制备寡聚态β-淀粉样蛋白_1-42并诱导海马脑片突触可塑性损伤

合成的β-淀粉样蛋白1-42首先用HFIP溶解，以使多肽去聚集化，随后浓缩形成薄膜，用于寡聚化。将该薄膜用DMSO重新溶解，再用磷酸盐缓冲液稀释，并过夜孵育。最后，将寡聚态多肽用记录缓冲液稀释，灌流至急性海马脑片上，以评估β-淀粉样蛋白对突触可塑性的影响。

欢迎来到纽约市哥伦比亚大学Avio Orio的实验室。大家好，今天我们将向您展示一种我们已优化的制备全长度β-淀粉样蛋白（Li Rise beta amyloid）的实验方法，该方法基于Stein及其同事于2003年首次提出的一项实验方案。在本实验室中，我们采用该方法研究β-淀粉样蛋白诱导的突触功能障碍。

现在开始操作。将冻干的β-淀粉样蛋白粉末小瓶置于室温下30分钟，以避免在通风橱中打开时产生冷凝。打开小瓶后，加入冰冻的HFIP，使β-淀粉样蛋白的终浓度为1毫摩尔。

盖上瓶盖，涡旋混匀，使用 Hamilton 注射器迅速将溶液等量分装至三个低吸附聚丙烯微量离心管中。盖上管盖，在室温下孵育两小时，使多肽充分混合。打开管盖，将离心管置于真空浓缩仪中以浓缩溶液。在真空条件下以 800 ×g 离心约 15 分钟。

确保温度不超过25摄氏度，以避免蛋白质降解。当观察到管底形成清晰的干燥肽膜时，离心步骤即完成。肽膜可能难以观察，将管子密封后，在通风橱中将未使用的分装样品于-80摄氏度保存，最长可保存六个月。用DMSO重悬肽膜，使其终浓度为5毫摩尔，并在水浴中超声处理10分钟。

为确保多肽完全重悬，将5毫摩尔的β-淀粉样蛋白溶液以1.6微升的等分试样储存于-20摄氏度。每个等分试样仅可在实验前一天解冻一次：取一份5毫摩尔的β-淀粉样蛋白溶液等分试样，加入98.4微升无菌磷酸盐缓冲液，终体积为100微升，涡旋振荡30秒，随后在4摄氏度孵育12小时。为启动配体化过程，在开始实验前将新鲜的海马组织裂解液孵育90分钟。

在标准记录缓冲液中，将刺激电极置于Shafer's collaterals，记录电极置于stratum radiatum。找到反应并稳定基线10分钟后，将全部l-β-淀粉样蛋白稀释至200纳摩尔。由于β-淀粉样蛋白在记录缓冲液中会非特异性结合玻璃，因此应尽可能使用塑料器皿。

将β-淀粉样蛋白溶液灌注到脑片上持续20分钟。在您选定的时间点施加刺激，例如，在强直刺激后立即给予theta脉冲刺激，随后切换回正常记录液进行灌注。

在强直刺激后至少监测记录两小时，以确认长时程增强（LTP）的诱导效果，并观察β-淀粉样蛋白处理的作用。我们刚刚展示了如何制备寡聚化β-淀粉样蛋白1-42，用于在海马脑片上诱导突触可塑性损伤。进行此操作时，需注意肽膜过度干燥可能导致复溶不完全。

使用塑料器皿处理β-淀粉样蛋白溶液也至关重要，以防止非特异性肽段结合。感谢观看，祝您的实验顺利成功。