Name: 低聚β-淀粉样蛋白的制备 1-42和突触可塑性损伤诱导海马脑片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-14T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: 学习制备Aβ 1-42寡聚体的方法，用于研究阿尔茨海默病中突触可塑性损伤机制。该方案采用HFIP和DMSO处理，在海马脑片上评估长时程增强效应，为药物筛选提供可靠的实验模型。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）（NS049442）资助。

重悬β-淀粉样肽
开始之前，请准备好以下物品：
<ul>
	<li>Aβ1-42（冻干粉末）</li>
	<li>1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）</li>
	<li>低吸附聚丙烯微量离心管（1.5 ml）</li>
	<li>带聚四氟乙烯推杆止动装置的气密型汉密尔顿注射器（250 μl）</li>
	<li>二甲基亚砜（DMSO）</li>
</ul>
<ol>
	<li>将冻干的 Aβ1-42 在室温下平衡 30 分钟，以避免打开肽管时产生冷凝水。</li>
	<li>在通风橱内，用冰冻的 HFIP 重新悬浮 Aβ1-42 肽，配制成 1 mM 溶液，并涡旋数秒。</li>
	<li>使用带有聚四氟乙烯（Teflon）塞的玻璃气密型 Hamilton 注射器，迅速将 Aβ1-42/HFIP 溶液均等地分装至三个聚丙烯管中，并密封管子。</li>
	<li>将管子在室温下孵育 2 小时，以促进 Aβ 单体化。随后打开管子，使用真空离心浓缩仪（SpeedVac 离心机，800 g，室温）对 Aβ1-42/HFIP 溶液进行浓缩，直至管底出现透明的肽膜。需仔细监控 SpeedVac 离心机内的温度，避免肽降解（最高不超过 25°C）。</li>
	<li>密封管子，并将分装样品在 -80°C 下保存。Aβ 膜可在 -80°C 下稳定保存 6 个月。</li>
	<li>加入 DMSO 溶解一份肽膜，使 Aβ1-42 浓度达到 5 mM。在水浴中超声处理 10 分钟，以确保完全重新悬浮。</li>
	<li>将该 5 mM Aβ1-42 溶液分装至聚丙烯管中。密封所有管子，并在 -20°C 下保存。分装样品仅可解冻一次。注意避免冰箱内产生水汽冷凝。溶液状态的肽极易降解。</li>
</ol>
寡聚化
开始之前，请准备好以下物品：
<ul>
	<li>Aβ1-42/DMSO (5 mM)</li>
	<li>无菌磷酸盐缓冲液</li>
	<li>低吸附聚丙烯微量离心管（1.5 ml）</li>
	<li>低吸附聚丙烯离心管（50 ml）</li>
</ul>
<ol>
	<li>将获得的5 mM Aβ1-42/DMSO等份样品用无菌磷酸盐缓冲液稀释至100 μl。</li>
	<li>涡旋振荡30秒，然后在4°C孵育12小时。</li>
</ol>
海马脑片处理
在处理海马脑片时，应避免多肽非特异性地黏附于烧杯、灌流管表面以及记录室。建议优先使用低吸附性的聚丙烯管路和容器，避免使用玻璃器皿或普通塑料器皿。灌流液应不含血清或白蛋白。
Aβ灌流
开始之前，请准备好以下物品：
<ul>
	<li>寡聚化 Aβ1-42</li>
	<li>记录缓冲液（单位：mM，含 124 NaCl、4.4 KCl、1 Na2HPO4、25 NaHCO3、2 CaCl2、2 MgCl2 和 10 葡萄糖）</li>
	<li>配备界面式记录室的电生理记录装置</li>
	<li>横切海马脑片在含氧记录缓冲液中孵育，解剖后至少孵育 90 分钟（温度 = 29°C；持续灌流速度 = 2 ml/分钟）</li>
</ul>
<ol>
	<li>实验前立即在聚丙烯管中用预先充氧的记录缓冲液将寡聚化的 Aβ1-42 分装样品稀释至适当的工作浓度（200 nM 或更高）。</li>
	<li>在诱导突触可塑性之前，将 Aβ1-42 溶液灌流至脑片持续 20 分钟。</li>
</ol>
诱导可塑性及随访
<ol>
	<li>通常，突触可塑性最常用的模型是长时程增强（LTP）。可通过海马中特定突触的强直刺激诱导LTP。我们记录来自Schaffer侧支投射与辐射层中CA1锥体神经元之间突触的场反应。我们的强直刺激采用θ节律爆发刺激，包括3组刺激串，每组间隔15秒。每组刺激串包含10个5 Hz的爆发，每个爆发包含5个100 Hz的脉冲。在完成寡聚化Aβ灌注后，立即施加强直刺激。</li>
	<li>强直刺激结束后，立即切换回正常记录液的灌注。在整个实验过程中，保持恒定的灌注速率、记录室温度以及充分的氧合状态。</li>
</ol>
代表性结果与可能遇到的问题
Aβ 按照 Stine 等人报道的经典方案进行寡聚化。1，生成Aβ单体以及多种不同大小的寡聚体（二聚体、三聚体等）。寡聚化Aβ的灌注1-42 导致经Aβ处理的脑片中LTP较对照组脑片降低。在本实验条件下，使用3-5月龄C57BL/6J雄性小鼠，经200 nM Aβ处理的脑片在强直刺激后两小时的LTP平均为基线值的150%，而对照组脑片的LTP平均为基线值的200-250%2。在某些情况下，Aβ处理可能未能降低海马LTP。可能出现的若干关键错误包括Aβ浓缩过程中薄膜过度干燥以及寡聚化不完全。由于Aβ肽在溶液中的理化特性易与塑料材料发生非特异性吸附，因此在海马脑片中进行Aβ灌流也可能存在问题。上述问题的解决方案将在下文讨论。

<ol><li>Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+conditions+for+amyloid-beta+peptide+oligomerization+and+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis.</a> J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).</li>
<li>Vitolo, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+-peptide+inhibition+of+the+PKA%2FCREB+pathway+and+long-term+potentiation%3A+reversibility+by+drugs+that+enhance+cAMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).</li>
<li>Puzzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picomolar+amyloid-beta+positively+modulates+synaptic+plasticity+and+memory+in+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus.</a> J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).</li>
<li>Lewczuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sample+collection+tubes+on+cerebrospinal+fluid+concentrations+of+tau+proteins+and+amyloid+beta+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides.</a> Clin Chem. 52, 332-334 (2006).</li>
<li>Masliah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+synaptic+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease.</a> Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).</li>
<li>Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+of+LTP+in+rat+hippocampus+in+vivo+by+beta-amyloid+precursor+protein+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments.</a> Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).</li>
<li>Itoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairments+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices+of+beta-amyloid-infused+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats.</a> Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).</li>
<li>Walsh, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+secreted+oligomers+of+amyloid+beta+protein+potently+inhibit+hippocampal+long-term+potentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo.</a> Nature. 416, 535-539 (2002).</li>
<li>Lambert, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nonfibrillar+ligands+derived+from+Abeta1-42+are+potent+central+nervous+system+neurotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).</li>
<li>Gong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+hydrolase+Uch-L1+rescues+beta-amyloid-induced+decreases+in+synaptic+function+and+contextual+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory.</a> Cell. 126, 775-788 (2006).</li>
<li>Trinchese, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calpains+improves+memory+and+synaptic+transmission+in+a+mouse+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease.</a> J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).</li>
</ol>

动物实验按照哥伦比亚大学动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指南和规定进行。

如上所述，寡聚化Aβ制备过程中的若干问题可能导致LTP未受损害。评估Aβ是否发生降解或未能成功寡聚化的一种方法是采用TRIS-Tricine PAGE/Western Blotting分析及分析型超速离心（本方案未描述）对Aβ样品进行检测。当Western Blotting样品在非变性、非还原条件下制备时，成功的Aβ制备应产生包含单体及不同寡聚体对应条带的Western Blotting特征图谱3一个常见问题是肽在SpeedVac浓缩仪干燥步骤中的不稳定性。事实上，高温干燥会导致蛋白质降解，表现为肽溶液明显变为棕色。HFIP溶液的浓缩必须在室温下进行，并密切监控。由于该实验方案包含多个操作步骤，稀释过程中的误差可能意外导致寡聚化效果不佳或Aβ浓度测定结果产生误导。有趣的是，若灌注的Aβ浓度低于建议值，则会导致LTP值升高。3灌流方式同样会影响Aβ处理脑片后的可能结果。事实上，在我们的电生理实验中，维持浴液温度恒定至关重要，因为已知在磷酸盐缓冲液中溶解时，温度会影响Aβ的构象。另一个值得关注的问题是，寡聚态Aβ可能非特异性地吸附于配制和灌流过程中所用容器及管路的塑料表面，从而降低实际作用于海马脑...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946; 1-42（冻干粉）</td><td>American Peptide</td><td>62-0-80</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP）</td><td>Fluka</td><td>52517</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Biotium, Inc.</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 聚丙烯离心管</td><td>Corning</td><td>05-538-67</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL MaxyClear 微量离心管（最大回收率）</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-150-L-C</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>GASTIGHT 注射器，250 &amp;mu;L</td><td>Hamilton Co</td><td>1725</td><td></td></tr><tr><td>水浴超声仪</td><td>Branson</td><td>3510</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac 浓缩系统</td><td>Various</td><td>SC 110A</td><td></td></tr></tbody></table>

制备寡聚态β-淀粉样蛋白1-42并诱导海马脑片突触可塑性损伤

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

突触连接的损伤可能是阿尔茨海默病（AD）早期出现轻微遗忘性改变的基础。β-淀粉样蛋白（Aβ）是一种在AD中大量产生的多肽，已知其可降低长时程增强（LTP），而LTP是学习与记忆的细胞学基础。事实上，由Aβ引起的LTP损伤是研究AD模型中突触功能障碍以及筛选能够缓解或逆转此类突触损伤药物的有效实验范式。研究表明，Aβ主要通过其寡聚体形式导致LTP的破坏。本文提供了一种详细的实验方案，通过将合成的Aβ1-42寡聚体肽灌注至急性海马脑片上，以诱导LTP损伤。在本视频中，我们概述了制备寡聚化Aβ的逐步操作流程。1-42。然后，我们追踪一个单独的实验，在该实验中，暴露于寡聚化 Aβ 的海马脑片中的长时程增强（LTP）受到抑制1-42与对照组实验中未添加 Aβ 的切片相比1-42暴露已经发生。

阿尔茨海默病的一个特征是Aβ1-42肽水平升高。本文提供了一种合成Aβ1-42寡聚体的实验方案，该寡聚体可损害海马区的长时程增强作用（Long-Term Potentiation），而后者是记忆的细胞学基础。该方法可用于研究Aβ诱导的病理机制以及药物筛选。

突触连接的损伤可能是阿尔茨海默病（AD）早期阶段出现的轻微遗忘性改变的基础。

合成的β-淀粉样蛋白1-42首先用HFIP溶解，以使多肽去聚集化，随后浓缩形成薄膜，用于寡聚化。将该薄膜用DMSO重新溶解，再用磷酸盐缓冲液稀释，并过夜孵育。最后，将寡聚态多肽用记录缓冲液稀释，灌流至急性海马脑片上，以评估β-淀粉样蛋白对突触可塑性的影响。欢迎来到纽约市哥伦比亚大学Avio Orio的实验室。大家好，今天我们将向您展示一种我们已优化的制备全长度β-淀粉样蛋白（Li Rise beta amyloid）的实验方法，该方法基于Stein及其同事于2003年首次提出的一项实验方案。在本实验室中，我们采用该方法研究β-淀粉样蛋白诱导的突触功能障碍。现在开始操作。将冻干的β-淀粉样蛋白粉末小瓶置于室温下30分钟，以避免在通风橱中打开时产生冷凝。打开小瓶后，加入冰冻的HFIP，使β-淀粉样蛋白的终浓度为1毫摩尔。盖上瓶盖，涡旋混匀，使用 Hamilton 注射器迅速将溶液等量分装至三个低吸附聚丙烯微量离心管中。盖上管盖，在室温下孵育两小时，使多肽充分混合。打开管盖，将离心管置于真空浓缩仪中以浓缩溶液。在真空条件下以 800 ×g 离心约 15 分钟。确保温度不超过25摄氏度，以避免蛋白质降解。当观察到管底形成清晰的干燥肽膜时，离心步骤即完成。肽膜可能难以观察，将管子密封后，在通风橱中将未使用的分装样品于-80摄氏度保存，最长可保存六个月。用DMSO重悬肽膜，使其终浓度为5毫摩尔，并在水浴中超声处理10分钟。为确保多肽完全重悬，将5毫摩尔的β-淀粉样蛋白溶液以1.6微升的等分试样储存于-20摄氏度。每个等分试样仅可在实验前一天解冻一次：取一份5毫摩尔的β-淀粉样蛋白溶液等分试样，加入98.4微升无菌磷酸盐缓冲液，终体积为100微升，涡旋振荡30秒，随后在4摄氏度孵育12小时。为启动配体化过程，在开始实验前将新鲜的海马组织裂解液孵育90分钟。在标准记录缓冲液中，将刺激电极置于Shafer's collaterals，记录电极置于stratum radiatum。找到反应并稳定基线10分钟后，将全部l-β-淀粉样蛋白稀释至200纳摩尔。由于β-淀粉样蛋白在记录缓冲液中会非特异性结合玻璃，因此应尽可能使用塑料器皿。将β-淀粉样蛋白溶液灌注到脑片上持续20分钟。在您选定的时间点施加刺激，例如，在强直刺激后立即给予theta脉冲刺激，随后切换回正常记录液进行灌注。在强直刺激后至少监测记录两小时，以确认长时程增强（LTP）的诱导效果，并观察β-淀粉样蛋白处理的作用。我们刚刚展示了如何制备寡聚化β-淀粉样蛋白1-42，用于在海马脑片上诱导突触可塑性损伤。进行此操作时，需注意肽膜过度干燥可能导致复溶不完全。使用塑料器皿处理β-淀粉样蛋白溶液也至关重要，以防止非特异性肽段结合。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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神经科学

低聚β-淀粉样蛋白的制备 1-42和突触可塑性损伤诱导海马脑片

本文概述了制备大鼠和转基因小鼠海马脑片的实验步骤，用于研究与脑衰老及年龄相关性神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）相关的突触改变。...

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本文介绍了一种完整的方法，用于制备和保存 体外...

海马体小鼠脑片的改良制备与保存方法以实现长期增强作用的非常稳定且可重复的记录

本文介绍了一种用于诱导神经元稳态可塑性的方案改良方法，以研究星形胶质细胞G蛋白偶联受体的可塑性。该方法近期已被用于检测幼年小鼠星形胶质细胞I型代谢型谷氨酸受体（mGluRs）的变化，也可应用于测量成年小鼠组织中多种星形胶质细胞GPCR的表达上调或下调，可在原位（in situ）和在体（in...

通过调控神经元放电频率诱导星形胶质细胞受体的可塑性

此处介绍一种直接立体定位脑内灌注淀粉样蛋白β的实验方案。该方法提供了一种替代性策略 体内 用于研究淀粉样蛋白-beta...

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在小型循环灌流浸没式切片记录系统中记录急性海马脑片的突触可塑性

本实验方案旨在通过评估空间记忆障碍、神经元病理学改变、神经元内淀粉样β蛋白（Aβ）沉积以及神经纤维缠结的聚集情况，建立一种模拟大鼠阿尔茨海默病的模型。该模型通过联合注射Aβ25-35、三氯化铝及重组人转化生长因子-β1诱导而成。...

通过脑室内注射复合β-淀粉样蛋白建立大鼠阿尔茨海默病动物模型的有效模拟方法

关键词：阿尔茨海默病，动物模型，大鼠，脑室内注射，β-淀粉样蛋白，Aβ，神经退行性疾病，认知功能障碍，病理模拟

我们提出一种方法，该方法能够 为神经退行性变早期事件提供进一步见解，并基于已建立的 离体 脑技术，结合了以下优势 体内 和 体外...

使用替代方法研究神经退行性变早期事件 离体 大鼠脑切片

本方案描述了如何从合成肽制备Aβ寡聚体 体外...

A11阳性β-淀粉样蛋白寡聚体的制备及点印迹分析鉴定

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