Name: 对活细胞成像的SNAP - Tag融合蛋白的荧光标记的COS - 7 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学习使用SNAP-Tag技术在COS-7活细胞中对融合蛋白进行荧光标记的方法。该技术可实现蛋白质的实时成像与定位研究，为细胞生物学和神经科学研究提供高效的蛋白标记工具。

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Kai Johnsson 
Ivan Correa 
Andreas Brecht 
Katrin Müentener 
Chris Noren 
Luo Sun 
Ming Xu 
Theodore Davis 
Salvatore Russello 
Aihua Zhang 
Inca Ghosh 
Elissa Maunus 
Nicholas Labarthe 
James MacFarland 
John Buswell 
Brenda Desmond 
James Ellard 
Don Comb

接种CHO-K1细胞：
<ol>
 <li>根据标准操作规程，将经胰蛋白酶消化的CHO-K1细胞50-100μl加入6ml完全F-12K培养基中。</li>
 <li>用移液器反复吹打数次以混匀细胞悬液，然后将300 μl消化后的细胞悬液分装至无菌8孔Lab-Tek II培养腔载玻片（#1.5硼硅酸盐玻璃腔室，Nalgene Nunc Int.；产品编号#155409；批号：100808-8-0）的每一孔中。</li>
 <li>将样品于37°C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
</ol>
使用 pSNAP-ADRB2 和 pSNAP-H2B 对 CHO-K1 细胞进行瞬时转染：
<ol>
	<li>检查前一天接种的细胞培养室，观察细胞密度和生长状态。</li>
	<li>标记相应数量的微量离心管。</li>
	<li>在超净台内，根据下表所示示例配制转染复合物混合液，每反应使用 0.3 μg pSNAP-ADBR2 对照质粒 DNA 或 0.3 μg pSNAP-H2B 对照质粒 DNA、1 μl TransPass D2 和 1 μl TransPass V。
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
	<tbody>
		<tr>
		 <td>质粒</td>
		 <td>反应数</td>
		 <td>μl 无血清培养基</td>
		 <td>μl TransPass D2</td>
		 <td>μl TransPass V</td>
		 <td>μl 质粒 DNA</td>
 		 <td>μl TransPass D2/反应</td>
 	 	 <td>μl TransPass V/反应</td>
		 <td>ng DNA/反应</td>
		 <td>DNA 浓度 (ng/μl)</td>
		 <td>μl 质粒 DNA/反应</td>
 		 </tr>
 		 <tr>
		 <td>SNAP-ADRb2</td>
		 <td>5</td>
		 <td>236.5</td>
		 <td>5</td>
		 <td>5</td>
		 <td>3.5</td>
		 <td>1</td>
		 <td>1</td>
		 <td>300</td>
		 <td>472.34</td>
		 <td>0.7</td>
	 </tr>
 	 <tr>
		 <td>H2B-SNAP</td>
		 <td>5</td>
 		 <td>237</td>
 		 <td>5</td>
 		 <td>5</td>
 		 <td>3</td>
 		 <td>1</td>
		 <td>1</td>
		 <td>300</td>
		 <td>515.89</td>
		 <td>0.6</td>
	 </tr>
	 <tr>
		 <td>Mock</td>
		 <td>5</td>
		 <td>240</td>
		 <td>5</td>
		 <td>5</td>
		 <td>0</td>
		 <td>1</td>
		 <td>1</td>
		 <td>0</td>
		 <td>0</td>
		 <td>0</td>
 	 </tr>
 	 <tr>
 		 <td>未转染</td>
 		 <td>5</td>
 		 <td>250</td>
 		 <td>0</td>
 		 <td>0</td>
 		 <td>0</td>
 		 <td>0</td>
 		 <td>0</td>
 		 <td>0</td>
 		 <td>0</td>
		 <td>0</td>
	 </tr>
	</tbody>
</table>
</li>
	<li>首先将无血清 F-12K 培养基与适量质粒 DNA 混合，然后加入 TransPass D2 转染试剂，再加入 TransPass V 转染试剂。每次加入试剂后，轻轻吹打数次以充分混匀各组分。</li>
	<li>将反应液在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>孵育期间，用 600 μl 完全 DMEM 培养基洗涤细胞一次，并向每个样品中加入 450 μl 完全 DMEM 培养基。</li>
	<li>将 50 μl 转染复合物混合液缓慢逐滴加入每个样品中。</li>
	<li>将样品在 37°C、5% CO2 条件下孵育过夜。</li>
</ol>
使用 pSNAP-ADRB2 和 pSNAP-H2B 瞬时转染的 CHO-K1 细胞的 SNAP-Cell TMR Star 标记：
<ol>
	<li>用真空抽吸小心移除各样品中的转染复合物培养基。用 600 μl 完全 F-12K 培养基洗涤细胞两次，并向每孔中更换 600 μl 完全 F-12K 培养基。</li>
	<li>通过加入 995 μl 完全 F-12K 培养基和 51 μl 0.6 mM SNAP-Cell TMR-Star 底物来配制染料标记培养基。SNAP-Cell TMR-Star 的终浓度应为 3 mM。加入底物后，反复吹打混匀数次。</li>
	<li>小心移除样品中的生长培养基，并向每孔中加入 200 μl 染料标记培养基。将样品在 37°C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟。</li>
	<li>在样品孵育期间，通过将 1 μl Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物（10 mg/ml 水溶液，16.2 mM 溶液；Invitrogen Molecular Probes）加入 10 ml 完全 F-12K 培养基中，配制用于样品核染色的 Hoechst 33342 溶液。</li>
	<li>移除所有样品中的培养基，并向每个样品中加入 600 μl 稀释的 Hoechst 溶液。将样品在 37°C、5% CO2 条件下孵育 5 分钟。</li>
	<li>用 600 μl 完全 F-12K 培养基洗涤样品三次。</li>
	<li>将样品在 37°C、5% CO2 条件下继续孵育额外 30 分钟，以使未结合的荧光染料从细胞中扩散出去。</li>
	<li>30 分钟后，最后一次更换 SNAP-Cell 样品的培养基，然后进行成像。</li>
	<li>使用 Zeiss Apotome Axiovert 200M 荧光显微镜对细胞进行成像。</li>
</ol>
代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="细胞荧光显微镜图像，蓝色为细胞核，红色为细胞质，用于细胞生物学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 本图展示了使用标准荧光显微镜对活体COS-7细胞进行荧光成像的一些代表性结果，这些细胞表达SNAP-tag融合蛋白。第一张图像显示的是表达pSNAP-H2B（核组蛋白）的活体COS-7细胞，用SNAP-Cell TMR-Star标记。pSNAP-H2B构建体是使用pSNAP-tag(m)载体构建的。细胞用SNAP-Cell TMR-Star标记30分钟，并用Hoechst 33342（蓝色）对细胞核进行复染。粉红色荧光显示了组蛋白蛋白所在区域的红色荧光与指示细胞核的蓝色荧光的叠加信号。H2B蛋白的表达清晰且易于识别。
<img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="细胞核荧光显微图像，DNA 染色为蓝色，蛋白质染色为红色，用于分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="染色细胞的荧光显微图像，显示细胞核和细胞质，用于细胞分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 图 2 和图 3。 接下来的这两幅图像显示了瞬时转染 pSNAP-ADRβ2 的活体 COS-7 细胞。 细胞用 SNAP-Cell TMR-Star（红色）标记，并用 Hoechst 33342（蓝色）复染。pSNAP-ADRβ2 质粒构建体是使用 pSNAP-tag(m) 载体构建的。细胞用 SNAP-Cell TMR-Star 标记 30 分钟，并用 Hoechst 33342（蓝色）复染以标记细胞核。红色荧光表示细胞表面受体蛋白 ADRB2 的存在，蓝色荧光标识细胞核。

<ol><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li>
<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP-tag+Technologies%3A+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function%5BTitle%5D)+AND+%22NEB+Expressions%22%5BJournal%5D)">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li>
</ol>

作者受雇于生产本文所用试剂和仪器的新英格兰生物实验室公司。

影响观察结果的变量有多种，例如聚焦、激光强度、设备性能、所用镜头等。荧光染料的光稳定性决定了在荧光衰减之前必须以多快速度完成采集。
该蛋白质标记方法具有广泛的适用性，可用于多种应用场景。SNAP-tag和CLIP-tag技术可实现融合蛋白与合成探针的特异性标记，从而研究蛋白质功能的多个方面，包括活细胞及细胞裂解液中的多种动态过程。SNAP-、CLIP-、MCP-和ACP-tag技术为活细胞和固定细胞中蛋白质的成像以及蛋白质功能的研究提供了简便性和极高的灵活性。 在 体外单个基因构建体的创建可产生一种带标签的融合蛋白，该蛋白能够与多种功能基团（包括荧光染料、生物素或微珠）形成共价连接。目的蛋白只需克隆并表达一次，其融合产物即可与多种荧光底物联用，适用于多种下游应用，例如活细胞内同时标记蛋白、蛋白定位与转位、脉冲-追踪实验、受体内部化研究、细胞表面选择性标记、蛋白下拉实验、SDS-PAGE中的蛋白检测、流式细胞术、微孔板中的高通量结合实验、生物传感器相互作用实验以及基于FRET的结合实验。

<table><tbody><tr><td>CHO-K1 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>无血清 F-12K 培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带 #1.5 硼硅酸盐盖玻片腔室的 Lab-Tek II 腔室载玻片</td><td>Nalge Nunc International</td><td>155409</td><td>批号: 100808-8-0</td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342，三盐酸盐三水合物（水中 10 mg/ml 溶液，16.2 mM 溶液）</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>470519</td></tr><tr><td>Zeiss Apotome Axiovert 200M 荧光显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transpass V</td><td>新英格兰生物实验室（New England Biolabs）</td><td>M2561S</td><td>0030709</td></tr><tr><td>Transpass D2</td><td>新英格兰生物实验室（New England Biolabs）</td><td>M2554S</td><td>0060802</td></tr><tr><td>SNAP-Cell TMR Star</td><td>新英格兰生物实验室（New England Biolabs）</td><td>S9105S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>pSNAP-ADBR2 对照质粒</td><td>新英格兰生物实验室（New England Biolabs）</td><td>N9178S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>pSNAP-H2B 对照质粒</td><td>新英格兰生物实验室（New England Biolabs）</td><td>N9179S</td><td>0010811</td></tr></tbody></table>

对表达 snap-tag 融合蛋白的 cos-7 活细胞进行荧光标记以用于活细胞成像

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag 和 CLIP-tag 蛋白标记系统可实现包括荧光染料在内的分子与活细胞中目标蛋白的特异性共价结合。这些系统提供了多种经过优化的荧光底物，适用于各类成像仪器。一旦完成克隆并表达，标记蛋白即可与多种底物联合用于多种下游应用，而无需重复克隆。该系统的使用包括两个步骤：将目标蛋白克隆并表达为 SNAP-tag 融合蛋白，以及使用所选的 SNAP-tag 底物对融合蛋白进行标记。SNAP-tag 是一种基于人源 O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶（hAGT），一种DNA修复蛋白。SNAP-tag标记物是通过苄基连接子与鸟嘌呤或氯嘧啶离去基团偶联的染料。在标记反应中，底物的取代苄基基团共价连接至SNAP-tag。CLIP-tag是SNAP-tag的改良版本，经改造后可与苄基胞嘧啶而非苄基鸟嘌呤衍生物发生反应。当与SNAP-tag联合使用时，CLIP-tag能够在同一细胞内实现两种蛋白质的正交且互补的标记。

SNAP-tag 和 CLIP-tag 蛋白质标记系统可实现包括荧光染料在内的多种分子与活细胞中目标蛋白的特异性共价结合。一旦完成克隆并表达，该标记蛋白即可与多种底物联合使用，适用于多种后续应用，而无需再次进行克隆。

对表达 SNAP-tag 融合蛋白的 COS-7 活细胞进行荧光标记以用于活细胞成像

SNAP-tag 和 CLIP-tag 蛋白标记系统可实现包括荧光染料在内的分子与目标蛋白的特异性共价结合。

SNAP 和 clip 标签。蛋白质标记系统能够实现几乎任何分子与目标蛋白质的特异性共价结合。可将目的基因克隆至载体中标签的任意一侧，目的基因的表达将产生 SNAP 标签融合蛋白。SNAP标签底物由两部分组成：一是被SNAP标签识别的苯并喹啉（benzo guin），二是功能基团。该功能基团可以是生物素、微珠或荧光基团，其中荧光基团具有多种颜色可供选择。在标记反应过程中，取代的苯并基团共价连接至SNAP标签，并释放鸟嘌呤。若将Fluora four与目标蛋白偶联，则标记物可产生荧光，从而实现对活细胞或固定细胞中蛋白的可视化观察。您好，我是来自新英格兰胆汁实验室的 Chris Provost。今天我们将向您展示一种对表达 SNAP 标签融合蛋白的活体 COS 七细胞进行荧光成像的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究蛋白质在细胞内的定位情况。接下来开始操作：按照标准操作规程，用胰蛋白酶处理cos七细胞并置于冰上，取50至100微升细胞加入到6毫升完全DMEM培养基中。通过反复吹打数次混匀细胞悬液。然后将300微升胰蛋白酶消化后的细胞悬液分装至无菌八孔Lab-Tek II腔室载玻片的每个孔中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜，次日进行后续实验。在超净工作台中，检查细胞培养室中的细胞密度和细胞状态。根据转染复合物混合液的数量，标记相应数量的微量离心管。为每个反应配制转染复合物混合液。每份使用0.3微克snap融合质粒DNA，溶于无血清培养基中，并加入1微升。TPA D2和TPA v转染试剂以及对照质粒均可用于检测转染试剂的转染效率。我们还建议为每种复杂混合物设置模拟转染样本和/或未切除样本作为阴性对照。首先，将无血清 DMEM 与相应的血浆 DNA 混合。然后依次加入 TPAs D 两种转染试剂和 TPAs v 转染试剂。每加入一种试剂后，轻轻吹打数次以充分混匀各组分，并在室温下孵育30分钟。孵育期间，用600微升完全DMEM洗涤细胞一次，并向每个样品中加入450微升完全DMEM。孵育结束后，将50微升转染复合物混合液缓慢逐滴加入各样品中。将样品在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。第二天。将转染后的共七种细胞用 SNAP 细胞 TMR 星型底物标记，以开始本实验步骤：向 SNAP 细胞 TMR 星型底物中加入 50 µL DMSO，用移液器上下吹打，并涡旋混匀 1 分钟。接着，用真空抽吸小心地从每个样品中移除转染复合物培养基，再用 600 µL 完全 DMEM 洗涤细胞两次。然后将每孔中的培养基更换为 600 微升完全 DMEM 培养基，将样品放回培养箱中。通过加入 995 微升完全 DMEM 培养基和 5 微升 0.6 毫摩尔的 D 标记培养基，混匀。加入底物后，将 SNAP cell TMR star 底物上下吹打数次以混匀。SNAP cell TMR STAR 的终浓度应为 3 µM。小心移除样品中的培养基，并向每孔加入 200 µL DIA 标记培养基，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。在此孵育步骤中，TMR 底物上的苄基基团将共价连接至 SNAP 标签并释放荧光淬灭基团。制备用于样本细胞核染色的 HX 溶液。将 1 微升 HSED 3 33 42 三盐酸盐 TRI 加入 10 毫升完全 DMEM 培养基中混合。当孵育完成后，从所有样本中移除 d 标记培养基，并向每个样本加入 600 微升稀释的 HX 溶液。将样品在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育5分钟。5分钟后，从每个样品中移除稀释的钩溶液，并用600微升完全DMEM洗涤样品3次。最后一次洗涤后，向每个样品中加入600微升完全DMEM。将样品在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育30分钟，以使未掺入的荧光染料从细胞中扩散出去，这是实现细胞内标记所必需的步骤。30分钟后，最后一次更换快拆细胞样品的培养基，加入600 µL完全DMEM培养基。此时细胞已准备好，可使用Zeiss AOME Vert 200 M荧光显微镜进行成像。以下是利用标准荧光显微镜对表达标签融合蛋白的活体COS七细胞进行荧光成像的一些代表性结果。第一幅图像显示了表达PNAP H2B并用Snap-Cell TMR Star标记的活体COS七细胞。PNAP H2B构建体是使用PNAP TAG M载体构建的。细胞用 Snap Cell TMR Star 标记 30 分钟，并用 Hoechst 33342 对细胞核进行复染。粉红色荧光显示了组蛋白蛋白存在区域的红色荧光叠加信号。除了指示细胞核的蓝色荧光外，H2B 蛋白的表达也能够被清晰且容易地识别。接下来的两张图像显示了瞬时转染了pnap的活体cost seven细胞。ADR beta two细胞用snap cell、tmr、star标记，并用HUX 3 33 42进行复染。pnap ADR beta two载体是使用PNAP TAG M载体构建的。细胞用 Snap Cell TMR Star 标记 30 分钟，并用 Hoechst 33342 对细胞核进行复染。红色荧光表明细胞表面受体蛋白 A DR beta two 的存在，而蓝色荧光标示细胞核。我们刚刚向您展示了如何对表达 Snap-tag 融合蛋白的活体 Cough Seven 细胞进行荧光成像。进行此操作时，需注意应缓慢地逐滴加入转染复合物，并在不使用时将snap标签底物于避光条件下保存在-20摄氏度环境中。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

fluorescent-labeling-cos-7-expressing-snap-tag-fusion-proteins-for

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对活细胞成像的SNAP - Tag融合蛋白的荧光标记的COS - 7

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