检测可扩散信号分子重定向胚胎脊髓联合轴突能力的实验方法

从大鼠胚胎中分离出背侧脊髓的外植体，并在三维胶原凝胶中进行培养，以对抗表达候选信号分子的细胞。通过免疫组织化学方法评估该信号分子对背侧脊髓外植体中生长轴突的导向能力。

大家好，我是来自南加州大学生物科学系Butler实验室的Virginia Hazen。我是同样来自Butler实验室的Keith Fun。我是来自Butler实验室的Ken Ya Mai。

今天我们将向您展示一种在胶原基质中培养背侧脊髓移植物和转染的旁分泌细胞聚集体的实验方法。在本实验室中，我们采用该方法来检测候选的信号分子引导脊髓神经元定向生长的能力。在本实验中，我们将检测骨形态发生蛋白7（BMP7）是否具有化学排斥作用。

让我们开始。制备用于挑战来自共细胞的联合轴突轨迹的共细胞聚集体。将共细胞转染表达目的分子的质粒，此处为目的分子骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）7。

吸去培养皿中的培养基，用一毫升 1×PBS 冲洗细胞。去除 PBS 后，加入半毫升无酶细胞解离液，处理 15 分钟。加入含胎牛血清的一毫升培养基以终止反应。

使用1000微升移液器吸头反复吹打，直至细胞完全从培养皿表面脱离。将细胞转移至15毫升锥形离心管中，在2000 RPM条件下离心2分钟以收集细胞沉淀。弃去上清液，用移液器上下吹打以重新悬浮细胞。

在35毫米培养皿盖内侧，于100微升培养基中滴加多个20微升的细胞悬液液滴。将皿盖盖在培养皿上，放入培养箱中孵育数小时，使细胞聚集成团。制备背侧脊髓植入物时，需保持 freshly harvested 状态。

将11天大的大鼠胚胎置于冰上。在L-15培养基中，使用锋利的钨针从每个胚胎前肢芽下方的躯干区域切取4至6个体节的组织片段。用塑料移液管将组织收集到四孔板的一个孔中。

将平皿置于冰上。当所有组织段均完成解剖后，使用移液器将组织块转移至另一含有 L-15 培养基加组织块培养液的平皿孔中。将组织在室温下孵育，时间不超过 5 分钟。

为防止细胞死亡，切勿过度消化组织。向无菌培养皿的第三个孔中加入一毫升含有5%热灭活山羊血清的新鲜L-15培养基，并将组织块转移至该孔中。

在消化液孵育结束后，将组织置于冰上静置一小时。为了使后续在微型离心管中的解剖操作更简便，向360微升胶原酶溶液中加入40微升10倍最低必需培养基，并短暂涡旋混匀，然后在微量离心机中离心沉淀。

溶液将呈黄色，应尽可能保持在冰上，以防止每批胶原蛋白在滴定过程中凝固。使用0.8摩尔的碳酸氢钠，使胶原蛋白溶液略呈橙色。每次加入后均需混合溶液。当胶原蛋白溶液呈现此颜色时，若保持在冰上将维持液态，但在恢复至室温时即处于易于凝固的状态。若混合后溶液变为粉红色，则需重新开始，使用新的胶原蛋白管。在洁净的四孔板中，每孔加入20微升胶原蛋白。

用移液枪枪头将胶原蛋白分散，形成一个小垫状。室温下静置约10分钟，使胶原蛋白凝固。在解剖显微镜下，使用新磨制的钨针和一对精细镊子，用钨针从一个胚胎中去除脊髓周围存在的中胚层组织，并去除脊髓的腹侧部分，该区域可通过底板的存在加以区分。

在腹侧最边缘，腹侧板略厚于背侧边缘的顶板。在此示例中，脊髓腹侧朝下。沿腹侧板平行小心切割组织，并弃去脊髓腹侧的五分之一部分。

使用针垂直地将背侧脊髓离体组织纵向切开。确保切口尽可能整齐，必要时可重新修剪边缘。使用连接直径为0.5毫米玻璃毛细管的口控移液装置将每个离体组织转移至独立的胶原垫上。

用钨针将转染的共细胞聚集体切成若干小方块，其宽度应与背侧脊髓的侧边宽度大致相同。说明：使用口吸管将其中一个方块转移至胶原垫上，并用口吸管吸除多余的液体。

切勿过度吸液，因为残留少量液体有助于后续胶原蛋白的施加。在垫片上施加4 µL预处理的胶原蛋白。使用钨针将胶原蛋白移动至植入物上方，注意不要直接接触组织。通过移动针头调整胶原蛋白中的每个x explan，使共培养细胞团位于其侧缘附近。

让胶原蛋白凝固 15 到 20 分钟。再使用 4 微升胶原蛋白重复一次包埋操作，以确保在转入下一个胚胎前，该 x explan 已完全被胶原蛋白包裹。在组织培养罩中加入 0.5 毫升培养基，于培养箱中培养 30 至 40 小时。在通风橱内，用 0.5 毫升含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定组织块 45 分钟。始终保持组织置于冰上，并用 0.5 毫升封闭与通透溶液 PBTN 洗涤两次。

将 x 个外植体置于封闭溶液中，在 4°C 下孵育，最好过夜。使用镊子将 X 外植体从四孔板中取出，并将其分别放入 48 孔板的每个孔中。

每孔加入 200 µL 一抗。为观察 comm choral 轴突，请使用小鼠抗 ttag 抗体；为确定交叉细胞转染是否成功，需加入针对待测分子的抗体。4°C 下孵育过夜。

在4°C条件下，用PBTN封闭液对每个样本进行洗涤，每次一小时，共洗涤五次。移除PBTN，向每个样本中加入200微升二抗。用封口箔覆盖板孔以防止褪色，并在4°C条件下过夜孵育。

按照之前的方法用PBTN清洗样品五次。将每个外植体转移至三孔凹面载玻片中。去除多余的液体，用Invecta Shield封片剂封片，然后盖上盖玻片。

将载玻片存放在避光的文件夹或盒子中，置于 4 或 -20 摄氏度条件下，直至准备在显微镜下观察。接下来，我们将展示一些 X 外植体在培养、固定、染色并经共聚焦显微镜成像后的代表性图像。图 A 显示，由白色轮廓标出的菱脑顶部板的 X 外植体能够使 Tag1 阳性的合唱神经轴突远离其自身，表明顶部板是轴突化学排斥因子的来源。图 B 显示，分泌 M tact 信号分子骨形态发生蛋白（BMP7）的共细胞能够以类似于顶部板的方式排斥纹状体轴突。

仅转染表达质粒的细胞对轴突的取向无任何影响。我们刚刚向您展示了如何分离、定向并培养脊髓的离体组织，并利用细胞聚集体来判断候选信号分子是否具有轴突重定向活性。在进行该操作时，重要的是尽可能将胶原保持在冰上，并用胶原完全包裹离体组织，以避免其与培养基直接接触。

最后，仅需培养至轴突延伸到x explant的腹侧边缘即可。就是这样。感谢观看，祝您的实验顺利。I.