Name: 塑料嵌入和非洲爪蟾胚胎切片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: 学习非洲爪蟾胚胎塑料包埋切片技术，用于发育生物学与神经科学研究。该方法可制备五微米超薄切片，保留真实组织形态，实现高分辨率免疫荧光成像。

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固定
<ol>
<li>将完整胚胎或解剖得到的外植体转移至MEMFA或3.7% FA+PBS中，置于小玻璃闪烁瓶（Fisher货号 03-339-25B）内。在室温下将瓶置于旋转摇床中孵育，仅孵育2小时，不可超过此时间。胚胎在甲醛（FA）中停留不得超过2小时。甲醛孵育时间过长会导致胚胎组织变硬，从而影响后续检测过程中抗体的渗透效果。 </li>
<li>吸除大部分甲醛溶液，加入Dent's固定液至瓶口（约4.5 ml）。轻轻倒置瓶体数次，使胚胎在Dent's固定液中充分洗涤；随后更换为另4.5 ml新鲜Dent's固定液，并于-20ºC条件下孵育至少48小时。过夜孵育不足以完成此步骤。该步骤可提高胚胎对抗体的通透性。胚胎可在该条件下保存数周。</li>
</ol>
免疫荧光
<ol>
<li>复水样本。将样本置于梯度甲醇溶液中孵育，步骤如下： 
<table style="width: 171px; height: 119px;" border="0" cellpadding="3">
<tbody>
<tr>
<td>75% MeOH/H2O</td>
<td>10min</td>
</tr>
<tr>
<td>50% MeOH/PBS</td>
<td>10min</td>
</tr>
<tr>
<td>25% MeOH/PBS</td>
<td>10min</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>10min</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>10min</td>
</tr>
</tbody>
</table>
 </li>
<li>使用60 mm塑料培养皿制备1.5%琼脂糖/PBS平板。琼脂糖凝固后，在其表面加入PBS。 </li>
<li>胚胎半切操作：将胚胎置于1.5%琼脂糖/PBS平板中。用镊子夹住一个胚胎，使用薄剃刀从胚胎中心纵向切为两半。选择切面平整且成功沿中线切开的样本。 <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_3/188_figure-01.jpg" alt="显示胚轴背唇位置的示意图；理想切面与不良切面对比。" width="591" height="193" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> </li>
<li>将半切后的胚胎转移至含PBT的玻璃闪烁瓶中。更换为4.5 ml含20%山羊血清的PBT溶液。在摇床上室温孵育2小时（封闭步骤）。 </li>
<li>在PBT中配制适当稀释倍数的一抗溶液，每份样本需0.5 ml。例如，为研究C-cadherin在5 mm塑料切片中的亚细胞定位，我使用了1/200稀释倍数的兔抗C-cadherin多克隆抗体。 </li>
<li>吸除封闭液，加入0.5 ml稀释后的一抗溶液。将闪烁瓶直立放置于泡沫塑料管架上，在摇床上4ºC孵育过夜。 </li>
<li>移除稀释后的一抗（该溶液可在接下来的1–2周内保存并重复使用）。在室温下用4.5 ml PBT洗涤4次，每次40–60分钟。 </li>
<li>更换为0.5 ml PBT中1/100稀释的生物素标记二抗溶液。在摇床上4ºC孵育过夜。用铝箔包裹闪烁瓶以避免生物素暴露于光照。 </li>
<li>自此步骤起，需注意避免样本暴露于光线下，即将闪烁瓶置于遮光容器或铝箔中。 </li>
<li>移除生物素标记的二抗（该溶液亦可保存并在接下来的1–2周内重复使用）。在室温下用4.5 ml PBT洗涤4次，每次40–60分钟。 </li>
<li>更换为0.5 ml PBT中1/200稀释的荧光标记链霉亲和素（如FITC、Texas-red等）溶液。在摇床上4ºC孵育过夜。 </li>
<li>移除链霉亲和素溶液（也可重复使用）。在室温下用4.5 ml PBT洗涤3次，每次15–30分钟。 </li>
<li>在4.5 ml含3.7%甲醛的PBS溶液中室温固定胚胎30分钟。 </li>
<li>用4.5 ml PBS洗涤两次。 </li>
<li>脱水样本。将样本置于梯度乙醇溶液中孵育，步骤如下： 
<table style="width: 172px; height: 80px;" border="0">
<tbody>
<tr>
<td>30% EtOH/H2O </td>
<td>10 min</td>
</tr>
<tr>
<td>50% EtOH/H2O</td>
<td>10 min</td>
</tr>
<tr>
<td>75% EtOH/H2O</td>
<td>10 min</td>
</tr>
<tr>
<td>100% EtOH</td>
<td>10 min</td>
</tr>
</tbody>
</table>
 </li>
<li>样本可在4ºC避光条件下保存于100%乙醇中。</li>
</ol>
浸润
<ol>
<li>配制Technovit 7100渗透混合液。通常取15 ml基础液于50 ml锥形管中，加入150 mg硬化剂I，置于摇床上以摇动方式混合15分钟。该渗透混合液可在4°C保存最多一个月。 </li>
<li>使用渗透混合液对样本进行渗透处理，采用梯度系列的Technovit渗透混合液与乙醇（EtOH）组合进行置换，步骤如下： <ol>
<li>50% Technovit/EtOH — 1小时 </li>
<li>100% Technovit — 1小时 </li>
<li>100% Technovit — 过夜 </li>
</ol></li>
<li>样本可在100%渗透混合液中于4°C保存最多一个月。需对样本加盖，避免光照。</li>
</ol>
包埋
<ol>
<li>配制Technovit 7100包埋混合液：取0.75 ml浸润混合液至1.5 ml离心管中，加入50 µl硬化剂II。通过反复倒置离心管数次进行混匀。 </li>
<li>使用塑料移液管，将经 overnight 浸润处理的一个样本转移至0.5 ml薄壁PCR管中，吸除大部分上清液。 </li>
<li>向样本中加入0.25 ml本节第1步“包埋”中配制的包埋混合液。用钝头解剖针（木柄解剖针）轻轻推动，使剖开的胚胎切面朝向PCR管底部，以正确调整胚胎方位。 </li>
<li>盖紧管盖，将PCR管置于避光处孵育约4小时，使塑料充分聚合固化。 </li>
<li>配制Technovit 3040混合液：取1克粉末置于称量皿中，加入0.5 ml液体，立即使用蓝色枪头混匀。将混合液小心加至已固化的样本上方。此黄色的Technovit 3040可防止整个塑料块从PCR管中脱出。</li>
</ol>
切片
<ol>
<li>用二甲苯擦拭Histoknife H（乙醇通常效果不够好），然后将其安装到切片机上。将刀片角度调整至约 45°用二甲苯擦拭刀片前方的载物台区域，该区域的清洁度对切片质量至关重要。 </li>
<li>用美工刀切开管子的侧面，然后剥下管尖。 <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_5/188_figure-02.jpg" alt="Embryo sectioning process, Technovit embedding, diagram illustrating cut steps and materials." width="818" height="243" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> </li>
<li>将样本放入切片机的卡盘中。 </li>
<li>在载玻片上贴附一个“按压密封”硅胶绝缘垫，以创建用于组织切片的封片腔室。在洁净台面上将绝缘垫牢固地按压到载玻片上，并从另一侧观察，确保绝缘垫完全贴合，无任何气泡。倒入洁净且预热的去离子水（dH₂O）。2O (~ 40°C用巴斯德移液管将液体滴加到载玻片的液滴中，直至液面达到可见其表面变平、不再呈凹面或凸面的水平。 </li>
<li>开始制作切片。进行免疫荧光研究时，我制作5 mm的切片。 原位 杂交样品的切片厚度可根据实验目的和信号强度在约 3 - 8 mm 范围内调整。 </li>
<li>用小号画笔将切片从刀片前方的载物台转移至盛有水的贴片室。将带有切片的画笔置于水面上方，用钝头解剖针轻敲使切片落入水中。切片一接触水面便会迅速展开成圆形。 </li>
<li>当封片腔的大部分水面被切片占据时，使用巴斯德移液管吸走约一半的水分。将载玻片置于载玻片加热板上过夜孵育，使样本完全干燥。 </li>
<li>用1 ml DAPI（0.1 mg/ml，溶于TE缓冲液）复染5分钟。吸除DAPI溶液，干燥样品。 </li>
<li>从载玻片上移除硅橡胶绝缘层。现在可以对样品进行拍照。将样品保存于 4°C，避光保存。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>1 L 配方：8.0 g NaCl，0.2 g KCl，2.68 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 0.2 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;pH 应为 7.4。定容至 1 L。高压灭菌。</td></tr><tr><td>PBT</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>加入 0.5 mL Triton X-100 和 1.0 g BSA（分子生物学级，V 组分即可）[&amp;gt;99%]，但不要&amp;rsquo;t 使用粗制97%白蛋白）加入500 ml经高压灭菌的PBS中。用0.2 mm滤杯过滤。4℃保存&amp;#186;C.</td></tr><tr><td>&amp;#183;凹痕&amp;rsquo;固定剂</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td>将40 mL甲醇与10 mL DMSO混合。保存于 &amp;#8211;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>3.7% FA+PBS</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td>将37%甲醛与PBS按1:9比例混合。每次使用前新鲜配制，剩余溶液丢弃。</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）</td><td>Ab</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的兔IgG（H+L）二抗（山羊制备）</td><td>Ab</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>免疫球蛋白&amp;rsquo;S HUADS 生物素 GTXRBT</td><td>Ab</td><td>Invitrogen</td><td>ALI3409</td><td>生物来源&amp;#8482;</td></tr><tr><td>IgG (g)，山羊抗小鼠</td><td>Ab</td><td>Invitrogen</td><td>M30115</td><td>CALTAG&amp;#8482;</td></tr><tr><td>荧光链霉亲和素试剂盒</td><td>试剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>SA-1200</td><td>含有三种不同荧光染料标记的链霉亲和素（FITC、Texas Red 和 AMCA），适用于本实验步骤。</td></tr><tr><td>20% 山羊血清/PBT</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>这将用作封闭液。</td></tr><tr><td>小号画笔</td><td>工具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>钝头解剖针</td><td>工具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kulzer Technovit 7100 GMA，3040</td><td>试剂</td><td></td><td>7100 GMA，3040</td><td>甲基丙烯酸乙二醇酯</td></tr><tr><td>库尔策钨合金组织切片刀</td><td>工具</td><td>能量束科学</td><td>H1310</td><td></td></tr><tr><td>75% MeOH/H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% 甲醇/PBS</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25% 甲醇/PBS</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% EtOH/H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;2O</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% EtOH/H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% EtOH/H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型玻璃闪烁瓶</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-25B</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 薄壁 PCR 管</td><td>工具</td><td>分子生物产品</td><td>3430</td><td></td></tr><tr><td>按压密封硅橡胶绝缘子</td><td>工具</td><td>Grace Bio-Lab 公司</td><td>JTR1L-2.5</td><td>32 mm 长 × 19 mm 宽，2.5 mm 厚</td></tr><tr><td>薄刃剃刀</td><td>工具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 中的 1.5% 琼脂糖</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5">针对抗原或表位标签的一抗：用PBT配制适当稀释度。 
生物素偶联的二抗：多家供应商提供生物素偶联抗体。</td></tr></tbody></table>

非洲爪蟾胚胎的塑料包埋与切片

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

塑料切片可在组织的薄切片中保持真实的组织形态，并可用荧光二抗进行免疫染色，因此该方法在多种组织类型中比石蜡包埋或冷冻切片更为实用。本视频展示了染色、塑料包埋及切片的方法。

大家好，我叫Sochi ota。我是加州大学发育与细胞生物学系Ken Cho博士实验室的一名博士后科学家。今天，我将向大家演示如何制备非洲爪蟾胚胎的简化切片。该实验步骤包括对晚期囊胚期蛙胚胎进行切半处理，使用针对目标分子的抗体进行染色，随后将样本浸入塑料包埋剂中，并制作五微米厚的塑料切片。该方法可用于高分辨率的免疫荧光、免疫组织化学或原位杂交成像研究。这些是我用于处理十枚以上胚胎塑料切片的小型实用工具。这是一种带有三角尖头的金属镊子，其作用之一是可以用于在塑料中调整胚胎的方向。作用之二是可与这支画笔配合使用，将胚胎从切片机转移至载片表面。这是一个硅橡胶绝缘垫，我将其放置在载玻片表面，用以形成一个水膜区域，以便固定塑料切片后的胚胎切片。现在我将演示如何对胚胎进行切半处理，适用于原位杂交或免疫荧光检测等实验的固定胚胎。为了将胚胎切成两半，我使用这种非常超薄的细孔滤网，你可以在杂货店购买到。我认为是的，胚胎已在3.7%多聚甲醛中固定过夜。而如何固定取决于实验目的。这种固定方式需要过夜。对于切口杂交而言，可以进行过夜固定；但对于免疫荧光检测（即检测胚胎内部蛋白质）则不建议固定时间过长。我倾向于仅用3.7%甲醛固定液固定两小时，以尽量减少对蛋白质亚细胞定位的影响，同时避免过度固定，从而在检测步骤中有利于抗体的良好渗透。好的，现在我正通过切开囊胚壁的左侧和右侧来解剖这个胚胎。现在我可以看到这是一个11期胚胎，其中成体细胞（PO）从背侧一直延伸到腹侧，但这是个异常的胚胎。让我们来看一下这个右侧的部分。你可以在背侧和腹侧都观察到原肠胚的外凸结构，但背侧更为明显，因为与腹侧相比，此处的内陷已明显达到胚胎内部最深的位置。因此，这是一个很好的切开样本，可用于同时研究背侧和腹侧。在胚胎内部，即这个已解剖的胚胎中，我将采用免疫荧光检测技术来检测胚胎内表达的蛋白质。进行免疫荧光或免疫组织化学检测时，需使用特异性抗体进行检测。但问题是，抗体难以有效穿透到胚胎内部。因此，如果你使用整体胚胎样本，就无法研究目标蛋白在胚胎内部细胞中的表达模式。但通过使用预先切开的胚胎样本，你可以研究胚胎深层细胞中蛋白的表达模式。啊，已染色的胚胎已经用3.7%甲醛固定，并经乙醇脱水，随后浸入一种名为Technovit 7100的塑料介质中。该试剂盒包含三个部分：主要液体成分、称为硬化剂一的粉末，以及称为硬化剂二的液体。首先，我将主体部分与固化剂按100比1的比例混合，得到浸润混合液。这种液体用于浸润胚胎。此时混合物仍为液态，尚未固化。将这些胚胎样本在渗透混合液中过夜孵育，以确保胚胎样本完全被该塑料包埋。现在，我用移液器取出其中一个样本胚胎，并转移至薄壁0.5 mL PCR管中，该管用作包埋模具。然后，从该胚胎中去除多余的液体。现在，这个胚胎已经可以包埋在固化塑料中了。制备固化塑料时，需将渗透液与固化剂按15:1的比例混合。例如，如果取750微升的渗透液加入离心管中，则需要加入50微升的固化剂，以启动塑料的聚合反应。加入后，哎呀，盖上管盖，然后像这样轻轻混匀即可。不应进行涡旋操作，因为氧气是聚合反应的抑制剂。将约250微升该混合液加入胚胎中。此聚合步骤几乎需要四小时，因此完全无需匆忙。首先加入这种聚合塑料后，可轻轻上下抽吸，使胚胎悬浮于塑料中。接着，我使用这种边缘金属镊子轻轻推动胚胎，调整其方向，使胚胎的切面朝向包埋模具的底部。然后盖上盖子，因为氧气会抑制固化反应，室温静置四小时，以完成聚合反应。此后，该样本中已存在一个平视显示器（HUD）的雏形。您需在此样本上涂抹某种胶水，以确保该塑料硬质部分不会从模具中脱落。这是一种用于此目的的胶水，称为 Techno 30 40 的另一种塑料。我正在将这种粉末和液体按2:2:1的比例混合，此处为0.6克该粉末。因此，我将加入300 µL的该液体，然后迅速混合，这种塑料会很快变硬。因此，这一步需要动作稍快一些，然后将混合物倒入已固化的样品中。这已经足够了。盖上盖子。我看起来是这样的。这大约需要 30 到 60 分钟才能变硬。这个已经可以投入使用了。首先，我用美工刀切掉模具的尖端，将这部分尖端从模具上剥离下来。现在这个包埋的胚胎已经暴露出来了。同时，我将这个盖子切掉，因为我不需要它。现在我取这个泰恩罗伊刀片（tain Roy blade），我是说不是针，而是泰恩罗伊刀片，它比用于石蜡切片的常规染色刀片更坚硬。我将此物短暂浸入辛液中以清洁。将其放入刀片架中，并擦去多余的赞恩。有时我也会用赞恩清洁该区域，因为该区域的清洁度至关重要。现在可以进行切片了。在开始切片之前，我先设置好贴片室。这是载玻片。在此之上，我将放入硅橡胶，并用推铲彻底推平，确保不会有任何泄漏。将载玻片置于加热台上，倒入干净的培养用水以形成水池。加入足量的水，直至水面升至与载玻片表面齐平。这一点很重要，因为这种水的表面能够使水的表面张力均匀分布，这对于使切片均匀展开至关重要。现在我开始切片，但在操作之前，我会戴上这个口罩，因为每一片切片都非常轻，极其轻，我呼吸时的气流就可能将切片从载物台上吹走，因此我需要佩戴口罩。现在开始切片。当载物台上积累了一定数量的切片后，用画笔将其轻轻取下，缓慢移动到持刀槽上方，轻敲画笔，使切片在重力作用下落入水中。切片一旦接触水面，便会自然展开，在水面上形成圆形的切片。经过过夜干燥后，光线效果如何？现在看起来是这样和这样。现在样品已准备好与DPI接触，以进行核DNA处理。然后可以在显微镜下进行观察。今天我向大家展示了利用晚期囊胚期青蛙胚胎进行塑料切片制备的方法。该方法对于研究亚细胞结构或蛋白质定位非常有用，而这些研究无法通过石蜡包埋技术实现；此外，该方法通常也适用于原位杂交实验。这种塑料切片还可用于残留杂交反应，该方法获得的图像信号强度远高于石蜡包埋或冰冻切片样本。

plastic-embedding-and-sectioning-of-xenopus-laevis-embryos

Research

科研

JoVE Journal

Biology

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