有丝分裂的siRNA转染后的时间推移成像
June 6th, 2010
在这里，我们描述了一个基本的协议，以图像和量化现场后，转染哺乳动物组织培养细胞的有丝分裂的时机。
有丝分裂期间发生的细胞组织和染色体动力学的变化紧密协调，以确保基因组和细胞内容的准确遗传。在本视频文章中，展示了一种追踪有丝分裂标志性事件的方法。使用表达荧光标记蛋白的细胞系在单个细胞基础上监测染色体运动。
irna 转染针对有丝分裂蛋白，导致细胞周期变化，这些变化可以通过延时成像可视化，并通过图像分析进行量化。大家好，我是来自犹他大学亨斯迈癌症研究所 Katie Oman 实验室的 Douglas Mackey。今天，我们将向您展示一种在 SIA 转染后活细胞进行有丝分裂过程的成像程序。
我们在实验室中使用该程序来研究目标蛋白质的破坏可能对有丝分裂进程的时间产生的任何影响。那么让我们开始吧。通过向每个玻璃中加入 0.5 毫升纤连蛋白，准备一个四壁 Lab Tech 两腔盖玻片。
在室温下孵育 10 至 15 分钟。同时，制备用于反向转染的 irna 和 lip RNAI max 复合物。根据制造商对每个腔室的说明，使用推荐量用于 24 孔培养皿中的一孔。
15 分钟后，从腔室盖玻片的孔中取出纤连蛋白。然后向每个孔中加入 100 微升 irna 复合物，每个孔中分装 20， 000 个细胞，分装 500 微升。将细胞放入培养箱中 24 小时。
第二天，用 1 mL 常规细胞培养基替换转染混合物，然后在图像采集前再孵育细胞 24 小时。图像采集设置包括一个定制的细胞培养箱，该培养箱安装在倒置显微镜的载物台上，由图像采集软件控制。要准备图像采集，请确保培养箱已预先警告并达到平衡。
接下来，打开培养箱的盖子，将盖上腔室盖的细胞放入适配器中。使用少量造型粘土将其固定到位。合上盖子，将整个培养箱放在显微镜载物台上，确保培养箱牢固就位。
接下来，使用 metamorph，通过在软件的菜单栏中选择 apps 多维采集来设置实验。这将打开一个窗口，可在其中选择成像参数。指定保存数据文件的位置。
然后使用四个 TX 干相差物镜选择明场和 m 樱桃波长，使用软件聚焦在细胞区域上，仅调整明场通道的自动对焦功能。这将允许软件在每次采集之前在每个阶段位置自动对焦。对于第一个波长，捕获图像使用 50 毫秒的曝光，将曝光时间调整到查看良好图像所需的最短时间。
必须限制光照量以确保持续的细胞活力。作为一般规则，最好通过使用中性密度滤镜和更长的摄像机曝光时间来实现这一点。而不是通过增加照明强度。
对任何其他波长重复此过程。然后设置每个通道的曝光时间。接下来，在 15 个阶段位置指定 15 分钟的延时间隔，持续 8 小时。
如果需要更好的时间分辨率，请缩短采集之间的时间间隔。请记住，使用的舞台位置越多，获取所需的时间就越长。在每个时间间隔，选择并标记适当数量的阶段位置，以对细胞群进行充分采样。
Metamor 将记录位置并返回每次采集的指定位置。在延时波长曝光后，已指定时间和载物台位置信息。选择屏幕上的预览按钮，确认软件正在适当地控制设备。
确保系统正常运行后，选择屏幕上的 acquire 按钮开始采集。通过至少一轮完整的采集来观察自动化，以确保一切正常。然后坐下来，让计算机和显微镜完成工作。
要查看数据，请选择应用程序，在菜单栏中查看多维数据，选择文件位置视图，然后选择舞台位置。单击 load images （加载图像） 以查看该位置的图像堆栈。加载图像后，使用鼠标逐帧浏览数据。
这里使用生成有丝分裂细胞的电影。要在 Metamorph 中制作影片，请选择 stack make movie （堆栈制作影片）。在菜单栏中，选择要使用影片的速度和文件类型的帧。
然后选择 Save 进行蒙太奇。首先，将数据保存为 metamorph 中的 dot STK 文件。然后打开图像 J 打开图像 J 中的点 s stk 文件，并通过标记区域并在菜单栏中选择图像裁剪来裁剪感兴趣的区域。
然后选择 image stacks。使蒙太奇指定要包含蒙太奇的大小和形状的帧。以及是否需要框架边框之间。
然后点击 OK。将蒙太奇另存为点 tiff 文件。最后，计算有丝分裂每个阶段的时间，指定 DNA 浓缩或细胞变圆的第一个迹象明显的框架，因为 T 等于零前期。
当染色体在赤道对齐时，前中期结束，中期将继续进行，直到 DNA 开始分离后期末期。最后，胞质分裂随之而来，细胞开始变平。表达 His 结石的肺门细胞的延时成像。
H 两个 BCFP。这些细胞用对照 irna 转染，并在整个细胞周期中正常进行。相比之下，转染针对核孔 NUP 1 53 的 siRNA 的细胞取代了 MIT 进展的严重改变。
我们刚刚向您展示了如何设置、运行和分析延时成像实验，以确定转染后细胞有丝分裂进展的时间。进行此程序时，重要的是要通过保持适当的温度和 CO2 浓度以及限制细胞暴露的光量来尽可能温和地对待细胞。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本文介绍了一种在siRNA转染后对活体哺乳动物组织培养细胞的有丝分裂时间进行成像和量化的协议。该方法允许观察有丝分裂期间的染色体动态和细胞组织。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 活细胞成像
- 有丝分裂动态
背景
- 有丝分裂是精确细胞分裂和基因组遗传的关键过程。
- 有丝分裂蛋白的破坏可能导致细胞周期异常。
- 荧光标记允许实时观察有丝分裂事件。
- siRNA转染是研究蛋白质功能的常用方法。
研究目的
- 开发一个可靠的活细胞分析成像协议，用于在有丝分裂期间进行分析。
- 量化特定siRNA对有丝分裂时间的影响。
- 增强对有丝分裂进程及其调控的理解。
使用的方法
- 带纤连蛋白的室式盖玻片的制备。
- 用针对有丝分裂蛋白的siRNA转染细胞。
- 使用定制的细胞培养箱和倒置显微镜进行时间跃迁成像。
- 图像分析以量化有丝分裂阶段和时间。
主要结果
- 成功对活细胞在有丝分裂期间进行成像。
- 量化对照组和siRNA处理组细胞之间的有丝分裂时间差异。
- 识别蛋白质破坏导致的有丝分裂进程的显著改变。
- 展示该协议在研究细胞周期动态方面的有效性。
结论
- 该协议为研究有丝分裂的研究人员提供了一个宝贵的工具。
- 时间跃迁成像可以揭示细胞周期调控的关键见解。
- 进一步的应用可能包括研究各种有丝分裂蛋白及其作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Time-lapse imaging of mitosis following siRNA transfection enables direct visualization and quantification of mitotic progression at the single-cell level, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides predictive confidence for target validation by revealing the precise stages where protein depletion disrupts cell division. The method enhances portfolio decision-making by enabling functional assessment of candidate mitotic regulators in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of candidate mitotic regulators via siRNA-mediated depletion.
- Supports mechanistic de-risking by pinpointing mitotic stages affected by target knockdown.
- Provides single-cell resolution for detecting subtle phenotypic changes not observable in bulk assays.
- Facilitates predictive confidence in target selection and triage for further development.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live-cell imaging assays for quantifying mitotic timing and defects.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for downstream screening of modulators affecting mitosis.
- Enables assay standardization and scalability for high-content imaging platforms.
- Supports reliable evaluation of compound or genetic perturbation effects on cell division.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitotic phenotypes with disease-relevant cellular models expressing tagged histone proteins.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of mitotic targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative phenotypic outputs.
- Supports translational biomarker development by linking imaging readouts to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging and analysis workflow bridges early discovery, target validation, and preclinical research by enabling direct measurement of mitotic progression after genetic perturbation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing mitotic defects after siRNA knockdown.
- Screening: Provides quantitative, reproducible imaging outputs suitable for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers time-resolved measurements of mitotic stages, enabling statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease-relevant cellular models for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis platform adaptable to diverse targets and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of mitotic regulators in the discovery pipeline.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, siRNA transfection, and quantitative image analysis.
- Needs access to automated fluorescence microscopes and compatible incubation systems.
- Demands cross-team standardization of imaging parameters and analysis protocols.
- Adaptable to various mammalian cell lines expressing fluorescently tagged proteins.
- Light exposure and environmental control are critical for maintaining cell viability and data quality.
