测定血清50%溶血补体（CH₅₀）活性

测定血清中50%溶血补体CH 50活性。您需要一个可精确加样200微升的移液器和一个可加样1000微升的移液器、已置于冰上保存的待测血清、致敏的绵羊红细胞、维罗纳缓冲盐水和蒸馏水。准备用于检测的试管、对照试管以及用于基线和完全溶血的试管，涡旋混合器，以及一个96孔平底板。对试管逐一标记，并注明对照组和最终稀释度。本实验中，起始稀释度为1:8。

继续进行两倍稀释，得到1:16、1:32、1:64和1:128的稀释度，分别标记剩余的试管为空白对照和完全裂解。所有试管标记完毕后，即可开始稀释待测血清。首先将300 µL R缓冲盐溶液转移至一支新试管中。

现在将100微升血清转移至300微升R缓冲盐溶液中。这将得到1:4的起始稀释度。确保血清样本充分混匀。

现在将 200 微升的 roal 缓冲盐溶液转移至先前已标记的试管中。同时，向另外两个空白试管中各加入 200 微升 roal 缓冲盐溶液，共计裂解试管。加入 200 微升蒸馏水，而非 Verona 缓冲盐溶液。

现在将200微升稀释四倍的血清转移至标记为“1:8”的试管中。此前，我们已将200微升缓冲盐水加入标记为“1:8”至“1:1024”的系列试管中。这样即可得到1:8的稀释液。

充分混匀样品，然后取 200 微升加入标记为 1 比 16 的试管中。依次操作，直至完成整组试管的稀释。从 1 比 128 稀释的试管中弃去 200 微升，使最终体积保持为 200 微升。

致敏的绵羊红细胞可能随时间推移而沉淀，需通过轻轻翻转试管数次重新悬浮。充分重悬后，将200 µL致敏绵羊红细胞加入每支已准备好的试管中。

确保血清与红细胞充分混匀。将致敏的羊红细胞加入空白管中，可用来判断自发性溶血；而将血液加入完全溶血管中，可用于确定100%溶血值。使用涡旋振荡器调至低速，轻轻混匀各管。随后将试管置于37摄氏度水浴中，孵育30分钟。

孵育15分钟后，轻轻涡旋振荡各管，再次孵育15分钟。孵育结束后，将各管转移至预设为4°C的离心机中，在1500 ×g 条件下离心5分钟。离心完成后，小心取出各管并放入适当的试管架中。此时可见红细胞沉淀形成，而SNA呈红色。

由于血红蛋白的释放，向96孔平底板中所需数量的孔内各加入100 µL蒸馏水。小心避免沉淀物转移，将100 µL上清液加入96孔板中相应的孔内。所有样品加入板中后，使用设定在540 nm波长的酶标仪读取吸光度。

此处展示了两个重复样本的原始吸收数据，分别为 A1 和 B1，参考其 1:8 稀释倍数。

接着是1:16、1:32、1:64和1:128的数据。A6和B6为空白对照，而A7和B7为完全裂解对照。

数据收集完成后，需要计算每个重复样本的平均吸光度。然后从所有样本中减去空白吸光度值，即自发裂解值。当所有数据收集完毕后，可使用以下公式计算每个稀释度的裂解百分比。

当所有数据计算完成后，以纵轴表示裂解百分比，横轴表示血清稀释倍数绘制曲线图。随后可利用该图计算引起50%致敏绵羊红细胞裂解所需的血清稀释度。该图显示了裂解百分比与血清稀释倍数的关系。

然后可以从50%溶血处画一条线，直到与曲线相交。在曲线相交的位置，向下画一条垂直线至横轴。该数值代表血清的稀释倍数，即血清必须稀释至此倍数才能确保50%溶血。在比较两个血清样本时，为了确定CH50是否存在差异，可将产生50%溶血的稀释倍数用作一个衡量指标。