米囊泡，作为一种新型的外泌体模拟物（EMs），其具有与天然细胞外囊泡（EVs）相同的生物学来源，以及相似的结构、形态和蛋白质组成。...

一种磁分离辅助的高速均质化方法用于大规模制备内体来源囊泡

本方案描述了一种基于磁珠的分选方法，该方法使用藻红蛋白（PE）标记的流式细胞术抗体和抗PE微珠，以分离特定的间充质干细胞亚群。在测试条件下，该方法可获得高纯度的目标标志物阳性细胞，同时保持基于CCK-8的增殖/代谢活性，且无需昂贵的细胞分选仪或针对特定目标的定制磁珠。...

利用间接磁珠法分离和鉴定表达podoplanin的间充质干细胞亚群

学习从Magnetospirillum magneticum AMB-1菌株中纯化磁小体相关蛋白MamAΔ41的方法。本方案采用亲和层析、离子交换层析和尺寸排阻层析技术，可获得高纯度均一的重组蛋白样品，为磁小体生物学研究提供重要实验基础。

磁小体相关蛋白 MamAΔ41 的纯化：来自 M. magneticum 菌株 AMB-1

探索更多视频