优化的纤维蛋白凝胶珠检测血管生成的研究
April 29th, 2007
本视频演示了一个协议，在体外血管生成试验，概括的血管生成的几个阶段。显示图像时间的推移，发芽，管腔形成，分支和吻合 - 血管生成的关键特征 - 。
嗨，我叫 Mar Katsu。我来自加州大学欧文分校分子生物学和生物化学系的休斯实验室。我将进行纤维蛋白珠检测。
整个过程需要两天才能完成。第一天涉及用耻骨或人脐静脉内皮细胞包被珠子。第二天包括将这些包被的珠子包埋到纤维蛋白凝胶中，然后将成纤维细胞分层在这些凝胶上。
我们使用该测定法来研究体外血管生成的许多步骤。第一天，在第一部分，我们使用 CY X three Beads。然后第二天我们使用这三种试剂，纤维蛋白原凝血酶和抑肽酶 cytx。
珠子 3 来自 Amazon Biosciences，它们特别编码胶原蛋白，因此内皮细胞会粘附在珠子上。所以下一个试剂是纤维蛋白原，我们从 sigma 得到它。这在节拍测定中形成实际的凝胶或凝块。
凝血酶是一种凝血因子。这种蛋白质将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，这就是我们将其添加到检测中的原因。抑肽酶是一种血清蛋白酶抑制剂。
我们使用它来防止蛋白酶降解纤维蛋白凝胶。所以你在这里看到的是 vac。这些是我们用于心跳测定的细胞。
这个特定的细胞，这些细胞在斑块 3 处。我们通常从补丁 2 到补丁 3 使用它们。你可以看到这些 heve 呈现出这种独特的鹅卵石形态。
就在这一点上，我相信这些细胞处于 100% 的 co fluency 状态，你会想在这个 Fluency 使用这些细胞。所以这是我们 beat two 分析的第一天，这就是我们的做法。基本上，只想翻转管子几次，以获得这样的节拍和悬架，您将每 20 分钟进行一次，持续四个小时。
差不多就是这样。好的，这是我们 A b 检测的第二天，这些微珠刚刚包被了内皮细胞。您在这里看到的基本上是非涂层微珠与单涂层微珠之间的区别。
左边显然是无涂层的珠子。您可以通过珠子表面的凸起来判断。涂层珠子应该看起来像迷你高尔夫球。
您可以看到它是 distribution。蜜蜂相当均匀。你真的不应该看到任何没有涂层的蜜蜂。
你可能会在那里看到一两个类似的，但在大多数情况下，大多数，我想说 99% 都应该被涂层。所以这些是考虑在孵化器中过夜的蜜蜂。我要做的是将包含一些契约的介质传输到 50 mil 锥形管中。
然后，我将清洗 FLA 以去除粘在 PLA 底部的多余饲料，并将它们转移到锥形管中。珠子往往会粘在玻璃上。所以我要做的是再取 5 密耳的 EGM 2 或介质，洗掉这些卡住的珠子。
所以现在我要把这些洗涤珠转移到锥形管中。因此，将带有微珠的培养基转移到锥形管后，微珠会在大约几分钟内沉降到管底部。所以很难看到，但底部也有一小层珠子。
所以现在我要吸取旧媒体。好的，现在我要用一磨 e GM two 清洗珠子，然后将其转移到 fendor 管中。所以我现在正在做的是清洗珠子，你要非常非常小心，因为珠子非常脆弱。
所以你想以非常慢的速度刺激它。所以就这样做吧。不过，珠子层真的很难看清。
只需几分钟，所有的珠子，你就会沉到底部。所以现在我要做的是，我要吸出旧介质，然后用另一研磨 EGM 2 清洗它。你要这样做三次。
你不想把所有的媒体都吸到这个水平是好的。所以，你又想非常缓慢地上下管道。所以这个过程是你必须快速工作，因为我要做的是我要做的是拿一个 L quad 到麦克风，10 毫升我们的珠子溶液，把它转移到盖子上，数出数字 B，得到每密耳的珠子浓度。
珠子很快沉到两者的底部。所以你必须快速工作。我要去 Gold Media 上。
同样，您必须非常快速地工作。我的移液器也都准备好了，只是一切都简化了。现在我要再次清洗珠子，非常缓慢地上下管道。好？
然后，取另一根管子 B 20，加入两根 10 微升的管子。Quas 在封面上，就像我们取两个，因为我喜欢获得平均的散装滴。我们刚刚将两夸脱的 10 微升进料溶液转移到这个盖玻片上。
这是我们如何量化 1 mil EGM 2 中珠子数量的一个过程。基本上，你只需数你看到的珠子数量，我通常做两个，取两个麋鹿四边形，从试管中计算平均值，得到每微升珠子的浓度。所以我数了一下试管里的珠子数量，大约有一千个珠子。
我已经制定了我的 friedgen 解决方案。它还含有一种蛋白质，最终浓度为 0.15 单位/密耳。我有 2.5 mils 的 friedgen。
因此，这将得到总共五口井，因为每个井的体积为 500 微升。因此，为了将磁珠放入纤维蛋白原溶液中，我首先询问 rate 培养基。我将取大约 5， 600 微升的纤维蛋白原，用它来混合节拍并将其转移到纤维蛋白原管中。
所以现在你要做的是，你想要取大约 500 600 微升纤维蛋白原，用它来混合珠子，然后将它们转移回试管中。所以现在，在你把 FibroGen 添加到之前，嗯，你要先添加凝血酶。添加 0.625 单位/mil 的浓度，然后将其直接添加到每个孔的中心。
所以现在你看到我向每个孔中添加了凝血酶，它们直接位于中心。现在下一步将是添加光纤引擎。所以蜜蜂再次记住，它们很快就安顿在了管子的底部。
所以我要用我的 fiber ular L quad，但在此之前，我要像这样混合这些野兽，只是为了让它们进入溶液中，使它们从底部脱落。你知道什么时候想慢慢地上下管道。所以这是协议中最重要的一步。
首先，您要确保在将纤维添加到中心和凝血酶时缓慢地上下管道。因此，将移液器吸头直接放在中间，并在执行此作时上下移液。您根本不想移动板，因为任何轻微的移动实际上都会在珠子实际上聚集到孔的中心产生效果。
您希望它均匀分布。像这样上下管道几次，非常缓慢，这样就不会产生气泡。气泡实际上会阻碍凝胶的可见度。
因此，您希望尽可能慢，不要在每次向孔中添加纤维时移动板并更换移液器吸头。我们要让这些凝块凝固五分钟。然后，我们将在 5 分钟后将此显示器转移到 37 度的培养箱中，再过 10 到 15 分钟。
已经五分钟了。纤维已经形成了凝块。我通常做的是快速浏览一下珠子是否均匀分布，并且从井到，嗯，你看起来还不错。
大约，我想说每孔有 200 颗珠子，平均而言，您希望它在 200 到 250 之间。我现在要做的是将其插入 37 度的培养箱中，并孵育大约 10 到 15 分钟。这些是我们在搏动测定中用于与 IC 共培养的长距离原始细胞。
这是一个融合培养瓶。您注意到 blass 与 beck 相比是非常不同的形态。它们更瘦，看起来几乎像绳子。
我们所做的就是基本上把这个烧瓶化，收获肺火冲击波，并在每口井中放置 20， 000 次火冲击波。我刚刚对火焰爆炸进行了分析，并以每密耳百万个细胞或每微升 1000 个细胞的浓度悬浮了 em。现在我要将其添加到盘子中。
我刚刚从培养箱中取出了我们的板子。10 到 15 分钟后，纤维蛋白形成一个完整的凝块。但现在我要做的是，我要在每个孔中加入一磨 EGM 2，我将逐滴进行，因为如果你将 e GM 2 添加到每个井中，那么太快了，你实际上可能会撕裂凝胶。
所以这基本上做了一个很好的缓慢的步伐从一个井到另一个井。所以我只用 trinia 来发射爆炸，我数了数它们，然后暂停了爆炸，火焰爆炸的浓度通常为每密耳 100 万个细胞或每微升 1000 个细胞。我要做的是取 20 微升并将其添加到每个孔中。
在执行此作时，您希望每次都更换移液器吸头。取另一块火焰爆炸，然后将火焰爆炸直接添加到井的中心。再说一次，每次添加火焰爆炸时，我都会改变尖端。
所以我刚刚在纤维蛋白凝胶上添加了 fire blasts。纤维喷射在 e GM two 的工厂中。凝胶包含涂层珠子，当我们聚焦到平面上时，您实际上可以看到几个珠子。
几天后，纤维原始细胞最终会增殖并迁移，在纤维蛋白凝胶上形成单层。几天后，大约在第三天、第四天左右，你开始看到一些漂亮的珠子发芽。我刚刚完成了纤维蛋白微珠检测，回顾一下，我们所做的是将 endo saal 细胞编码到微珠上，然后将这些微珠包埋到纤维蛋白凝胶中，然后分层在这些凝胶上。
所以在接下来的三四天里，我们开始看到一些漂亮的芽从这些珠子上冒出来。我真正喜欢这些视频协议的地方在于，观众实际上可以可视化这些步骤，而这些步骤你真的无法通过书面协议传达。因此，我希望观众在这些视频中看到的是，他们能够在自己的实验室中成功执行这些 fi BTA SC。
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概述
此视频展示了体外血管生成测定的协议，该测定重现了血管生成的几个阶段。显示了芽生、腔形成、分支和吻合等血管生成的关键特征的延时图像。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 血管生成
背景
- 血管生成是新血管形成的过程。
- 它对各种生理和病理过程至关重要。
- 体外测定有助于研究血管生成的机制。
- 纤维蛋白珠测定是用来研究这一过程的常见方法。
研究目的
- 展示用于研究血管生成的纤维蛋白珠测定协议。
- 通过延时成像可视化血管生成的关键阶段。
- 为该领域的研究人员提供一种可重复的方法。
使用的方法
- 用内皮细胞涂覆珠子。
- 将涂覆的珠子嵌入纤维蛋白凝胶中。
- 在凝胶顶部铺设成纤维细胞。
- 使用延时成像捕捉血管生成阶段。
主要结果
- 观察到成功的芽生和腔形成。
- 记录了分支和吻合。
- 延时图像有效地说明了血管生成阶段。
- 该测定提供了血管形成动力学的洞察。
结论
- 纤维蛋白珠测定是研究血管生成的宝贵工具。
- 延时成像增强了对该过程的理解。
- 该方法可应用于血管生物学的各种研究问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
This assay enables mechanistic de-risking of angiogenic targets by recapitulating early vascular morphogenesis in a reproducible in vitro system. It supports target validation and phenotypic screening by providing quantitative readouts of sprouting, lumen formation, and network assembly. The model enhances predictive confidence in lead identification by bridging cellular mechanisms to tissue-level angiogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on angiogenic pathway modulation through EC sprouting and lumen formation.
- Operational Value: Enables functional target validation via polarized EC behavior and patent intercellular lumen development.
- Scientific Value: Supports predictive confidence by modeling key early angiogenesis stages relevant to vascular pathway de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by standardizing EC-coated bead distribution in fibrin gels.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through controlled bead concentration (200–250 per well) and fibroblast layering (20,000 per well).
- Scientific Value: Delivers quantitative dependent variable measurements (sprout count, lumen formation) for compound effect assessment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system continuity from discovery through preclinical validation of angiogenic modulators.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by correlating in vitro vessel maturation with in vivo-like morphogenesis.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking by isolating angiogenic variables (EC coating, fibrin gel integrity, fibroblast paracrine support).
Pipeline & Workflow Integration
The assay integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling quantitative angiogenesis readouts prior to preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via EC sprouting and cord formation in response to angiogenic stimuli.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized bead coating, gel formation, and fibroblast co-culture.
- Analytics: Provides quantitative measurements of lumen formation, branching, and anastomosis for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via polarized EC and vessel-like structures resembling in vivo angiogenesis.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for angiogenic target screening across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through recapitulation of early angiogenesis stages.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined bead-to-gel ratios and timed fibroblast layering.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in angiogenic mechanism of action.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on quantitative sprouting and lumen formation metrics.
Implementation Considerations
- Requires cell culture expertise for EC isolation, coating, and confluence monitoring (patches 2–3).
- Depends on precise instrumentation for bead concentration quantification (10 µL aliquots, cover slip counting).
- Necessitates cross-team standardization of fibrinogen-thrombin-aprotinin ratios and gel solidification timing.
- Involves adaptation considerations for EC source and fibroblast type across model systems.
- Includes practical limitations such as bead fragility during washing and gel disruption from rapid media addition.
