鉴定酵母中表达细菌III型效应蛋白所诱导的生长抑制表型

开始本实验方案时，选择一个用于表达目标细菌效应蛋白的载体。在酵母及酵母菌株中，将该载体转化至酵母细胞内。随后诱导效应蛋白的表达。

诱导后的细胞进行裂解，随后通过蛋白质印迹分析以验证效应蛋白的表达。在确认效应蛋白表达后，将细胞培养并进行10倍系列稀释，点样于抑制性和诱导性培养基上。最后，经过两到三天，分析酵母的生长情况。

大家好，我是特拉维夫大学植物科学系Guido Cesa博士实验室的Do Solomon。今天我们将向您展示一种用于鉴定细菌III型效应子在酵母中表达所诱导的生长抑制表型的实验方法。我们实验室利用该方法研究革兰氏阴性致病菌III型效应子的功能，并以此作为辅助工具来鉴定效应子TIC的靶标。

那么让我们开始吧。在设计适用于表达目标三型效应蛋白的酵母系统时，应考虑并优化几个重要因素。首先是驱动效应蛋白表达的启动子。

由于细菌III型效应子可能对酵母细胞具有毒性，因此应使用诱导型启动子来控制其表达。本实验中将使用GAL1启动子。第二个因素是效应子基因的拷贝数。

当效应基因由一个2微米质粒携带时，可实现高水平表达。使用含有着丝粒的质粒可获得中等水平表达，而当效应基因通过同源重组整合到酵母基因组中时，则实现低水平表达。第三个需要考虑的因素是表位标签的选择，即在缺乏针对目标效应蛋白的特异性抗体时，用于验证蛋白表达的表位标签。

常用的标签包括 M 血凝素 HA 或 Flag 标签，这些标签均有可靠的商业化抗体可供使用。我们建议仅使用一个拷贝的标签，以尽量减少对效应蛋白结构和活性产生的不良影响。最后但同样重要的是，用于表达的酵母菌株必须对该表达载体的可选择标记具有营养需求性。

为了获得用于转化的酵母细胞，从新鲜平板上挑取一个酵母菌落，接种到15毫升聚丙烯管中的3毫升YPD培养基中并涡旋混匀。将培养管短暂放入摇床中，于30摄氏度恒温振荡培养过夜。次日早晨，从摇床中取出培养物，在室温下以800 ×g离心5分钟。

离心后，彻底去除上清液，并将细胞重悬于1毫升Resus重悬缓冲液中，通过涡旋振荡器以最大速度混合约10秒。对于每种需要转化的质粒以及一个额外的对照转化，取100微升细胞悬液转移至微量离心管中。除对照管外，向每管中加入5微升单链鲑鱼精子DNA和250至500纳克的质粒DNA。

接下来，向每支试管中小心加入 650 µL 转化溶液，并涡旋混匀。将试管置于 30 °C 摇床中孵育 30 分钟。孵育结束后，向每支试管中加入 70 µL DMSO，通过倒置试管 10 至 15 次进行混匀，注意避免细胞破裂。

请勿涡旋振荡试管。将试管放入42摄氏度预热的水浴中，孵育15分钟。15分钟后，从水浴中取出试管，立即置于冰上冷却2分钟。

待试管冷却后，通过离心收集细胞，然后使用移液器小心去除黏稠的上清液。将每个沉淀重悬于150 µL无菌双蒸水中，并将细胞悬液涂布于含有适当选择性培养基的平板上。将平板打开静置2分钟，随后在超净工作台中使其干燥。

随后，将平板置于30摄氏度的培养箱中培养两到三天，以生长酵母细胞。为制备蛋白提取物，从新鲜平板上挑取酵母菌落，接种于3毫升相应的抑制性培养基中，并涡旋混匀。次日，将培养管短暂置于30摄氏度的摇床中。

将培养物从滚筒上取下，在室温下以800 G离心五分钟，弃去上清液并重悬细胞沉淀。加入3毫升无菌双蒸水，涡旋混匀后再次离心，弃去上清液，并将细胞重悬于3毫升无菌双蒸水中。随后，将200微升细胞悬液转移至一个新的15毫升离心管中，管内已加入3毫升相应的诱导培养基，并通过涡旋充分混匀。

将试管放入摇床，在30摄氏度下过夜孵育，次日早晨取出。取1毫升培养物，若为低密度培养物则取更多，转移至微量离心管中。在室温下以800 ×g离心5分钟收集细胞，此后操作均需在通风橱中进行，以避免吸入有毒的Beamer capto乙醇蒸气。

使用移液器小心吸去上清液，并将细胞沉淀重悬于100 µL预冷的裂解液中。剧烈涡旋混匀，置于冰上孵育30分钟。在30分钟孵育期间，测定滴定100 µL裂解缓冲液至pH 9–10所需6 mol/L盐酸的体积。

为此，将不同体积的盐酸加入10个不同试管中各含100 µL裂解缓冲液的溶液中，通过pH指示试纸检测溶液pH值，确定适合的盐酸体积后，将其加入裂解物中并涡旋混匀。然后向裂解物中加入50 µL的3×上样缓冲液，涡旋混匀。用针头在微型离心管盖上刺一个小孔，将裂解液置于加热块上煮沸5分钟。煮沸后，将溶液在室温下冷却2分钟。

然后涡旋裂解液并离心10秒。裂解液现可直接用于免疫血液分析，以制备用于点样实验的细胞。次日按照前述方法培养每种菌株的3毫升培养物。

准备两块不含亮氨酸的合成完全培养基平板。其中一块平板的培养基中添加2%葡萄糖，另一块平板的培养基中添加2%半乳糖和1%棉子糖。将平板在室温下的无菌超净工作台中干燥20分钟。

收集细胞，将每份细胞沉淀重悬于三毫升无菌DDW中。重复离心步骤，并再次将细胞重悬于三毫升无菌DDW中。测定每种培养物的光密度（OD），然后在无菌微量离心管中制备OD600为1的1毫升细胞悬液。

接下来，使用三个装有900 µL无菌去离子水的无菌微量离心管，从每种细胞悬液中制备三组十倍系列稀释液。将干燥的平板放置在网格上，针对每种培养样品，依次取四种稀释液各10 µL点样。点样后，将平板在超净工作台中打开放置数分钟。

当斑点干燥后，盖上培养皿并将其置于30摄氏度的培养箱中培养两到三天。接下来，我们将展示酵母点板实验检测生长抑制的结果。此处展示的表型由III型效应子的表达所诱导，这些III型效应子包括细菌的A-V-R-P-T-O hop、AA one one以及AAV RE one。

在含有着丝粒的质粒上表达的番茄假单胞菌（Pseudomona Riner）的A-V-R-P-T-O和HOP AA one one在酵母菌株的抑制性培养基中表达时，携带这些质粒的酵母菌株表现出与含有空载体的对照菌株相似的生长情况。而携带AAV RE one的酵母菌株则显示出轻微的生长减缓，这可能是由于GAL one启动子的泄漏以及AV RE one的高细胞毒性所致。在诱导条件下，AV E one或HOP AA one one的表达均导致显著的生长抑制表型，表现为任何稀释度下均无菌落形成。相比之下，A-V-R-P-T-O的表达并未产生任何生长抑制效应。

我们刚刚向您展示了如何鉴定细菌III型效应因子在酵母中表达所引起的生长抑制表型。进行该实验时，重要的是要仔细选择表达载体以及菌株，因为这两者都会显著影响实验结果。此外，请记住在实验的所有步骤中均使用 freshly transformed 的菌落。

以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。