Name: 优化的纤维蛋白凝胶珠检测血管生成的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 学习纤维蛋白凝胶珠检测技术，用于体外血管生成研究。本方法通过延时成像展示血管出芽、管腔形成和吻合过程，为血管生物学研究提供可重复的实验方案。

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细胞准备
<ol>
<li>在包被前1-2天，用M199培养基加10% FBS和青霉素-链霉素（1:100）培养HUVEC和成纤维细胞。</li>
<li>在HUVEC成球前一天以及成纤维细胞包埋前一天，更换为EGM-2培养基（Clonetics）。</li>
<li>A&nbsp;每微球约需 400 个 HUVEC。</li>
<li>每孔需要 20,000 个成纤维细胞。</li>
</ol>
用HUVEC包被磁珠 - 第-1天
<ol>
<li>用胰蛋白酶处理 HUVEC。</li>
<li>让微珠自然沉降（切勿离心！）。吸除上清液，并用 1 mL 温热的 EGM-2 培养基短暂洗涤微珠。</li>
<li>在 FACS 管中，将 2500 个微珠与 1×106 个 HUVEC 混合于 1.5 mL 温热的 EGM-2 培养基中。将管子垂直放置于培养箱内。（此量适用于约 10 个孔，可根据需要按比例放大）</li>
<li>在 37°C 下孵育 4 小时，每隔 20 分钟轻轻摇动一次管子。（良好的包被对出芽至关重要。）</li>
<li>4 小时后，将包被好的微珠转移至含 5 mL EGM-2 培养基的 T25 培养瓶中，过夜静置。</li>
</ol>
将包被珠嵌入纤维蛋白凝胶中 -&nbsp;第0天
<ol>
<li>配制 2.0 mg/mL 的纤维蛋白原溶液（参见配方部分）。</li>
<li>向纤维蛋白原溶液中加入 0.15 Units/mL 的抑肽酶。</li>
<li>将包被的微珠转移至 15 mL 圆锥形离心管中，静置使微珠沉降。用 1 mL EGM-2 重悬微珠，并转移至 1.5 mL 离心管中。</li>
<li>用 1 mL EGM-2 缓冲液缓慢吹打洗涤微珠 3 次。</li>
<li>在盖玻片上计数微珠，并将其重悬于纤维蛋白原溶液中，浓度约为 500 个微珠/mL。</li>
<li>向每孔中加入 0.625 Units/mL 的凝血酶。</li>
<li>向 24 孔板的每孔中加入 0.5 mL 纤维蛋白原/微珠悬浮液。 每个孔必须更换移液器吸头！！！ </li>
<li>用移液器吸头轻柔吹打 4 至 5 次，使凝血酶与纤维蛋白原混合均匀。注意避免产生大气泡。</li>
<li>将培养板在生物安全柜中静置 5 分钟，然后放入 37°C 培养箱中孵育 10–15 分钟，以形成凝块。</li>
<li>等待凝块形成期间，对成纤维细胞进行胰酶消化处理。</li>
<li>每孔缓慢滴加 1 mL EGM-2 培养基。</li>
<li>将成纤维细胞以每孔 20,000 个细胞的密度接种到纤维蛋白凝胶表面。</li>
</ol>
注意事项：
通常，当纤维蛋白凝胶形成时，你会看到凝胶中有微小的气泡。不用担心，这些气泡会在3-4天内消失。
每隔一天更换一次培养基，即第2、4、6天等。
到第3天或第4天时，你应该开始看到萌发。

<ol><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microcarrier-based+cocultivation+system+for+the+investigation+of+factors+and+cells+involved+in+angiogenesis+in+three-dimensional+fibrin+matrices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro.</a> Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).</li>
<li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).</li>
</ol>

目前人们日益达成共识：三维（3D）体外血管生成实验所提供的模型比二维培养更接近体内真实环境。显然，理想的三维系统应具备可重复性，并能够模拟血管生成的多个主要阶段。尽管已有多种三维实验方法被开发出来，但其中许多方法要么依赖难以获取的微血管内皮细胞，要么仅能重现部分发育阶段。在本视频中，我们描述并演示了一种经过优化的体外血管生成实验方法，该方法采用人脐静脉内皮细胞（EC），这类细胞易于获取，也是血管研究中最常用的内皮细胞类型。该实验在数天内可稳定地形成具有清晰、通畅的细胞间管腔且被极化内皮细胞包围的长管状结构。同时还能观察到内皮细胞分支及血管融合（即吻合）的后期阶段。重要的是，在这些培养体系中，HUVEC 经历了与微血管内皮细胞在体内或体外所见完全相同的全部形态学变化，包括出芽、迁移、排列、增殖、成管、分支以及吻合等过程。同时，HUVEC 的基因表达谱也发生相应改变，更趋近于微血管内皮细胞的表达特征。综上所述，我们提出了一种优化的体外血管生成模型方案，能够重现该过程中的多个关键阶段。

<table><tbody><tr><td>微载体Cytodex-3珠</td><td>试剂</td><td>Amersham</td><td>17-0485-01</td><td>10 g/瓶。取1.0.5 g干燥珠粒，加入50 mL PBS（pH = 7.4）中，室温下水化溶胀至少3小时。使用50 mL离心管并置于摇床上。2. 静置使珠粒沉降（约15分钟），弃上清液，用新鲜PBS（50 mL）洗涤数分钟。3. 弃去PBS，加入新鲜PBS：25 mL -&amp;gt; 20 mg/mL =&amp;gt; 60000 珠粒/mL，或50 mL -&amp;gt; 10 mg/mL =&amp;gt; 30,000 珠粒/mL。4. 将珠悬液转移至硅化玻璃瓶（如Windshield Wiper或Sigmacote处理过的瓶子）中。5. 在115&amp;#x00B0;C下高压灭菌15分钟，对珠粒进行灭菌。6. 4&amp;#x00B0;C保存。</td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1153</td><td>10 mg/瓶。用去离子水将冻干粉配制成4 U/mL溶液，经无菌滤器过滤，分装为每管1 mL，-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>纤维蛋白原 I型</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8630</td><td>1 g。将纤维蛋白原溶解于DPBS中，终浓度为2 mg/mL。注意可凝固蛋白的百分比，并据此调整浓度。在37 &amp;#x00B0;C水浴中加热溶解，通过倒置混匀，禁止涡旋震荡。使用0.22 µm滤器无菌过滤。</td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3399</td><td>22 mg = 1,000单位。用无菌水配制成50 U/mL溶液，分装为每管0.5 mL，-20 &amp;deg;C保存。</td></tr></tbody></table>

优化的纤维蛋白凝胶珠管形成实验用于血管生成研究

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

血管生成是一个复杂的多步骤过程，在血管生成刺激因子的作用下，由现有脉管系统形成新的血管。这些步骤包括：基底膜降解、内皮细胞（EC）在细胞外基质中增殖和迁移（出芽）、内皮细胞排列成索状结构、分支、管腔形成、吻合以及新基底膜的形成。目前已开发出多种体外检测方法用于研究该过程，但大多数方法仅能模拟血管生成的某些阶段，且检测中形成的血管结构在形态上通常与体内血管存在差异。基于Nehls和Drenckhahn的前期工作，我们优化了一种利用人脐静脉内皮细胞和成纤维细胞的体外血管生成检测模型。该模型可重现血管生成的所有关键早期阶段，更重要的是，所形成的血管具有由极化内皮细胞包绕的通畅细胞间管腔。实验中将内皮细胞接种于Cytodex微载体表面，并嵌入纤维蛋白凝胶中，成纤维细胞则铺在凝胶表面，提供促进微载体表面内皮细胞出芽所必需的可溶性因子。数天后可观察到大量形成的血管结构，可通过相差显微镜和延时显微成像轻松观察。本视频展示了建立该培养体系的关键操作步骤。

关键词：血管生成，体外检测，人脐静脉内皮细胞，成纤维细胞，纤维蛋白凝胶，管腔形成，Cytodex微载体，延时显微成像

本视频展示了体外血管生成实验的方案，该实验可重现血管生成的多个阶段。展示了出芽、管腔形成、分支和吻合——血管生成的关键特征——的时间推移图像。

血管生成是一个复杂的多步骤过程，在血管生成刺激因子的作用下，新的血管从已有的脉管系统中形成。这些……

大家好，我叫Mar Katsu，来自加州大学欧文分校分子生物学与生物化学系的Hughes实验室。我将进行纤维蛋白珠分析实验。整个过程需要两天时间完成。第一天需用阴部或人脐静脉内皮细胞包被微珠。第二天则将这些包被后的微珠嵌入纤维蛋白凝胶中，随后在凝胶表面接种成纤维细胞。我们利用该检测方法在体外研究血管生成的多个步骤。第一天，在第一部分中，我们使用CY X三号微珠；第二天，我们使用这三种试剂：纤维蛋白原、凝血酶和抑肽酶cytx。珠子三号来自亚马逊生物科学公司，经过特殊胶原蛋白包被，以便内皮细胞能够黏附于珠子上。下一个试剂是纤维蛋白原，购自Sigma公司。该成分在珠子检测中形成实际的凝胶或血凝块。凝血酶是一种凝血因子。该蛋白可将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，因此我们将其加入检测体系中。抑肽酶是一种血清蛋白酶抑制剂。我们使用此方法防止蛋白酶降解纤维蛋白凝胶。因此，您在此处看到的是 vac。这些是我们用于搏动实验的细胞。这些特定的细胞位于第3代，我们通常使用第2代到第3代的细胞。可以看出，这些细胞呈现出典型的鹅卵石样形态。此时，我认为这些细胞已经达到100%汇合度，您应在此时使用这些细胞进行实验。这是我们第二次检测的第一天，操作方法如下：基本上，只需将试管轻轻翻转数次，使磁珠悬浮均匀，如下所示，之后每20分钟重复此操作一次，持续4小时。基本上就是这样。好的，这是我们进行 A b 检测的第二天，这些微珠刚刚被内皮细胞包被。你们在这里看到的基本上突出了一个未经包被的微珠与一个已包被微珠之间的差异。左侧明显是一个未包被的微球，可以通过微球表面的凸起结构来判断。包被后的微球应看起来像迷你高尔夫球。可以看出这是分布情况。蜜蜂的分布相当均匀。你几乎不应该看到任何未被包被的蜜蜂。你可能会看到一两只像刚才那只一样，但大多数情况下，我可以说99%的蜜蜂都应该有涂层。这些蜜蜂已在培养箱中过夜孵育。接下来，我将把含有某些物质的培养基转移到50 mL的锥形管中。然后，我将清洗FLA，以去除粘附在PLA底部的过量培养基，并将它们一并转移至锥形管中。磁珠容易粘附在flaz上，因此我将取另外5 mL的EGM-2培养基或普通培养基，冲洗这些粘附的磁珠。现在，我将把这些洗涤用的珠子转移到锥形管中。将含有珠子的培养基转移到锥形管后，珠子会在几分钟内沉降到管底。虽然不太明显，但可以看到管底形成了一层薄薄的珠子层。现在我将吸除旧的培养基。好的，接下来我将用1毫升的eGM-2培养基洗涤磁珠，然后将其转移至一个离心管中。目前我正在进行磁珠的洗涤操作，操作时需要格外小心，因为磁珠非常脆弱。因此，你需要以非常缓慢的速度进行振荡。只需像这样操作即可。不过，珠子的液层确实很难看清。静置几分钟，使所有珠子沉降到管底。接下来，我将吸除旧的培养基，并用1 mL EGM-2培养基洗涤一次，共重复洗涤三次。不要将培养基完全吸走，吸到

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优化的纤维蛋白凝胶珠检测血管生成的研究

血小板黏附级联反应发生在剪切流存在的条件下，而传统的（静态）孔板检测方法并未考虑这一因素。本文报道了一种利用微流控孔板形式模拟生理剪切流条件的血小板聚集检测方法。...

基于微流控流动小室的血小板黏附与聚集流动实验

本视频展示了一种改良的基于微载体珠的实验方法，该方法结合了周细胞以研究血管生成早期阶段的内皮细胞出芽。该实验提供了一种体外模型，用于理解血管生成的分子机制以及抗血管生成治疗药物的作用。...

用于早期血管生成评估的微珠出芽实验：一种体外微珠模型，用于研究周细胞存在条件下的内皮细胞出芽

采用延时显微镜和图像处理技术，在环境可控的生物反应器中对成纤维细胞介导的凝胶收缩及纤维蛋白纤维重排进行为期48小时的观察与分析 时期。...

观察与定量成纤维细胞介导的纤维蛋白凝胶收缩

重现器官特异性的微环境（可刺激局部血管生成）对于受损组织的成功再生至关重要。本报告展示了一种新方法，即将纤维蛋白凝胶植入活体小鼠的肺表面，以探究肺特异性微环境如何调控成年小鼠中的血管生成及肺泡再生。...

在小鼠肺部植入纤维蛋白凝胶以研究肺特异性血管生成

将癌细胞嵌入胶原凝胶中，然后夹在无细胞的纤维蛋白凝胶内，以构建一种三维培养系统，在该系统中可监测癌细胞的侵袭性及卫星肿瘤的形成。...

三维培养实验用于探究癌细胞侵袭性及卫星肿瘤形成

本方案介绍了一种新型 体外 更适当地模拟该过程的珠式分析法 体内...

将周细胞整合到内皮细胞微球出芽实验中

本文介绍一种利用患者来源的手术切除纤维血管组织进行三维原生组织表征和离体培养，以研究增殖性糖尿病视网膜病变病理生理学的实验方案。该离体培养模型还可用于测试或开发新的治疗方法。...

增殖性糖尿病视网膜病变中纤维血管并发症的离体组织培养模型

本方法描述了在标准化的微流控平台上培养由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的内皮细胞，形成40条可灌注的三维微血管。该平台能够以可扩展且高通量的方式研究三维环境中由浓度梯度驱动的血管生成出芽过程，包括出芽的吻合及稳定化。...

体外研究诱导多能干细胞来源内皮细胞灌注三维血管生成出芽的标准化与可扩展检测方法

本文所述方法可用于评估试剂对血管生成或血管通透性的影响 体内...

已修改 体内 用于血管生成研究的基质凝胶栓塞实验

机械分离的基质血管组分（SVF）与纤维蛋白水凝胶联用，可为具有多种适应症的活性脂肪来源基质细胞提供一种简便且高效的载体，适用于组织工程或伤口愈合等用途。本文介绍了一种用于转化研究和临床应用的机械法SVF（mSVF）-纤维蛋白水凝胶构建物的制备方法。...

机械分离基质血管组分与纤维蛋白水凝胶的联合应用：一种处理方案

本文介绍了一种纤维蛋白原-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）方案，用于快速分离并显示无疣星虫（Sipunculus...

通过纤维蛋白原-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速分离与显示Sipunculus nudus中的活性纤维蛋白溶解因子

学习纤维蛋白凝胶珠检测技术，用于体外血管生成研究。本方法通过延时成像展示血管出芽、管腔形成和吻合过程，为血管生物学研究提供可重复的实验方案。

优化的纤维蛋白凝胶珠管形成实验用于血管生成研究

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