Name: 含量测定扩散的信号分子能够重新调整胚胎脊髓连合轴突 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 了解如何利用BMP7信号分子通过免疫组织化学技术重新调整胚胎脊髓连合轴突的方向。该方法使用大鼠胚胎背侧脊髓外植体与COS细胞共培养，为神经发育和轴突导向机制研究提供重要见解。

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该方案由 Jane Dodd、Thomas Jessell 和 Andrew Lumsden 的实验室开发。包括 Konrad Basler、Ann Calof、Thomas Edlund、Phil Hamilton、Domna Karagogeos、Ariel Ruiz i Altaba 和 Toshiya Yamada 在内的许多研究人员确定了在胶原中培养脊髓外植体的方法。Marysia Placzek 和 Marc Tessier-Lavigne 率先采用体外外植体中轴突生长的技术，用于鉴定轴突导向分子。Butler 实验室的工作得到了美国出生缺陷基金会（March of Dimes）以及美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH/NINDS）R01 NS063999 项目的资助。

第1部分：利用悬滴法制备转染COS细胞的聚集体
<ol>
 <li>在35 mm培养皿中接种COS-7（COS）细胞。当细胞达到80%融合度时，按照制造商的说明书，使用Lipofectamine2000将1 μg表达质粒转染入细胞中。</li>
 <li>为制备悬滴，吸除转染培养基，并用1 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗转染后的COS细胞。加入0.5 ml无酶细胞解离液，处理15分钟。随后加入1 ml Opti-MEM + 1×青霉素/链霉素/谷氨酰胺（P/S/G）+ 10%胎牛血清（FBS）溶液以终止反应。</li>
 <li>吹打细胞使其从培养皿表面脱落，并转移至15 ml锥形管中。在2000×g下离心2分钟以收集细胞沉淀。弃去上清液，将沉淀重悬于100 μl Opti-MEM + 1× P/S/G + 10% FBS中。</li>
 <li>在35 mm培养皿盖内表面滴加多个20 μl液滴，将皿盖倒置并放置于培养皿底部之上，置于37°C培养箱中数小时，直至细胞聚集成团。</li>
</ol>
第2部分：背侧脊髓外植体的制备
<ol>
 <li>从母鼠子宫中取出 E11 大鼠胚胎，并将其置于冰上的 L15 培养基中保存，待用。</li>
 <li>使用锋利的钨针，从每个胚胎躯干部分切取 4–6 个体节，取材区域位于前肢芽下方紧邻处。用塑料移液管将组织块收集至一个 4 孔 Nunc 培养皿的某一孔中，并置于冰上保存。</li>
 <li>当所有胚胎节段解剖完成后，用塑料移液管将组织块转移至另一孔中，该孔含有 1 ml L15 培养基加 1 mg 分散酶的溶液。室温孵育不超过 5 分钟。切勿使组织块在分散酶中过度孵育。</li>
 <li>在孵育期间，将 0.5 ml 热灭活的正常山羊血清（HIGS）加入约 10 ml L15 培养基中，置于培养皿内轻轻混匀。取 1 ml 该溶液加入 Nunc 培养皿的第三孔中，孵育结束后将组织块转移至此溶液中，然后置于冰上。注意：若允许组织块在冰上“静置”约 1 小时，后续解剖操作将更为容易。</li>
</ol>
第3部分：胶原蛋白的启动
<ol>
 <li>向360μl胶原蛋白中加入40μl 10倍浓缩的最低必需培养基，通过轻弹管壁或短暂涡旋迅速且充分混匀。在微量离心机中快速离心。溶液将呈黄色。尽可能保持在冰上操作。</li>
 <li>加入适量0.8M碳酸氢钠（NaHCO3），使胶原蛋白溶液略呈橙色（见下文注释）。再次通过轻弹管壁迅速且充分混匀，并在微量离心机中短暂离心。若混匀后溶液仍为粉红色，则表明NaHCO3添加过量，需更换新的胶原蛋白重新开始。</li>
 <li>此时胶原蛋白溶液已准备就绪。在冰上可保持液态，但当温度升至室温时，约5分钟内会凝固（变为粉红色）。</li>
 <li>在4孔Nunc培养皿的每个孔中加入20μl胶原蛋白。用移液器枪头将胶原蛋白铺展成一个小“垫”状。于室温下静置，使胶原蛋白凝固。</li>
</ol>
注意：每批胶原蛋白所需的 NaHCO3 确切用量需进行滴定。起始用量宜低（11 μl），然后以 0.5–1 μl 的增量逐步添加，直至溶液呈现微橙色。合适的用量通常比使胶原蛋白变为粉红色所需的最少 NaHCO3 量少 1 μl。NaHCO3 的用量与胶原蛋白量之间不存在线性比例关系。
第4部分：背侧脊髓外植体的分离及其在胶原基质中与COS细胞团的定位
<ol>
 <li>使用新磨制的钨针和精细镊子（#5 或 #55），去除脊髓周围的中胚层组织。</li>
 <li>用钨针平行于底板进行切割，小心地去除脊髓腹侧五分之一部分。</li>
 <li>将背侧脊髓外植体沿中线切为两半，确保切缘尽可能整齐；如有必要，可重新修整边缘。使用连接玻璃毛细管（拉制至直径约 0.5 mm）的口吸管，将每个背侧脊髓外植体分别转移至独立的胶原垫上。</li>
 <li>将转染的 COS 细胞聚集体切成与背侧脊髓外植体侧缘宽度大致相同的方块。</li>
 <li>使用口吸管将其中一个方块转移至含有背侧脊髓外植体的胶原垫上。</li>
 <li>用口吸管吸除多余液体，注意不要过度吸取。</li>
 <li>在胶原垫上加入 4 μl 预凝胶化的胶原液，并使用钨针轻轻推动胶原覆盖外植体，避免直接接触组织。通过在外植体周围的胶原中移动钨针，调整外植体位置，使 COS 细胞聚集体紧邻背侧脊髓外植体的侧缘。</li>
 <li>待胶原凝固后，再次加入 4 μl 胶原液，以确保外植体完全被胶原包裹。</li>
 <li>在组织培养超净台内加入 0.5 ml Opti-MEM + 1×P/S/G，培养 30–40 小时。</li>
 <li>将外植体置于冰上，加入 0.5 ml 含 4% 多聚甲醛的 1×PBS 溶液，固定 45 分钟。</li>
 <li>用封闭液（PBTN：1×PBS + 0.1% Triton-X100 + 1% HIGS）清洗两次，每次 0.5 ml；在 4°C 下封闭至少数小时，建议过夜孵育，随后进行免疫组织化学处理。</li>
</ol>
第5部分：通过免疫组织化学法可视化连合轴突
<ol>
 <li>在PBTN中封闭后，用镊子将外植体从4孔板中取出，并置于48孔板中。</li>
 <li>向每孔加入200μl一抗，4°C下孵育过夜。为观察联合轴突，使用1:6稀释的小鼠抗Tag1抗体。为确定转染是否成功，还需加入针对待测信号分子的一抗，或当信号分子带有表位标签时，使用针对相应表位的一抗。</li>
 <li>在4°C下，用PBTN对每个样本洗涤5次，每次1小时。</li>
 <li>向每孔加入200μl二抗，4°C下孵育过夜。若一抗为抗Tag1抗体，则使用与FITC或Cy3偶联的山羊抗小鼠IgM二抗。 若使用对光敏感的FITC或Cy3偶联二抗，从此时起需用铝箔包裹48孔板以避光。</li>
 <li>在4°C下，用PBTN对每个样本洗涤5次，每次1小时。</li>
 <li>将外植体转移至3孔凹面载玻片，吸去多余液体，用Vectashield封片剂封片。置于避光盒中，于4°C或-20°C保存。</li>
</ol>
第6部分：外植体的代表性图像
在成功的实验中，外植体与COS团块应保持相互紧邻，且在胶原凝固过程中不会发生分离。轴突的过度生长应极少；若出现明显的轴突过度生长，则表明背侧脊髓外植体培养时间过长。外植体不应出现泡状突起；若组织直接接触培养基，则会发生起泡现象。
使用共聚焦显微镜评估信号分子重新定向轴突的能力。可通过测量最靠近COS细胞聚集体的轴突的平均重新定向角度来量化轴突重新定向的程度3。如图1所示，表达myc标签BMP7（蓝色）的COS细胞可使Tag1+联合轴突（绿色）偏离BMP7来源方向（图1B），其方式类似于顶板组织块对联合轴突的排斥作用（图1A）。表达对照载体的COS细胞对联合轴突的走向无影响3,4。这些组织块还用针对转录因子Isl1/2（红色）的抗体进行标记，该抗体可标记运动神经元和背侧中间神经元。该结果首次表明，BMP家族成员介导了顶板化学排斥因子的活性3。
<img src="/files/ftp_upload/1853/1853fig1tmb.jpg" border="0" alt="神经外植体示意图；Tag1、Isl1/2、Myc 表达；COS 细胞，BMP7 效应分析。" data-altupdatedat="1787630408000"> 图 1： 请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1853/1853fig1.jpg">点击此处</a>查看图 1 的放大版本。

<ol><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22The+development+of+the+rat+spinal+cord%22">The development of the rat spinal cord</a>. , (1984).</li>
<li>Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPlaczek%2C+M+%22Methods+in+molecular+biology%22">Methods in molecular biology</a>. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).</li>
<li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li>
<li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li>
<li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li>
<li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li>
<li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li>
<li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li>
<li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li>
</ol>

决定本实验成功的关键因素有以下几点：首先，组织用dispase处理的时间不宜过长，否则会导致组织变得非常黏稠且细胞活力下降。其次，胶原蛋白必须充分预冷，并尽可能保持在冰上。一旦开始凝固（即变为粉红色），其操作难度将逐渐增加。第三，钨针必须始终保持非常锋利。

<table><tbody><tr><td>1型大鼠尾胶原</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>COS-7细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td></td></tr><tr><td>10倍最低必需培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>1166-8019</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>细胞解离液</td><td>EMD Millipore</td><td>S-004-C</td><td></td></tr><tr><td>0.25%胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>2520-0056</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/谷氨酸盐</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Baker/VWR</td><td>JTS898-7</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Roche Group</td><td>10241750001</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗Tag1 IgM单克隆抗体（4D7）</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗Myc IgG单克隆抗体（9E10）</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-40</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的山羊抗小鼠IgM抗体</td><td>Jackson</td><td>115-095-075</td><td></td></tr><tr><td>Cy3标记的山羊抗小鼠Fcy抗体</td><td>Jackson</td><td>115-165-071</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>4孔Nunclon培养皿</td><td>Nalge Nunc international</td><td>62407-068</td><td></td></tr><tr><td>3孔凹玻片</td><td>VWR international</td><td>48339-009</td><td></td></tr><tr><td>48孔板</td><td>Falcon BD</td><td>62406-195</td><td></td></tr><tr><td>吸管装置组件</td><td>FHC, Inc.</td><td>30-32-0</td><td></td></tr><tr><td>#55 Dumont镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>#5 Dumont镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr></tbody></table>

检测可扩散信号分子重定向胚胎脊髓联合轴突能力的实验方法

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

脊椎动物脊髓中的背侧连合轴突1 一直是鉴定轴突导向信号的宝贵模型系统。本文中，我们描述了一种 体外 检测，“重定向检测”，已被广泛用于研究外在和内在信号对连合轴突定向的影响2该实验由 Jane Dodd、Thomas Jessell 和 Andrew Lumsden 实验室的多位研究人员共同开发（详见致谢部分），该实验的不同版本曾被用于证明关键轴突导向分子的重定向作用，包括脊髓顶板中的 BMP 化学排斥分子3,4 Netrin1的化学吸引活性5 和 Sonic Hedgehog (Shh)6 在脊髓的底板中。
从胚胎第11天（E11）大鼠的脊髓背侧三分之二区域切取包含2-3个节段的外植块，并将其培养于三维胶原凝胶中7E11 背侧脊髓外植体包含新生成的联合神经元，可通过其轴突表达的糖蛋白 Tag1 鉴定8在培养过程中，经过30-40小时，这些背侧外植体中联合轴突的走行路径得以重现，其时间进程与体内观察到的相似。 体内该轴突轨迹可通过将测试组织或表达候选信号分子的COS细胞团块置于背侧外植体的一侧边缘进行挑战。在附加组织附近延伸的联合轴突将在内源性顶板和异位侧组织信号的共同影响下生长。在这些条件下，联合轴突重新定向的程度可以被量化。利用该检测方法，既可检验特定信号分子对联合轴突重新定向的充分性3,4 以及该信号引导联合通路走向的必要性9.

该实验用于评估信号分子（此处为骨形态发生蛋白7，BMP7）对联合轴突重新定向的能力。将胚胎背侧脊髓组织外植体与分泌候选生长因子的COS细胞聚集体相邻培养，通过免疫组织化学方法观察外植体内重新定向生长的联合轴突。

脊椎动物脊髓中的背侧连合轴突1一直是识别轴突导向信号的宝贵模型系统。这里，我们……

从大鼠胚胎中分离出背侧脊髓的外植体，并在三维胶原凝胶中进行培养，以对抗表达候选信号分子的细胞。通过免疫组织化学方法评估该信号分子对背侧脊髓外植体中生长轴突的导向能力。大家好，我是来自南加州大学生物科学系Butler实验室的Virginia Hazen。我是同样来自Butler实验室的Keith Fun。我是来自Butler实验室的Ken Ya Mai。今天我们将向您展示一种在胶原基质中培养背侧脊髓移植物和转染的旁分泌细胞聚集体的实验方法。在本实验室中，我们采用该方法来检测候选的信号分子引导脊髓神经元定向生长的能力。在本实验中，我们将检测骨形态发生蛋白7（BMP7）是否具有化学排斥作用。让我们开始。制备用于挑战来自共细胞的联合轴突轨迹的共细胞聚集体。将共细胞转染表达目的分子的质粒，此处为目的分子骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）7。吸去培养皿中的培养基，用一毫升 1×PBS 冲洗细胞。去除 PBS 后，加入半毫升无酶细胞解离液，处理 15 分钟。加入含胎牛血清的一毫升培养基以终止反应。使用1000微升移液器吸头反复吹打，直至细胞完全从培养皿表面脱离。将细胞转移至15毫升锥形离心管中，在2000 RPM条件下离心2分钟以收集细胞沉淀。弃去上清液，用移液器上下吹打以重新悬浮细胞。在35毫米培养皿盖内侧，于100微升培养基中滴加多个20微升的细胞悬液液滴。将皿盖盖在培养皿上，放入培养箱中孵育数小时，使细胞聚集成团。制备背侧脊髓植入物时，需保持 freshly harvested 状态。将11天大的大鼠胚胎置于冰上。在L-15培养基中，使用锋利的钨针从每个胚胎前肢芽下方的躯干区域切取4至6个体节的组织片段。用塑料移液管将组织收集到四孔板的一个孔中。将平皿置于冰上。当所有组织段均完成解剖后，使用移液器将组织块转移至另一含有 L-15 培养基加组织块培养液的平皿孔中。将组织在室温下孵育，时间不超过 5 分钟。为防止细胞死亡，切勿过度消化组织。向无菌培养皿的第三个孔中加入一毫升含有5%热灭活山羊血清的新鲜L-15培养基，并将组织块转移至该孔中。在消化液孵育结束后，将组织置于冰上静置一小时。为了使后续在微型离心管中的解剖操作更简便，向360微升胶原酶溶液中加入40微升10倍最低必需培养基，并短暂涡旋混匀，然后在微量离心机中离心沉淀。溶液将呈黄色，应尽可能保持在冰上，以防止每批胶原蛋白在滴定过程中凝固。使用0.8摩尔的碳酸氢钠，使胶原蛋白溶液略呈橙色。每次加入后均需混合溶液。当胶原蛋白溶液呈现此颜色时，若保持在冰上将维持液态，但在恢复至室温时即处于易于凝固的状态。若混合后溶液变为粉红色，则需重新开始，使用新的胶原蛋白管。在洁净的四孔板中，每孔加入20微升胶原蛋白。用移液枪枪头将胶原蛋白分散，形成一个小垫状。室温下静置约10分钟，使胶原蛋白凝固。在解剖显微镜下，使用新磨制的钨针和一对精细镊子，用钨针从一个胚胎中去除脊髓周围存在的中胚层组织，并去除脊髓的腹侧部分，该区域可通过底板的存在加以区分。在腹侧最边缘，腹侧板略厚于背侧边缘的顶板。在此示例中，脊髓腹侧朝下。沿腹侧板平行小心切割组织，并弃去脊髓腹侧的五分之一部分。使用针垂直地将背侧脊髓离体组织纵向切开。确保切口尽可能整齐，必要时可重新修剪边缘。使用连接直径为0.5毫米玻璃毛细管的口控移液装置将每个离体组织转移至独立的胶原垫上。用钨针将转染的共细胞聚集体切成若干小方块，其宽度应与背侧脊髓的侧边宽度大致相同。说明：使用口吸管将其中一个方块转移至胶原垫上，并用口吸管吸除多余的液体。切勿过度吸液，因为残留少量液体有助于后续胶原蛋白的施加。在垫片上施加4 µL预处理的胶原蛋白。使用钨针将胶原蛋白移动至植入物上方，注意不要直接接触组织。通过移动针头调整胶原蛋白中的每个x explan，使共培养细胞团位于其侧缘附近。让胶原蛋白凝固 15 到 20 分钟。再使用 4 微升胶原蛋白重复一次包埋操作，以确保在转入下一个胚胎前，该 x explan 已完全被胶原蛋白包裹。在组织培养罩中加入 0.5 毫升培养基，于培养箱中培养 30 至 40 小时。在通风橱内，用 0.5 毫升含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定组织块 45 分钟。始终保持组织置于冰上，并用 0.5 毫升封闭与通透溶液 PBTN 洗涤两次。将 x 个外植体置于封闭溶液中，在 4°C 下孵育，最好过夜。使用镊子将 X 外植体从四孔板中取出，并将其分别放入 48 孔板的每个孔中。每孔加入 200 µL 一抗。为观察 comm choral 轴突，请使用小鼠抗 ttag 抗体；为确定交叉细胞转染是否成功，需加入针对待测分子的抗体。4°C 下孵育过夜。在4°C条件下，用PBTN封闭液对每个样本进行洗涤，每次一小时，共洗涤五次。移除PBTN，向每个样本中加入200微升二抗。用封口箔覆盖板孔以防止褪色，并在4°C条件下过夜孵育。按照之前的方法用PBTN清洗样品五次。将每个外植体转移至三孔凹面载玻片中。去除多余的液体，用Invecta Shield封片剂封片，然后盖上盖玻片。将载玻片存放在避光的文件夹或盒子中，置于 4 或 -20 摄氏度条件下，直至准备在显微镜下观察。接下来，我们将展示一些 X 外植体在培养、固定、染色并经共聚焦显微镜成像后的代表性图像。图 A 显示，由白色轮廓标出的菱脑顶部板的 X 外植体能够使 Tag1 阳性的合唱神经轴突远离其自身，表明顶部板是轴突化学排斥因子的来源。图 B 显示，分泌 M tact 信号分子骨形态发生蛋白（BMP7）的共细胞能够以类似于顶部板的方式排斥纹状体轴突。仅转染表达质粒的细胞对轴突的取向无任何影响。我们刚刚向您展示了如何分离、定向并培养脊髓的离体组织，并利用细胞聚集体来判断候选信号分子是否具有轴突重定向活性。在进行该操作时，重要的是尽可能将胶原保持在冰上，并用胶原完全包裹离体组织，以避免其与培养基直接接触。最后，仅需培养至轴突延伸到x explant的腹侧边缘即可。就是这样。感谢观看，祝您的实验顺利。I.

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