Name: 测量50％的溶血性补充（CH 50）活性的血清 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-29T18:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 了解CH50溶血补体活性测定方法，通过绵羊红细胞和倍比稀释血清样本评估免疫功能。该技术为免疫学研究提供可靠的补体系统活性定量分析手段。

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作者感谢Lora Matthews女士进行该技术操作，以及Paul Shepherd先生负责摄影工作。本项目由南澳大利亚大学实验室医学项目资助。

5倍维罗纳尔缓冲盐水（VBS）的制备
<ol>
	<li>为配制巴比妥缓冲盐溶液（VBS），需分别配制三种不同的溶液。</li>
	<li>配制溶液1：将21.25 g NaCl和0.94 g戊巴比妥钠溶解于350 ml蒸馏水中，NaCl和戊巴比妥钠的终浓度分别为1.02 M和13 mM。</li>
	<li>配制溶液2：将1.44 g巴比妥溶解于125 ml热蒸馏水中，巴比妥的终浓度为62.5 mM。</li>
	<li>配制溶液3：将20.33 g MgCl2和4.41 g CaCl2溶解于100 ml蒸馏水中，MgCl2和CaCl2的终浓度分别为2.18 M和440 mM。</li>
	<li>将溶液1和溶液2混合，并冷却至室温。</li>
	<li>待混合溶液冷却后，加入1.25 ml溶液3，并用1 M HCl调节pH至7.3–7.5。</li>
	<li>用蒸馏水定容至500 ml，得到5×储存液。</li>
	<li>配制1×工作液时，将储存液按1:5比例用蒸馏水稀释。</li>
</ol>
羊红细胞与溶血素的致敏
<ol>
	<li>首先用 VBS 将溶血素按 1:50 比例稀释，以制备溶血素溶液</li>
	<li>向 4 ml 绵羊红细胞（SRBC）中加入 6 ml VBS，并通过倒置轻轻混匀</li>
	<li>以 600g 离心 5 分钟</li>
	<li>弃去上清液，并将细胞再洗涤 2 次</li>
	<li>最后一次洗涤后，以 900g 离心 5 分钟，使细胞充分沉淀</li>
	<li>弃去上清液，加入足量 VBS 重悬细胞，制备成 10% 的细胞悬液，即 0.5 ml 压积细胞重悬于 5 ml 缓冲液中</li>
	<li>在持续旋涡搅拌下，逐滴加入与细胞体积相等的溶血素（兔抗绵羊红细胞抗体）</li>
	<li>在 30°C 水浴中孵育 30 分钟</li>
	<li>每 15 分钟轻轻混匀细胞一次</li>
	<li>致敏后的 SRBC 可在 4°C 下保存过夜</li>
</ol>
CH50 测定
<ol>
	<li>将一系列试管分别以 1:8、1:16、1:32、1:64 和 1:128 的比例进行双份标记。</li>
	<li>在 VBS 中对对照血清和待测血清分别进行双份的两倍系列稀释。</li>
	<li>从 1:4 开始（100 µL 血清 + 300 µL VBS），将 200 µL 样品转移至下一个已标记的试管中。</li>
	<li>每次稀释后充分混匀，并使用新的移液器吸头将 200 µL 转移至下一稀释管中。</li>
	<li>重复此步骤，直至完成全部五个稀释度。</li>
	<li>从最终的 1:128 稀释管中弃去 200 µL。</li>
	<li>向所有试管中各加入 200 µL 悬浮的致敏 SRBC。</li>
 <li>另标记两支独立试管为 空白（BLANK），并加入 200 µL 致敏 SRBC 和 200 µL VBS。这些试管用于测定 SRBC 在 VBS 中的自发溶血。</li>
 <li>再标记另外两支独立试管为 完全溶血（TOTAL LYSIS），并加入 200 µL 致敏 SRBC 和 200 µL 蒸馏水。</li>
	<li>轻轻混匀所有试管。</li>
	<li>在 37°C 水浴中孵育 30 分钟，于 15 分钟时轻轻混匀一次。</li>
	<li>以 1,500 ×g 离心 5 分钟，使红细胞沉淀。</li>
	<li>将每支试管中的 100 µL 上清液转移至 96 孔平底板的各个孔中。</li>
	<li>向每个孔中加入 100 µL 蒸馏水。</li>
	<li>使用酶标仪在 540 nm 波长下读取样品的吸光度。</li>
</ol>
计算
<ol>
	<li>计算每个样本的平均吸光度</li>
	<li>从所有样本中减去空白对照吸光度（自发性裂解）</li>
	<li>使用以下公式计算每个稀释度的裂解百分比： <img src="/files/ftp_upload/1923/1923eq1.jpg" alt="裂解百分比计算公式，OD值，分光光度分析方法，方程图示" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程"></li>
	<li>以裂解百分比为纵轴，血清稀释倍数为横轴作图。</li>
	<li>计算对照血清和待测血清达到50%溶血所需的稀释倍数（图2）。</li>
</ol>
代表性结果：
视频中包含代表性结果的示例。实际操作中，需同时运行对照血清与待测血清，并以相同方式处理。下表（表1）为一份待测血清样本的示例数据。该数据根据5.3节中给出的公式进行计算处理。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>样品</td>
 <td>OD540</td>
 <td>平均值</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>空白</td>
 <td>0.042, 0.044</td>
 <td>0.043</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>完全裂解</td>
 <td>0.183, 0.183</td>
 <td>0.183</td>
 <td> </td>
 <td> </td> 
 </tr>
 <tr>
 	<td colspan="5"> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>稀释倍数</td>
 <td>OD540</td>
 <td>平均值</td>
 <td>平均值-空白</td>
 <td>裂解率%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1:8</td>
 <td>0.200, 0.219</td>
 <td>0.210</td>
 <td>0.168</td>
 <td>116</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1:16</td>
 <td>0.179, 0.173</td>
 <td>0.176</td>
 <td>0.134</td>
 <td>93</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1:32</td>
 <td>0.134, 0.110</td>
 <td>0.122</td>
 <td>0.08</td>
 <td>55</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1:64</td>
 <td>0.053, 0.066</td>
 <td>0.059</td>
 <td>0.017</td>
 <td>12</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1:128</td>
 <td>0.044, 0.045</td>
 <td>0.045</td>
 <td>0.003</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<img src="/files/ftp_upload/1923/1923fig1.jpg" alt="经典途径示意图；抗原-抗体反应；C1复合物激活；补体级联反应。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 经典补体途径的激活。 经典途径通过结合在靶细胞表面的免疫球蛋白M（IgM）或免疫球蛋白G（IgG）而被激活。抗体的Fc区结合C1q，激活C1r，进而激活另一个C1r分子，两者共同激活两个C1s分子。活化的C1s切割C4，暴露出C2的结合位点，C2也被切割。C4b与C2a结合形成一种称为C3转化酶的复合物。该复合物进一步切割C3，生成C3a和C3b，其中部分C3b与C3转化酶结合，形成C5转化酶。该复合物作用于C5，产生的C5b与C6结合，启动膜攻击复合物（MAC）的形成。C5b6作用于C7，继而作用于C8，并最终作用于C9，形成最终的MAC。（Goldsby et al, 2003）。
<img src="/files/ftp_upload/1923/1923fig2.jpg" alt="裂解实验结果；比较对照组与患者样本中稀释倍数与裂解百分比的折线图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 样品数据的绘图及对照与待测血清样本CH50的计算。 （A）对照（•）和待测（）血清样本的计算裂解百分比（%）随稀释倍数的变化曲线。（B）为计算50%裂解率，从50%处画一水平线与曲线相交，再从交点垂直向下画线至横轴稀释倍数。本示例中，对照血清需稀释35倍、待测血清需稀释21.6倍方可达到50%裂解。该结果表明，待测血清中的补体含量较对照血清低，因其在较低稀释倍数下即达到50%裂解。对照样本还显示 &gt; 1:8 稀释时溶血率为 100%。这很可能是因为蒸馏水对 SRBC 的溶血作用不完全，而补体成分的溶血作用更高效。

<ol><li>Goldsby, R. A., Kindt, T. J., Osborne, B. A., Kuby, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoldsby%2C+RA+%22Immunology%22">Immunology</a>. , W.H. Freeman. (2003).</li>
</ol>

CH50 测定法易受多种因素干扰。某些绵羊红细胞（SRBC）比其他细胞更脆弱，可发生与补体活性无关的自发性溶血。兔抗体的亲和力因批次和生产厂家不同而存在差异，这会影响结合到 SRBC 上的抗体数量。此外，用抗体致敏 SRBC 的过程会导致每个 SRBC 表面抗体包被量不均一。标本的采集与储存也是潜在误差的重要来源。补体成分（如 C1q、C3、C4 和 C5）极不稳定，因此正确的样本处理至关重要。长时间暴露于高温会降低补体活性，并产生补体成分的失活片段。为了尽可能检测出各种误差来源，每次进行测定时都必须使用已知 CH50 值的对照血清，并应重复验证该对照血清的已知值是否在可接受范围内。确定不同批次 SRBC 和溶血素之间是否存在差异的一种方法是：多次用新的试验材料对一份标准血清样本进行检测，然后判断基础溶血水平或对照血清的 CH50 值是否发生改变。

<table><tbody><tr><td>绵羊红细胞</td><td>CSL</td><td>2490201</td><td>终浓度使用1%</td></tr><tr><td>血清</td><td></td><td></td><td>人血清</td></tr><tr><td>兔抗绵羊溶血性血清（红细胞），未结合</td><td>AbD Serotec</td><td>C12HSB</td><td></td></tr><tr><td>96孔平底板</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>巴比妥缓冲盐水</td><td></td><td></td><td>终浓度使用1x</td></tr><tr><td>水浴箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C 培养箱/孵育器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

测定血清50%溶血补体（ch50）活性

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

补体系统是一组蛋白质，激活后可导致靶细胞裂解，并通过调理作用促进吞噬作用。虽然可以定量各个补体成分，但这并不能提供有关通路活性的任何信息。CH50是用于检测经典补体途径激活的筛选实验（图1），该实验对途径中任何组分的减少、缺失和/或失活均具有敏感性。CH50检测血清补体经典途径组分裂解预先包被兔抗羊红细胞抗体（溶血素）的羊红细胞（SRBC）的功能能力。当抗体包被的SRBC与待测血清孵育时，补体的经典途径被激活，从而导致溶血。如果某一补体组分缺失，则CH50水平将为零；如果经典途径的一个或多个组分减少，则 CH50将会降低。向每种血清稀释液中加入固定体积的最适致敏绵羊红细胞（SRBC）。孵育后，将混合物离心，并通过在540 nm处测定上清液中释放的血红蛋白吸光度来量化溶血程度。通过检测不同稀释度待测血清裂解抗体包被SRBC的能力，确定补体活性水平。本视频概述了分析经典补体途径补体活性水平所涉及的实验步骤。

经典途径由抗体激活，最终导致靶细胞裂解。CH50 测定法用于评估血清样本的补体活性。本视频演示了测定血清样本 CH50 值的实验步骤、相关计算及结果解读。

测定血清50%溶血补体（CH50）活性

补体系统是一组蛋白质，激活后可导致靶细胞裂解，并通过调理作用促进吞噬作用。单个……

测定血清中50%溶血补体CH 50活性。您需要一个可精确加样200微升的移液器和一个可加样1000微升的移液器、已置于冰上保存的待测血清、致敏的绵羊红细胞、维罗纳缓冲盐水和蒸馏水。准备用于检测的试管、对照试管以及用于基线和完全溶血的试管，涡旋混合器，以及一个96孔平底板。对试管逐一标记，并注明对照组和最终稀释度。本实验中，起始稀释度为1:8。继续进行两倍稀释，得到1:16、1:32、1:64和1:128的稀释度，分别标记剩余的试管为空白对照和完全裂解。所有试管标记完毕后，即可开始稀释待测血清。首先将300 µL R缓冲盐溶液转移至一支新试管中。现在将100微升血清转移至300微升R缓冲盐溶液中。这将得到1:4的起始稀释度。确保血清样本充分混匀。现在将 200 微升的 roal 缓冲盐溶液转移至先前已标记的试管中。同时，向另外两个空白试管中各加入 200 微升 roal 缓冲盐溶液，共计裂解试管。加入 200 微升蒸馏水，而非 Verona 缓冲盐溶液。现在将200微升稀释四倍的血清转移至标记为“1:8”的试管中。此前，我们已将200微升缓冲盐水加入标记为“1:8”至“1:1024”的系列试管中。这样即可得到1:8的稀释液。充分混匀样品，然后取 200 微升加入标记为 1 比 16 的试管中。依次操作，直至完成整组试管的稀释。从 1 比 128 稀释的试管中弃去 200 微升，使最终体积保持为 200 微升。致敏的绵羊红细胞可能随时间推移而沉淀，需通过轻轻翻转试管数次重新悬浮。充分重悬后，将200 µL致敏绵羊红细胞加入每支已准备好的试管中。确保血清与红细胞充分混匀。将致敏的羊红细胞加入空白管中，可用来判断自发性溶血；而将血液加入完全溶血管中，可用于确定100%溶血值。使用涡旋振荡器调至低速，轻轻混匀各管。随后将试管置于37摄氏度水浴中，孵育30分钟。孵育15分钟后，轻轻涡旋振荡各管，再次孵育15分钟。孵育结束后，将各管转移至预设为4°C的离心机中，在1500 ×g 条件下离心5分钟。离心完成后，小心取出各管并放入适当的试管架中。此时可见红细胞沉淀形成，而SNA呈红色。由于血红蛋白的释放，向96孔平底板中所需数量的孔内各加入100 µL蒸馏水。小心避免沉淀物转移，将100 µL上清液加入96孔板中相应的孔内。所有样品加入板中后，使用设定在540 nm波长的酶标仪读取吸光度。此处展示了两个重复样本的原始吸收数据，分别为 A1 和 B1，参考其 1:8 稀释倍数。接着是1:16、1:32、1:64和1:128的数据。A6和B6为空白对照，而A7和B7为完全裂解对照。数据收集完成后，需要计算每个重复样本的平均吸光度。然后从所有样本中减去空白吸光度值，即自发裂解值。当所有数据收集完毕后，可使用以下公式计算每个稀释度的裂解百分比。当所有数据计算完成后，以纵轴表示裂解百分比，横轴表示血清稀释倍数绘制曲线图。随后可利用该图计算引起50%致敏绵羊红细胞裂解所需的血清稀释度。该图显示了裂解百分比与血清稀释倍数的关系。然后可以从50%溶血处画一条线，直到与曲线相交。在曲线相交的位置，向下画一条垂直线至横轴。该数值代表血清的稀释倍数，即血清必须稀释至此倍数才能确保50%溶血。在比较两个血清样本时，为了确定CH50是否存在差异，可将产生50%溶血的稀释倍数用作一个衡量指标。

measuring-the-50-haemolytic-complement-ch50-activity-of-serum

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

测量50％的溶血性补充（CH 50）活性的血清

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通过补体耗竭去除特定细胞群体

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血液相容性测试，植入物，体外循环模型，血流动力学，溶血，血小板活化，凝血功能，白细胞反应，补体激活，血栓形成

本方法旨在通过与三位已知红细胞CR1密度的受试者进行比较，测定任意受试者红细胞中的CR1密度。该方法采用流式细胞术，通过与藻红蛋白（PE）偶联的抗CR1单克隆抗体对受试者的红细胞进行免疫染色后检测。...

使用流式细胞术测定红细胞补体受体1

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