活体斑马鱼胚胎中的双光子诱导光激活

以下实验的总体目标是在活体斑马鱼胚胎中以单细胞分辨率光激活特定的光响应试剂，例如化学封闭型荧光染料。该目标通过将光响应试剂注入表达活体遗传标记的单细胞期胚胎来实现，从而定位并精确靶向任何目标细胞。第二步是将胚胎培养后固定于低熔点琼脂糖中，以固定活体胚胎。

接下来，使用双光子显微镜定位可见荧光转基因标记。随后在目标焦平面激活光响应试剂，并监测光激活的范围。之后可在胚胎发育的后续阶段追踪被标记细胞的命运。

该方法可用于在活体样本中以单细胞分辨率激活多种化合物。与共聚焦显微镜或闪光灯等现有技术相比，该技术的主要优势在于，能够在轴向几微米的较深组织层面实现光激活，同时光毒性相对较低。但本文所述方法用于硒化边缘示踪，也可应用于多种组分的光激活，从而实现对发育和生理过程的靶向调控。在注射前一晚，准备交配用鱼缸，将表达可见荧光标记的转基因品系斑马鱼的雄鱼和雌鱼分开饲养。

在本实验中，转基因品系在神经发生相关 N one 启动子的调控下表达 GFP，将 5% 与葡聚糖偶联的笼锁型荧光素 aliquot 置于含 0.2 摩尔氯化钾的冰上，用 0.2 摩尔氯化钾将笼锁型荧光素稀释至终浓度为 1%。将荧光素置于冰上并避光保存。让斑马鱼杂交对进行交配，在受精卵产出后立即收集，并按照文中所述方法冲洗。使用塑料移液器在解剖显微镜下将单细胞期胚胎转移至已覆盖新鲜 E three 培养基的 1% aros 注射板中。

使用移液器将胚胎在注射槽中定向。折断已拉制成细长锥形的毛细注射针的针尖。使用微量加样器吸头从针尾注入约 1 µL 的 1% 笼锁型荧光素（caged fluorescein）。

将装有试剂的针头放入连接至气动显微注射仪的显微操作器中。每个胚胎直接向细胞质内注射 2 至 3 纳升的笼状荧光素。每次实验至少注射 50 个胚胎。

将注射后的胚胎转移至含有新鲜E3培养基的培养皿中，在28.5°C避光条件下孵育至所需发育阶段。在24小时时加入0.1%苯硫脲以抑制胚胎色素形成，为胚胎封片做准备。当琼脂糖凝固后，用新鲜E2培养基在解剖显微镜下将15至20个60毫米培养皿涂覆一层薄薄的1%琼脂糖。随后向培养皿中加入E2培养基。

使用锋利的镊子将注射后的胚胎转移至包被好的培养板上。避免将胚胎暴露于空气中。在水中保存一份2%低熔点琼脂糖溶液备用。

在72摄氏度的加热块中。使用火焰抛光的巴斯德吸管，将一个包被的胚胎连同约150微升培养基转移至60毫米的培养皿中。在胚胎旁放置等体积的2%琼脂糖，迅速混合两滴液体，以获得均一的1%琼脂糖液滴。

将胚胎调整至背侧朝向物镜。待琼脂糖凝固后，将包埋的胚胎浸入 E2 培养基中。将新制备的胚胎置于配备宽带可调谐激光器的双光子显微镜下的载物台支架上。

在开始光激活过程之前，使用860纳米波长和空间，从表达组织最腹侧至最背侧获取一系列图像，图像在Z轴方向上每隔六微米采集一层。选择目标Z平面进行光激活，并以GFP作为标记物将其调至焦点。

定位目标区域。在860纳米处采集单张图像，并将其保留在单独的窗口中以进行准确对齐。在打开编辑漂白菜单之前，必须确保720纳米的激光器处于锁模状态。

使用在860纳米波长下拍摄的图像来定义光激活的兴趣区域（ROI）。在“编辑漂白”窗口中，调整相对激光功率、迭代次数和扫描速度。进行光激活时，在激光停止后按下“漂白”按钮，然后切换回860纳米波长，采集单层图像以评估光激活后物质的强度。

采集图像堆栈以评估激活区域的z轴范围或厚度。通过这种方法，可以经验性地确定激光强度和曝光持续时间。为实现每个克隆或交叉光激活的最佳效果，请激活实验中剩余的所有胚胎。

在这些条件下，将固定好的光激活胚胎置于含有0.1%苯硫脲的E2培养基中，在28.5摄氏度避光培养，直至达到所需的发育阶段。在解剖显微镜下，使用尖头解剖刀在靠近固定胚胎的aro区域切出一个V形切口，切口底部朝向胚胎头部。将一对闭合的镊子置于切口的顶点处。

轻轻打开镊子，沿胚胎长度方向分离卵膜，将胚胎释放到培养基中。每释放一个胚胎后，使用经火焰抛光的巴斯德移液管将其收集至微量离心管中。在化学通风橱内，用4%甲醛固定胚胎三小时。

在室温下，按照随附文本所述，进行脱水、复水以及碱性磷酸酶偶联的抗荧光素染色，并完成所有相关洗涤步骤。向胚胎中加入500微升过滤后的Fast Red染色液，在室温避光条件下孵育，每隔一小时更换新鲜的Fast Red染色液，直至达到理想的信号与背景比。

用 PBST 洗涤三次，每次五分钟，以终止染色反应。在通风橱中，用 4% 甲醛固定染色样本 20 分钟。再用 PBST 洗涤两次，每次五分钟。

将透明的胚胎依次通过 PBS 中 25%、50% 和 75% 的甘油梯度洗涤，直至每个胚胎沉降至管底。将胚胎于 4°C 保存，待显微镜观察时取出。为观察而封片时，使用 1 毫升注射器在载玻片上以 15 毫米见方的四个角位置各施加 20 微升透明硅脂，共四滴。

将胚胎置于约 200 微升的 75% 甘油中，甘油位于两滴油脂之间。将盖玻片覆盖在胚胎上。轻轻垂直下压盖玻片，直至甘油溶液充满间隙。

将油脂滴间固定的胚胎置于4摄氏度条件下，可在共聚焦显微镜观察前保存数天。该图像显示了一个在neurogen启动子调控下表达GFP的活体斑马鱼胚胎，该胚胎在单细胞期通过前述方法注射了笼锁型荧光素示踪染料，并在三至五体节期进行观察。

通过双光子激光对原始脑部四个区域中的一个离散区域进行光激活，可检测到解笼荧光素示踪染料。光激活程序完成后，将胚胎在28.5摄氏度下孵育，并在受精后24小时通过抗荧光素免疫染色（红色）追踪含有解笼荧光素的脑细胞。请注意标记细胞数量较少。一旦掌握该光激活技术，操作可在数小时内完成。在尝试该程序时，重要的是要记住控制最佳参数，以实现单细胞分辨率下的精确光激活。